牛乳头瘤病毒2型L1基因真核表达载体的构建及真核表达

为在真核细胞中表达牛乳头瘤病毒2型(BPV2)衣壳蛋白L1基因。采用PCR方法从奶牛皮肤肿瘤病料中扩增BPV2沙湾分离株L1基因,克隆入pMD18-T载体中,测序后进行序列分析。以pcDNA 3.1(+)为真核表达载体构建重组表达质粒,转染入BHK-21细胞,通过间接荧光免疫试验检测BPV2-L1蛋白的表达。本研究成功构建pcDNA3.1(+)-BPV2-L1重组真核表达质粒,证实能表达出BPV2-L1蛋白,为BPV2DNA疫苗的研发提供了前期基础。     

H9N2亚型禽流感病毒NS1蛋白原核表达载体的构建及表达

为对H9N2亚型禽流感病毒(AIVs)NS1基因进行原核表达,并对表达产物进行抗原性分析,根据NS1基因合成1对特异性引物,进行PCR扩增,将扩增片段连接至PMD18-T载体,通过序列测定和比对筛选出保真基因克隆;将保真基因克隆至pET32a表达载体,构建重组质粒pET32a-NS1后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中...     

重组抗LMP1单链抗体/鱼精蛋白截短体融合蛋白的基因构建及表达

目的体外拼装人抗EB病毒编码的潜伏膜蛋白1单链抗体(LMP1 scFv)/截断的鱼精蛋白截短体(truncatedprotamine,tP)融合基因,将其克隆至原核表达载体pET32a,并在大肠杆菌中诱导表达LMP1 scFv/tP融合蛋白。方法设计融合基因LMP1 scFv/tP,在LMP1 scFv/tP的5’和3’端设计EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点;在DNAWORKS程序指导下设计成22个相互互补的寡核苷酸序列,经PCR扩增获得融合基因LMP1 scFv/tP,再将目的基因片段亚克隆至pMD 18-Tsi mple载体中,经过酶切鉴定和测序验证。进一步将目的基因片段克隆至原核表达载体pET32a,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白并经SDS-PAGE和western blot验证。结果各寡核苷酸片段经PCR扩增后可见明确的产物带,将获得的LMP1 scFv/tP融合基因构建至原核表达载体pET32a,经IPTG诱导后成功表达目的蛋白。结论成功获得LMP1 scFv/tp融合基因,并在大肠杆菌中成功诱导表达LMP1 scFv/tP融合蛋白,为该融合蛋白用于LMP1相关肿瘤的基因治疗奠定基础。     

O型口蹄疫病毒VP1基因原核表达及蛋白纯化

以O型FMDV重组质粒pMD18T-O-VP1为模板,利用PCR技术扩增得到O型FMDV-VP1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET32a连接构建重组表达载体pEq32a-O-VP1,经PCR和测序鉴定后,用WIG诱导归1基因的表达,收集不同诱导时间的菌液,进行SDS-PAGE电泳,摸索掌握最佳诱导时间,切取最佳诱导时间电泳胶片做Westem-blotting,分析检验表达产物与其抗血清的反应性。结果显示,分子量约为45ku的蛋白条带反应显著,能被口蹄疫阳性血清识别,表明FMDV-VP1基因在大肠杆菌中得到高效表达,纯化复性的表达蛋白有望开发为诊断抗原和多肽疫苗。     

猪伪狂犬病病毒GZ-Z1株gE基因原核表达质粒的构建

为给猪伪狂犬病病毒的诊断及防治提供科学依据,参考GenBank中猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因序列,设计1对特异性引物,以PRV GZ-Z1株DNA为模板,进行gE基因的PCR扩增,扩增产物与pMD18-T载体连接、鉴定正确后,再亚克隆至pET32a(+)原核表达载体中,经鉴定后测序。结果表明:目的片段为PRV gE基因完整开放阅读框,大小1 734bp,编码577个氨基酸,在pET32a(+)载体中位置正确,表明,pET32a-gE原核表达质粒构建成功。该基因与国内外其他18株PRV的gE基因推导氨基酸序列同源性为94.8%～98.6%;与国外分离株属同一个进化分支,遗传关系相对较近;而与国内Fa、Min、GDSH等毒株亲缘关系较远。     

