抗稻瘟病基因Pi9的STS连锁标记开发及在分子标记辅助育种中的应用

 利用带有广谱抗稻瘟病基因Pi9的籼稻品系75 1 127作为抗病基因供体亲本,用于扬稻6号和R6547抗病性的回交育种。通过比较75 1 127、扬稻6号和日本晴的Pi9基因位点的DNA序列,开发出了与Pi9基因紧密连锁的共显性STS（序列标记位点）标记PB9 1,用于Pi9基因的分子标记辅助选择。结合田间农艺性状选择和分子标记辅助选择,培育出8个Pi9基因纯合的回交后代株系。其中,具有扬稻6号和R6547遗传背景的株系各4个。经湖北恩施和宜昌的病圃鉴定,携带有抗病基因株系的稻瘟病抗性水平较受体品种扬稻6号和R6547有不同程度的提高。具有R6547遗传背景的株系08C893配制的杂交组合在上述病区的抗性表现也明显优于对照品种扬两优6号。上述结果说明,共显性标记PB9 1在Pi9抗稻瘟病基因分子标记辅助育种中具有应用价值,并且Pi9基因作为稻瘟病抗源之一可以在湖北稻区进行有效利用。     

分子标记辅助选择Pi9基因改良R288的稻瘟病抗性

根据已克隆的广谱持久抗瘟基因Pi9的DNA序列设计功能标记Clon2-1,通过分子标记辅助选择开展回交育种实践,定向改良水稻恢复系R288的稻瘟病抗性。获得如下结果:Clon2-1为共显性标记,在Pi9基因供体亲本75-1-127和受体亲本R288之间多态性明显且稳定;Clon2-1标记基因型对稻瘟病抗性表型的选择效率达100%。通过分子标记辅助选择和连续回交自交,获得了含Pi9基因的BC6F3群体,在此基础上筛选鉴定出1个高抗稻瘟病水稻新品系‘R288-Pi9’,用其与培矮64S配组获得的杂交组合同样表现出高水平稻瘟病抗性。     

水稻Pi9基因序列标记的开发及其抗瘟育种应用

利用广谱抗稻瘟病基因Pi9的3'UTR序列设计特异DNA标记pi9utr,通过分子标记辅助选择和连续回交育种实践,改良7份籼稻亲本(316B、金23B、R207、R228、R288、R389、明恢86)的稻瘟病抗性。结果表明:pi9utr是一个高效显性分子标记,除R207外,在其余6份受体亲本与Pi9供体亲本75-1-127间均存在明显而稳定的多态;在室内接种后的316B×75-1-127 BC4F1群体和R288×775-1-127 BC6F1群体中随机取样,进行稻瘟病抗性表型和基因型鉴定及Pi9基因表达分析,证明pi9utr对两个组合回交后代个体的抗病性辅助选择效率均为100%,且在所有抗病单株中均能检测到Pi9基因的高效表达,在所有感病单株中均没有检测到Pi9基因的表达。利用pi9utr在回交世代中的连续辅助选择,获得了3个组合的BC4F1及3个组合的BC6F2代群体,为选育抗稻瘟病新品种打下了基础。     

利用Pi9基因分子标记辅助选择培育抗稻瘟病水稻新品系

利用广谱持久抗瘟基因Pi9的内含子序列设计特异功能标记Ins2-1,通过分子标记辅助选择和连续回交育种,改良早籼稻1701的稻瘟病抗性。结果表明:Ins2-1是一个显性分子标记,在Pi9基因供体亲本75-1-127和受体亲本1701之间多态性明显且稳定;Ins2-1标记基因型对稻瘟病抗性表型的选择效率为100%;通过连续回交和自交,获得了含Pi9基因且遗传背景接近受体亲本的BC6F2群体;通过对BC6F3株系标记基因型和室内接种表型鉴定,筛选出了一个抗病纯系"抗瘟1701"。     

