马流行性感冒病毒的分离和鉴定

马流行性感冒(简称马流感)是由病毒引起的以发热和呼吸道卡他为主要特征的急性传染病。近年来,世界许多国家有发生马流感的报导。Jacguet A等(1987)报导,法国1979、1983、1985年马流感大流行,分离到流感病毒。Nerome K报导(1987)由美国、巴西、日本、英国、罗马尼亚、瑞典、瑞士等国获得17株马流感病毒株。Uppal·P·K等报导(1987)印度1987年1月发生马流感,经病毒分离证实为A/马—2型流感病毒。据殷震等(1987)资料,马甲1型流感发生于瑞     

犬脂肪干细胞的分离培养与鉴定

为了研究脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells,ASCs)体外培养方法及其生物学特性,将ASCs应用于小动物临床治疗,本试验用犬进行了脂肪干细胞的分离、培养和鉴定。犬脂肪干细胞(Canine adipose-derived stem cells,cASCs)体外培养生长良好,呈细长梭形。第3代(P3)细胞诱导2周后,成脂诱导组经油红O染色可见细胞内脂滴积累;成骨诱导组经碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase,AKP)及VonKossa染色,AKP、钙结节均呈阳性表达。第3代至第5代(P3^P5)细胞流式细胞检测结果显示,所分离细胞稳定高表达间充质干细胞(MesenchymalStem Cells,MSCs)标志CD29、CD44、CD90(>90%),不表达造血细胞标志CD45(<2%)。培养结果显示,从犬镰状韧带和皮下脂肪均可分离出cASCs。cASCs取材方便,易于体外培养,多次传代及冻存对cASCs的生物学性质无明显影响。eASCs有望成为国内动物医学临床研究和治疗的重要干细胞来源。     

甲2型马流感病毒的分离和鉴定

1989年3月中旬,吉林省的镇赉、扶余等十几个市县相继暴发了与马流感相似的疾病。采集了20份急性病马的鼻腔分泌物通过鸡胚分离出8株病毒,用已知标准马流感阳性血清与之做血凝抑制试验,确诊为甲_2型马流感病毒,和毒株A/Equi-2/迈阿密/63一致。用所分离的毒株A/Equi-2/吉牧站/89—1”和甲_2型标准马流感毒株为抗原,以血凝抑制试验分别检查了疫区34份马血清,均获得一致结果。二种抗原的阳性符合率为100%。急性期和恢复期病马血清的抗体滴度增长4倍以上。进一步证实此次流行的是由马甲_2型流感病毒引起的马流行性感冒。     

胎儿肝干细胞的分离培养与鉴定

从人胎儿肝脏中分离、纯化肝干细胞并进行鉴定。采用改进Seglen胶原酶原位灌注消化,结合Percoll密度梯度离心分离纯化胎儿肝干细胞,计数并测定细胞活性,光镜、电镜对其形态进行观察,用免疫细胞化学法(ICC)检测细胞表面标志表达情况。结果表明,所分离细胞活性率为90.80%±2.04%,细胞平均为(2.74±0.77)×107个/肝(n=10),光镜、电镜下观察其具有肝干细胞形态及超微结构特点,ICC染色,AFP、CK19、CK8及CD34等呈阳性,原代培养可形成肝干细胞集落。研究结果为人胎儿肝干细胞的存在提供了直接依据。     

家畜胚胎干细胞的分离培养和鉴定

家畜胚胎干细胞的分离培养和鉴定工作对于研究和利用家畜胚胎干细胞具有重大意义。本文对文献中报道的各种分离、培养和鉴定方法进行了综述 ,并介绍了几种主要家畜的胚胎干细胞在近十余年间的研究进展情况。     

马脂肪间充质干细胞的分离培养与生物学特性试验

为马的关节炎、肌腱和韧带损伤的临床治疗提供种子细胞,本试验通过采集马颈部脂肪组织,采用Ⅰ型胶原酶消化法分离脂肪间充质干细胞,并进行传代培养;绘制细胞生长曲线、测定细胞群体倍增时间;通过流式细胞术检测P3代细胞表面标记物,RT-PCR法扩增细胞表面标记物目的基因片段;油红O和茜素红染色法测定脂肪间充质干细胞的成脂和成骨诱导分化能力。结果发现:马脂肪间充质干细胞体外培养条件下呈长梭形和典型的旋涡状,生长状态良好、折光性强;经测定细胞生长曲线呈典型的S型,符合Logistic生长曲线规律;P3、P6和P9代细胞群体倍增时间分别为21.5 h、26 h、36 h;流式细胞术检测结果显示,P3代细胞高表达间充质干细胞表面标志物CD44、CD90和CD105,不表达造血系细胞表面标志物CD45;PCR扩增得到CD44、CD90、CD105和CD73特异性目的片段;油红O和茜素红染色证明,马脂肪间充质干细胞具有成脂和成骨诱导分化能力。     