H9N2亚型禽流感病毒M1基因在大肠杆菌中的原核表达

采用RT-PCR技术扩增禽流感病毒M1基因,将M1结构基因克隆于pMD18-T载体.测序结果表明,插入的片段为M1目的基因.切下目的基因M1,重组到含有谷胱苷肽(GST)的融合蛋白原核表达载体pET-32a(+),获得的重组质粒经PCR、酶切以及序列分析鉴定表明,M1基因插入的位置、大小和读码框架均正确,证明成功构建融合表达载体pET-32a-M1.构建好的重组质粒经1 mmol/L IPTG诱导,在大肠杆菌BL21中得到大量表达,经过6h表达量达到高峰.融合蛋白M1的分子质量为29.8 ku,以包涵体形式存在.Western-Blot及ELISA分析表明,融合蛋白能够与M1单克隆抗体发生特异性反应,说明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性.     

PRRSV Hr-1/06株GP5蛋白基因的克隆及表达载体的构建

[目的]克隆PRRSV Hn-1/06株GP5蛋白基因并构建其原核表达载体.[方法]根据PRRSV美洲株ATCC-VR2332的ORF5基因序列设计特异性引物,用RT-PCR方法从Hn-1/06株中扩增得到GP5蛋白基因的片段,与PTG19-T载体连接获得其阳性克隆PTG19-T-ORF5.以该基因片段为模板分别设计ORF5完整序列和删除信号肽的ORF5序列两条引物,进行PCR扩增,将目的片段与原核表达载体pET32a连接,并对其进行酶切鉴定.[结果]扩增得到GP5蛋白基因全长序列603 bp,编码200个氨基酸残基;具有3个潜在的N-糖基化位点和9个半胱氨酸;分子量为22.4 kD,等电点为8.550;双酶切pET32a-ORF5鉴定.结果与预期一致,证实重组质粒构建成功.[结论]成功构建了PRRSV Hn-1/06株GP5蛋白基因的表达载体,为深入研究GP5蛋白的本质与功能及其致病性奠定基础.     

A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达纯化及活性检测

为获得具有活性的A型FMDV VP1蛋白,以A型vp1重组质粒pMD19T A vp1为模板,利用PCR扩增得到A型FMDV vp1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET28a连接,构建重组质粒pET A vp1。经IPTG诱导表达含重组质粒pET A vp1的E. coli BL21 (DE3) 菌后,SDS PAGE显示VP1蛋白以包涵体形式获得高效表达,蛋白分子质量约为29 ku。通过对IPTG浓度及诱导时间进行优化,结果表明,在37 ℃条件下,IPTG终浓度为0.3 mmol/L,诱导表达6 h后,VP1蛋白的表达量最大。Western Blot分析表明,VP1重组蛋白能够被A型口蹄疫阳性血清特异性识别。ELISA检测结果显示,VP1包涵体蛋白经洗涤纯化,尿素浓度梯度透析复性后具有较高的活性。     

口蹄疫病毒P1+2A基因真核表达载体的构建

通过RT-PCR方法获得了口蹄疫病毒O型,编号为OF3毒的P1+2A区的目的基因,并将其克隆到克隆载体pMD18-T上,再根据表达载体pQE-Trisystem的特性及酶切位点设计合适的表达引物.由表达引物通过PCR技术从克隆载体上扩增出带有特定酶切位点的目的片段,再对载体和目的片段进行酶切处理,处理后由T4 DNA连接酶将二者连接.通过PCR及酶切鉴定,结果证明口蹄疫病毒目的基因片段已被正确克隆到表达载体pQE-Trisystem上.     

棉花GhSP1L基因克隆与表达分析

[目的]棉花Spiral1-LIKE(SP1L)基因(GhSP1L)的克隆、功能序列分析及原核表达.[方法]通过RT-PCR从棉纤维中克隆GhSP1L基因,进行GhSP1L蛋白的功能结构域分析,构建原核表达载体pET28a-GhSP1L,进行蛋白体外诱导表达,SDS-PAGE分析蛋白的表达情况;RT-PCR检测GhSP1L基因的表达特征.[结果]从陆地棉纤维组织中克隆得到GhSP1L基因的全长cDNA,其开放读码框为318 bp,编码106个氨基酸的蛋白质,理论分子质量为11.76kDa.对氨基酸序列进行生物信息学分析,其N端和C端较为保守,含有SCOP结构域,属于SP1L家族蛋白,能够在其他微管蛋白协助下与微管结合,SPR1的定位可能与其结合的微管结合蛋白相关.构建了pET28a-GhSP1L原核表达载体,并通过体外诱导表达后获得分子质量约为12 kDa左右的重组蛋白GhSP1L;半定量RT-PCR结果表明,GhSP1L基因开花后3d的纤维组织中表达量较高.[结论]GhSP1L基因的克隆、序列分析和表达,重组蛋白的诱导表达,为深入研究该基因在棉纤维发育中的作用奠定了基础.     