分子标记辅助选择改良杂交水稻Q优6号的稻瘟病抗性

为了提高长江中下游稻区大面积推广的中熟三系杂交中稻组合Q优6号的稻瘟病抗性,采用杂交、回交和分子标记辅助选择技术,将抗稻瘟病亲本材料75-1-127的广谱抗性基因Pi9渗入到Q优6号的父本R1005中,通过Pi9基因分子标记选择和综合农艺性状选择,育成了3个携带Pi9基因的株系CY11705-38、CY11707-6和CY11708-15,并与Q优6号的母本Q2A配制了3个组合。经主要农艺性状、产量、稻米品质分析和稻瘟病病区抗性鉴定,CY11705-38和CY11707-6的主要农艺性状、产量、稻米品质与R1005相似,稻瘟病抗性明显提高;组合Q2A/CY11705-38和Q2A/CY11707-6的主要农艺性状、产量、稻米品质与Q优6号相似,稻瘟病抗性也明显提高。认为以Q2A/CY11705-38或Q2A/CY11707-6替代Q优6号,可以在保持产量、生育期、稻米品质和主要农艺性状相似的基础上,明显提高稻瘟病抗性,降低生产风险。     

MAS育种改良籼稻恢复系R599及其杂交种的稻瘟病抗性

根据已克隆的广谱持久抗稻瘟病基因Pi9的启动子序列设计了特异显性DNA标记MS-1,通过分子标记辅助选择(MAS)技术,开展连续回交育种,定向改良籼稻恢复系R599及其杂交种的稻瘟病抗性。结果表明,Pi9基因供体亲本75-1-127与受体亲本R599对23份供试稻瘟菌菌株的抗性表现及抗菌谱差异显著,两亲本的抗性频率分别为91.3%和30.4%。分子标记MS-1在75-1-127与R599之间呈现明显且稳定的多态性,标记基因型对抗病性表型的辅助选择效率达100%。从BC6F3株系中选育出一个与R599遗传背景相似但高抗苗瘟和穗瘟的改良恢复系R599-Pi9,并用它配制出抗稻瘟病的两系杂交种Y两优599-Pi9。     

水稻广谱抗瘟基因Pigm紧密连锁分子标记开发及其育种应用

根据广谱抗瘟基因Pigm精细定位结果,筛选获得共显性InDel标记DG-3在Pigm基因供体亲本谷梅4号与9个籼稻受体亲本之间存在明显且稳定的多态性。在T98B×谷梅4号和R640×谷梅4号2个组合的BC1F1群体中随机取单株进行稻瘟病抗性表型及基因型分析,结果表明,无论是田间病圃鉴定,还是室内接种鉴定,分子标记DG-3对这2个组合回交群体的抗稻瘟病表型选择效率达95%以上,说明DG-3与Pigm基因紧密连锁。在此基础上,采用分子标记辅助选择与回交育种相结合的方法,利用DG-3在9个组合的回交群体中选择含有目的基因的单株分别与相应轮回亲本逐代回交,分别获得了9个组合的BC3F1群体,为进一步连续回交定向改良轮回亲本的稻瘟病抗性奠定了基础。     

分子标记辅助选择Pi9基因改良湘晚籼11号的稻瘟病抗性

以携带广谱持久抗稻瘟病基因Pi9的籼稻品系75-1-127为供体亲本,以优质常规晚稻湘晚籼11号为受体亲本及轮回亲本,利用Pi9基因内特异标记,在连续回交自交群体中开展分子标记辅助选择,定向改良湘晚籼11号的稻瘟病抗性。24份稻瘟菌菌株室内接种及田间病圃抗性鉴定结果表明,75-1-127和湘晚籼11号的抗菌谱差异显著,抗性频率分别为91.7%和29.2%,75-1-127高抗苗瘟和穗瘟,而湘晚籼11号高感苗瘟和穗瘟;鉴定出1个稳定高效的显性DNA标记Ins2-1,该标记引物从75-1-127基因组中扩增出1条532 bp的清晰条带,而在湘晚籼11号基因组中无扩增产物。利用Ins2-1开展标记辅助选择育种实践,从湘晚籼11号×75-1-127的BC_6F_3群体中鉴定出9个抗病改良系,为进一步培育优异抗病水稻新品种打下了基础。     