马链球菌马亚种的分离鉴定及fneB基因序列分析

新疆伊犁某地区一些马群中不断出现以全身多发性脓肿为特征的患病马匹,为了查明其是否为马腺疫,以及由何种马链球菌感染所致,无菌采集典型患病马匹脓汁样品,常规THB增菌,绵羊鲜血平板划线分离单菌落后,用透射电镜对分离菌的微观形态进行观察,PCR对其fneB基因进行克隆与序列分析,最后用生化试验进行验证。结果表明,从12匹患病马的脓肿组织中,共采集了25份样品,从中分离鉴定出来源于不同患病马的2株马链球菌马亚种菌株,这2株菌的形态均符合链球菌的特点;基因克隆测序结果表明,其中1株与英国源的兽疫亚种H70和马亚种4047核苷酸同源性较高,均达97%~98%,另1株与英国源的马亚种4047和瑞典源某马亚种核苷酸同源性较高,均达98%~99%。这2株菌之间核苷酸序列同源性达98.3%,氨基酸同源性则达99.3%。马链球菌马亚种是引起伊犁某地区这些患马全身多发性脓肿的主要致病菌,它们可能来源于之前从欧洲和美洲引进的马匹,提示在进行疫病防控工作时,要特别注意海关检疫,积极防止疫病的传入。     

青海毛驴马腺疫病原菌的分离鉴定

从发生腺疫的青海毛驴中采集样品进行染色镜检、分离纯化、PCR鉴定,并对纯化后的菌株进行药敏试验。研究结果表明:美兰染色结果观察到长链状球菌; 5%绵羊血平板培养出现透明的露珠样小菌落,且呈现β型溶血; PCR鉴定为马链球菌马亚种;药敏试验表明马链球菌马亚种对β内酰胺类抗生素敏感。     

牦牛支气管上皮细胞的分离培养与鉴定

为了分离培养牦牛支气管黏膜上皮细胞并传代培养,利用支气管结扎灌注酶冷消化法和支气管组织贴壁法分离培养牦牛支气管黏膜上皮细胞并传代培养,第二代细胞制作细胞爬片通过H.E.染色,扫描电镜和免疫荧光分别对培养的上皮细胞的形态结构进行鉴定,结果两种方法都获得了牦牛支气管黏膜上皮细胞,细胞活性好,纯度高;H.E.染色可见细胞形态呈梭形、圆形、多角形等,细胞核深染,细胞质淡红色;扫描电子显微镜检测中,明显可见细胞的纤毛;免疫荧光鉴定细胞核清晰可见,细胞核呈亮绿色,表明分离培养的细胞为上皮细胞,可进一步为牦牛支气管黏膜上皮细胞粘附模型的建立提供材料和奠定技术基础。     

奶牛乳腺上皮细胞的克隆与特性分析

用组织块接种法分离培养奶牛乳腺上皮细胞,进行形态学观察、生长曲线的绘制和核型分析等生物学性状的检测,并进行酪蛋白基因的RT-PCR鉴定。结果显示,体外培养的奶牛乳腺上皮细胞生长旺盛,具有典型的上皮细胞形态特征;染色体数目为60;能够正常表达奶牛乳腺上皮细胞的2种特异性酪蛋白基因,即as1-酪蛋白基因和β-酪蛋白基因。表明成功获得了奶牛乳腺上皮细胞克隆。     

奶牛子宫内膜上皮细胞和间质细胞的分离、培养及鉴定

为了分离培养奶牛子宫内膜上皮细胞和间质细胞,给建立奶牛子宫内膜体外模型提供条件,研究采用胰蛋白酶和胶原酶消化法分离细胞,随后传代培养纯化细胞,并通过光镜观察和免疫细胞化学染色对其进行鉴别.结果表明:0.3%胰蛋白酶消化组织块1 h后可得到上皮细胞,纯度＞80%;上皮细胞呈多边型,核大而圆,具有细胞角蛋白免疫反应性.用0.1%胶原酶Ⅱ继续消化2 h,可得到间质细胞,纯度＞90%;间质细胞贴壁后可见梭形和多角形两种形态,免疫细胞化学染色显示这两种细胞均具有波形蛋白免疫反应性,而细胞角蛋白无免疫反应性,提示它们为来源于内膜基质的基质细胞,说明采用酶消化法能够成功地培养奶牛子宫内膜间质细胞和上皮细胞.     