犬瘟热病毒H基因原核表达质粒的构建

为H蛋白进一步表达作为诊断用抗原、建立特异的犬瘟热病毒(CDV)抗体检测方法及CDV的预防奠定基础,以已构建含有犬瘟热病毒H基因的pMD18-H质粒为模板,利用合成的特异性引物进行PCR扩增,得到1824bp的目的DNA片段,将所得H基因克隆至经相同双酶切处理后的pET32a(+)原核表达载体中,获得重组质粒pET32...     

家蚕核型多角体病毒IE1的多克隆抗体制备及鉴定

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)ie1 基因是BmNPVDNA复制的必需基因,其编码的IE1蛋白能够反式转录 激活杆状病毒早期基因的表达.为了进一步研究IE1蛋白在家蚕核型多角体病毒感染宿主过程中具体的功能,研究 通过PCR扩增BmNPVie1 基因片段,亚克隆到原核表达载体pET32,获得重组质粒pET32-IE1,经测序正确后, 转化至大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株.通过IPTG诱导融合蛋白原核表达后,初步纯化收集抗原,免疫新西兰大白 兔,制备IE1多克隆抗体.应用制备的免疫兔血清进行Western-blot分析,结果显示多克隆抗体能特异识别BmNPV 的IE1和IE0蛋白.免疫荧光结果同样显示IE1蛋白定位于宿主细胞核病毒复制中心.IE1抗体制备的成功为进 一步研究IE1在病毒感染家蚕中的作用机理奠定了基础.     

PRRSV Hn-1/06株GP5蛋白基因的克隆及表达载体的构建

[目的]克隆PRRSVHn-1/06株GP5蛋白基因并构建其原核表达载体。[方法]根据PRRSV美洲株ATCC-VR2332的ORF5基因序列设计特异性引物,用RT-PCR方法从Hn-1/06株中扩增得到GP5蛋白基因的片段,与PTG19-T载体连接获得其阳性克隆PTG19-T-ORF5。以该基因片段为模板分别设计ORF5完整序列和删除信号肽的ORF5序列两条引物,进行PCR扩增,将目的片段与原核表达载体pET32a连接,并对其进行酶切鉴定。[结果]扩增得到GP5蛋白基因全长序列603 bp,编码200个氨基酸残基;具有3个潜在的N-糖基化位点和9个半胱氨酸;分子量为22.4 kD,等电点为8.550;双酶切pET32a-ORF5鉴定,结果与预期一致,证实重组质粒构建成功。[结论]成功构建了PRRSVHn-1/06株GP5蛋白基因的表达载体,为深入研究GP5蛋白的本质与功能及其致病性奠定基础。     

猪细小病毒(PPV)SD1株NS1基因的克隆与原核表达

[目的]为建立猪细小病毒的快速诊断方法提供理论依据。[方法]根据GenBank上猪细小病毒基因组序列和原核表达质粒pET30a(+)多克隆位点序列设计1对引物,应用PCR技术扩增出猪细小病毒SD1株NS1基因全序列,对阳性重组质粒进行测序和同源性比较。构建原核表达重组质粒pET 30a/NS1,并在大肠杆菌中进行诱导表达。[结果]通过PCR扩增获得2 208 bp目的片段。所克隆NS1基因与已报道的PPV相应基因的核苷酸同源性为97.3%~99.4%,表明NS1基因具有高度保守性,但在偏3′端连续缺失12个碱基。所克隆的PPVNS1基因在原核细胞中成功表达,其表达产物主要以包涵体形式存在。[结论]SDS-PAGE检测结果表明PPVNS1蛋白的分子量为86 kD。     