分子标记辅助选择改良三系杂交稻恢复系R225稻瘟病抗性

稻瘟病是水稻的主要病害,培育抗稻瘟病品种是防治稻瘟病的有效途径。本研究通过分子标记辅助选择与杂交育种相结合的方式,将稻瘟病抗性基因Pi1、Pi2和Pi9导入到三系杂交稻恢复系R225。对BC3F3代材料进行苗期和成熟期稻瘟病抗性鉴定,携带1个或2个抗性基因的目标株系抗性达到中抗以上水平,稻瘟病抗性显著高于各自的轮回亲本。SSR标记分析表明,改良株系的遗传背景回复率达到86.1%~95.3%。通过标记辅助选择获得的改良材料为三系杂交稻恢复系的培育提供了稻瘟病抗性亲本。     

具抗稻瘟病基因Pi25杂交稻恢复系的分子标记辅助选育

 从组合中156/谷梅2号所衍生的重组自交系群体中选择携带抗稻瘟病基因Pi25的3个株系,分别与高产恢复系9308和3 11配组,通过单粒传法获得的6个F6重组自交系群体用于研究。在Pi25先前定位的遗传图谱上,新增加与该基因紧密连锁的分子标记RM3330和A7,并结合RM3330和A7分子标记辅助选择的结果,共筛选到了109个Pi25基因纯合的株系。用现有的与恢复基因连锁的标记对这109个株系进行二次筛选,最终获得20个Pi25基因和恢复基因均纯合的株系。对育性恢复力鉴定试验表明,选育出的抗病恢复系具有较好的恢复能力,并已应用于育种实践;人工稻瘟病接种试验证实,所用标记不同,分子标记辅助选择的效率差异显著,单个标记辅助选择符合率均不高,而采用目标基因两侧连锁的标记同时进行辅助选择,则可以明显提高分子标记辅助选择符合率。     

广谱抗稻瘟病种质75-1-127的褐飞虱抗性基因鉴定及分子标记辅助选择育种

【目的】水稻品系75-1-127携带广谱抗稻瘟病基因Pi9,已被广泛应用于抗稻瘟病水稻品种改良。笔者育种实践发现75-1-127表现出较强的褐飞虱抗性,因此鉴定该品系中的褐飞虱抗性基因并进行分子辅助选择育种。【方法】根据水稻品系B5中褐飞虱抗性基因Bph14和Bph15的序列,设计引物扩增75-1-127的基因组DNA,并对PCR产物进行测序分析。采用苗期集团法鉴定了75-1-127和B5的褐飞虱抗性表型。利用与Bph14与Bph15连锁的分子标记筛查了75-1-127为稻瘟病抗源回交转育的两系不育系后代,并鉴定了这些后代的稻瘟病抗性、褐飞虱抗性和主要农艺性状。【结果】75-1-127中含有与B5完全一致的Bph14和Bph15序列。75-1-127和B5苗期褐飞虱抗性均为1级。在以75-1-127为抗源改良的两系不育系中,携带Bph14、Bph15的单基因系或双基因系的褐飞虱抗性均得以改良,其中双基因聚合系的死苗率为8.5%,与供体亲本75-1-127以及阳性对照B5差异不显著,进一步证实75-1-127含有褐飞虱抗性基因。【结论】水稻品系75-1-127携带褐飞虱抗性基因Bph14和Bph15,可以作为抗源应用于水稻褐飞虱抗性育种。     

Pathogenic and Genetic Diversity of Magneporthe oryzae Populations from Sri Lanka