建兰花叶病毒TGB1基因的原核表达及多克隆抗体制备

以GenBank中的CyMV-TGB1 (GenBank登录号:HQ681906.1)基因全序列设计1对特异性引物,采用RT-PCR从感染建兰花叶病毒的白花刺果曼陀罗叶片总RNA扩增出该病毒的TGB1基因.测序结果表明,该TGB1基因全长702 bp,编码233个氨基酸残基.构建了原核表达载体pET32a(+)-TGB1,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在25℃以1.0 mmol/L IPTG诱导表达重组蛋白基因.SDS-PAGE分析表明,重组蛋白分子量约为44 ku,与预测相符.以该重组蛋白为抗原免疫新西兰大白兔,制备的抗体效价达1:25 600.     

人组织型纤溶酶原激活剂原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的初步表达

目的:构建人组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator,tPA)原核表达载体,检测其在大肠杆菌Escherichia coli中的初步表达.方法:以含有人tPA基因的质粒为模板,设计引物扩增出含有RGDS-tPA基因并构建到原核表达载体pET28a中,测序证实为正确的rtPA序列,并将pET28a-tPA转化至菌株E.coli BL21(DE3).用IPTG诱导rtPA在E.coli中表达,并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行验证.结果:琼脂糖凝胶电泳获得目的基因片段tPA的条带约在1 700bp处,鉴定为阳性重组体;聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定获得目的蛋白片段rtPA的条带约53KDa,为非活性的包涵体.结论:人组织型纤溶酶原激活剂原核表达载体构建成功,可在大肠杆菌中有效表达.     

猪戊型肝炎病毒swCH189株衣壳蛋白基因CP239片段原核表达条件的优化

为了提高猪戊型肝炎病毒swCH189株衣壳蛋白基因CP239片段在大肠杆菌中的表达量,研究了载体、温度、转速、诱导时间以及诱导剂IPTG浓度等不同条件对衣壳蛋白基因CP239片段融合蛋白表达量的影响。结果表明,用LB培养基于37℃培养3.5 h后,采用终浓度为0.3 mmol/L的IPTG在37℃、200r/min诱导培养4 h,pET32a-CP239融合蛋白表达量最大;SDS-PAGE检测结果表明pET32a-CP239融合蛋白的分子质量与预期大小一致,约为45.3 ku;Western blotting结果表明,pET32a-CP239融合蛋白可以与抗-HEV阳性血清发生特异性反应,并具有良好的反应原性,说明衣壳蛋白基因CP239片段蛋白得到正确表达。     

新加坡石斑鱼虹彩病毒ORF39L基因克隆、表达及抗体的制备

为研究新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)核心基因ORF39L在病毒侵染过程中的作用,制备了SGIV ORF39L表达蛋白的抗体;通过生物信息学软件预测SGIV ORF39L的抗原表位基因,并以所选抗原表位基因片段39Ag1和39Ag2构建原核表达质粒pET32a-39Ag1和pET32a-39Ag2;将质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达融合蛋白pET32a-VP39Ag1和pET32a-VP39Ag2;用所得融合蛋白分别免疫小鼠,获得了高效特异抗体39Ab1和39Ab2;利用制备的抗体进行间接免疫荧光试验,结果显示,VP39参与了SGIV的装配。本研究结果为进一步研究ORF39L基因在SGIV感染过程中的作用机制提供了数据资料。     

鹦鹉幼雏病毒结构蛋白VP1基因的克隆及原核表达

采用湖北省云梦县患鹦鹉幼雏病死亡的虎皮鹦鹉体内分离得到的鹦鹉幼雏病毒(budgerigar fledgling disease virus，BFDV)，应用PCR方法获得BFDV主要结构蛋白基因(VP1)，克隆到pMD18-T载体，构建重组质粒pMD18T-VP1并进行测序，结果显示，结构蛋白基因(VP1)与BFDV欧美分离株的同源性为96％～99％，表明VP1是BFDV保守基因；将VP1亚克隆到原核表达载体pET32( )b，构建重组质粒pET32( )b-VP1，转化菌株BL21(DE3)，诱导表达，经SDS-PAGE和Westem-blot分析，克隆在his-tag下游的结构蛋白基因获得了高效融合表达，表达的融合蛋白分子量约为55 kD。为建立快速、灵敏的鹦鹉幼雏病毒血清学检测方法以及研制基因工程疫苗提供了科学依据。