The present study was undertaken to determine the pathogenic and the genetic diversity of the isolates of M.oryzae collected from the wet,intermediate and dry zones of Sri Lanka with a view to develop rice varieties conferring durable resistance to rice blast.No significant morphological or growth variations existed amongst the isolates studied.The genetic diversity of isolates determined by carrying out Pot2 transposable element based on repetitive-PCR revealed that the majority of isolates (92%) clustered into a single group with 45.4% similarity.The existence of nine pathotypes was identified by observing the reaction type of isolates on 16 different rice lines.Pathotype 1 which was distributed in all zones affected only one differential line.Pathotype 2 which was able to infect six lines was restricted only to the dry zone of Sri Lanka.Of the 16 rice lines,seven lines,K3 (Pik-h),C101A51 (Piz5),K1 (Pita),C105TTP2L9 (Pita),K59 (Pit),Shin (Pish) and WHD-1S-75-1-127 (Pi9) had highly effective blast resistance.None of the isolates of the fungus showed any virulence against the seven lines.These seven blast resistant lines can be used in the breeding programmes in Sri Lanka for development of lines conferring durable resistance to rice blast.     

利用CRISPR/Cas9系统定向改良水稻稻瘟病抗性

【目的】CRISPR/Cas9基因编辑技术是作物遗传改良的有效工具。本研究通过对水稻Pita、Pi21和ERF922稻瘟病相关基因进行定点编辑，以期获得能够稳定遗传的抗稻瘟病水稻材料。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，以Pita、Pi21和ERF922为靶基因，构建共编辑载体pC1300-2×35S::Cas9-gPita-gPi21-gERF922 ，用农杆菌转化长粒粳稻恢复系L1014，筛选获得稳定遗传的纯合突变体用于稻瘟病抗性鉴定。【结果】在T0代转基因株系中，Pita、Pi21和ERF922突变频率分别为75%、85%和65%，突变基因型多为双等位突变。筛选到的不含T-DNA成分的T1代能够稳定遗传给T2代，并从中获得Pi21单突变纯合株系及Pita、Pi21和ERF922的三突变纯合株系。稻瘟病抗性鉴定结果表明，与野生型相比，突变株系的抗性显著提高。同时，接种后纯合突变体株系内水杨酸、茉莉酸和乙烯等信号转导途径相关基因的表达量均上调。据此，我们推测纯合突变株系对稻瘟病的抗性增强可能与其对稻瘟病菌的响应被激活有关。【结论】利用CRISPR/Cas9技术获得了能够稳定遗传和具有较高稻瘟病抗性的纯合突变株系，为水稻稻瘟病抗性改良提供了良好的材料。     

利用CRISPR/Cas9系统定向改良水稻稻瘟病抗性

[目的]CRISPR/Cas9 基因编辑技术是作物遗传改良的有效工具。本研究通过对水稻Pita、Pi21和ERF922稻瘟病相关基因进行定点编辑,以期获得能够稳定遗传的抗稻瘟病水稻材料。[方法]利用 CRISPR/Cas9基因编辑技术,以 Pita、Pi21 和 ERF922 为靶基因,构建共编辑载体 pC1300-2×35S::Cas9-g^Pita-g^Pi21-g^ERF922 ,用农杆菌转化长粒粳稻恢复系L1014,筛选获得稳定遗传的纯合突变体用于稻瘟病抗性鉴定。[结果]在T0代转基因株系中,Pita、Pi21和ERF922 突变频率分别为 75%、85%和 65%,突变基因型多为双等位突变。筛选到的不含 T-DNA成分的T1代能够稳定遗传给T2代,并从中获得 Pi21单突变纯合株系及Pita、Pi21和ERF922的三突变纯合株系。稻瘟病抗性鉴定结果表明,与野生型相比,突变株系的抗性显著提高。同时,接种后纯合突变体株系内水杨酸、茉莉酸和乙烯等信号转导途径相关基因的表达量均上调。据此,我们推测纯合突变株系对稻瘟病的抗性增强可能与其对稻瘟病菌的响应被激活有关。[结论]利用 CRISPR/Cas9 技术获得了能够稳定遗传和具有较高稻瘟病抗性的纯合突变株系,为水稻稻瘟病抗性改良提供了良好的材料。     

Pigm特异性选择标记的开发及其在粳稻穗颈瘟抗性育种中的利用

【目的】Pigm是一个广谱的稻瘟病抗性基因,源自持久抗性品种谷梅4号,与Piz、Piz-t、Pi2、Pi9和Pi40等互为复等位基因但抗谱存在差异。为了更好地在分子辅助选择育种中利用Pigm基因,开发与Pigm特异性标记具有重要意义。【方法】在已有文献报道定位结果的基础上,通过随机测序获得了一段谷梅4号基因组的特异序列,并据此开发了一组用于筛选Pigm基因的分子标记,进一步选取江淮稻区3个不同生态型代表性粳稻品种作为受体,利用分子标记辅助选择结合对抗性基因的背景检测将Pigm基因导入受体品种。【结果】Pigm-4标记位于Pigm基因簇内部,与抗病功能元件PigmR紧密连锁,对不同类型的品种检测发现该标记特异性强,且利用该标记可将Pigm与Piz、Piz-t、Pi2、Pi9以及Pi40区分开来。对受体亲本稻瘟病抗性基因的检测和接种结果分析发现江淮稻区粳稻品种虽然携带了Pib、Pi54、Pita、Pb1中的2~3个基因,但是对强毒力的稻瘟病小种抗性普遍不强,而3种代表性粳稻背景下导入Pigm基因均可显著提高其对穗颈瘟的抗性水平。【结论】Pigm可以作为抗稻瘟病粳稻育种的有利基因资源加以利用,而Pigm-4是分子标记辅助筛选Pigm的优异标记。     

辽宁省粳稻品种稻瘟病抗性基因分析

【目的】为明确辽宁省260份粳稻品种中稻瘟病抗性基因的类型,评价抗性基因利用价值,为辽宁省水稻抗病育种提供参考。【方法】选用9个稻瘟病抗性基因的特异引物分析辽宁省已审定的260份粳稻品种抗性基因种类、基因组合类型及地域分布情况,基于抗病基因检测条带的有无进行品种聚类分析,苗期人工喷雾接种、分蘖盛期和蜡熟期田间自然发病调查,评价9个抗性单基因系的抗病性。【结果】辽宁省粳稻品种中含有抗性基因数量从0～7个不等,抗性基因Pikh检出率最高,其次是Pikm和Pi1;所有参试品种均未检测到Pi9基因,仅在辽宁省农业科学院育成的辽粳421中检测到Pi40基因。参试的水稻品种中共有62个基因组合类型。基于抗性基因检测结果进行聚类分析,可以将260份粳稻材料分为11个类群。9个抗性单基因系中,Pi40抗性最好;其次是Pi9、Pigm和Pita。【结论】抗性基因Pi40、Pi9、Pigm和Pita在辽宁省粳稻品种选育和生产上具有重要的应用潜力;参试品种的80.38%集中在第Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅸ类群,没有明显的地域差异;参试品种抗病基因组合类型不够丰富,亲缘关系较近。     

稻瘟病抗性基因对安徽省稻瘟病菌种群抗性的影响

为分析抗稻瘟病基因对安徽省稻瘟病菌株的抗性水平的影响,采用10个水稻抗稻瘟病单基因品系对安徽不同地区的稻瘟病菌株进行致病力测定,同时对201份水稻品种的抗稻瘟病基因Pi9进行扩增,结合田间抗性表现,分析抗性基因Pi9的利用价值。抗性基因Pi9、Pik、Pizt等对安徽地区的稻瘟病菌株具有较好的抗性,抗性频率分别为66%、60%和54%,其中携带Pi9抗性基因的水稻品种的田间抗性表现也较好,说明Pi9可直接作为分子标记辅助安徽地区水稻品种选育抗原基因。