Isolation and characterization of equine amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells

Recent studies have shown that mesenchymal stem cells (MSCs) are able to differentiate into multi-lineage cells such as adipocytes, chondroblasts, and osteoblasts. Amniotic membrane from whole placenta is a good source of stem cells in humans. This membrane can potentially be used for wound healing and corneal surface reconstruction. Moreover, it can be easily obtained after delivery and is usually discarded as classified waste. In the present study, we successfully isolated and characterized equine amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells (eAM-MSCs) that were cultured and maintained in low glucose Dulbecco''s modified Eagle''s medium. The proliferation of eAM-MSCs was measured based on the cumulative population doubling level (CPDL). Immunophenotyping of eAM-MSCs by flow cytometry showed that the major population was of mesenchymal origin. To confirm differentiation potential, a multi-lineage differentiation assay was conducted. We found that under appropriate conditions, eAM-MSCs are capable of multi-lineage differentiation. Our results indicated that eAM-MSCs may be a good source of stem cells, making them potentially useful for veterinary regenerative medicine and cell-based therapy.     

牛乳腺上皮细胞的分离培养

为了对牛乳腺上皮细胞(MECs)进行分离、培养和鉴定,并研究细胞分泌功能,试验通过胶原酶消化法分离得到了牛乳腺上皮细胞,采用传代法对细胞进行纯化,对细胞标志蛋白进行免疫荧光染色鉴定,通过体外诱导和RT-PCR分析鉴定细胞的分泌功能。结果表明:分离到的牛乳腺上皮细胞具有典型乳腺上皮细胞的形态特征,表达广谱角蛋白,经诱导后可分泌β-酪蛋白。     

猪卵巢颗粒细胞分离培养及鉴定

为构建猪卵巢颗粒细胞的体外培养体系,研究毒素的生殖毒性奠定基础,采用机械分离法从1～5 mm的卵泡中提取猪卵巢颗粒细胞,苔盼蓝染色计算细胞存活率,Giemsa染色和结晶紫染色观察细胞形态,免疫细胞化学染色方法检测促卵泡刺激素受体(FSHR)表达来鉴定颗粒细胞,MTT方法测定细胞生长曲线.结果显示分离提取的猪卵巢颗粒细胞存活率为65%左右,细胞纯度＞97%,细胞结构完整,边缘分明,胞核呈卵圆形位于靠近胞质的中央.另外细胞生长曲线表明,细胞从24 h开始进入对数生长期,并于96 h达到最高密度,之后进入平台期.分离培养的颗粒细胞生长状态良好,且细胞纯度＞97%,是理想的适合进行毒素生殖毒理学的细胞培养体系.     

荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞的分离培养

目的：建立荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法。方法：采用组织块种植法培养奶牛乳腺上皮细胞,利用胰蛋白酶差时消化法分离、纯化上皮细胞。结果：成功培养出奶牛乳腺上皮细胞,显微镜下观察,纯化的乳腺上皮细胞呈典型上皮细胞形态,细胞之间排列紧密,呈鹅卵石铺路样,形态均一,多角形的单层聚集。通过荧光免疫细胞染色方法对细胞骨架蛋白-角蛋白18进行鉴定,呈现阳性反应。乳腺上皮细胞增殖旺盛,经25次以上传代后长势仍然良好。结论：采用组织块种植法结合胰酶差时消化法成功获得纯化的奶牛乳腺上皮细胞。     

羊驼毛囊干细胞分离、培养与鉴定

采用0.2%中性蛋白酶Ⅱ和0.25%胰酶∶0.02%EDTA(1∶1)两步酶消化法从羊驼背部皮肤分离得到羊驼毛囊干细胞。用无血清角质细胞培养基(K-SFM)培养进行形态学观察、细胞生长曲线克隆形成率及免疫组化染色检测。结果显示,细胞生长曲线表明,不同代次毛囊干细胞接种前3d生长缓慢,4⁶d进入倍增期,有无限增殖的趋势,所分离的羊驼毛囊干细胞具备毛囊干细胞特征(体积小、立体感强),呈现未分化特征;CK19、CK15、β1-integrin和CD34免疫组化染色阳性;第3、5、7、9代克隆形成率分别为(32.7±2.27)%、(47.0±3.46)%、(46.3±3.18)%和(43.3±3.76)%。结果表明,用两步酶消化法成功分离获得羊驼毛囊干细胞,无血清角质细胞培养基(K-SFM)可使羊驼毛囊干细胞体外维持未分化状态并传代至12代。     

Isolation and monolayer culture of bovine oviduct epithelial cells

Oviduct epithelia obtained from 32 cows were cultured. The oviducts were classified into follicular and luteal phases and divided into ampulla and isthmus regions. The epithelial cells were dissociated by enzyme digestion and cultured in plastic dishes with Dulbecco's modified Eagle's medium/Ham's F12 (1:1) containing 10% calf serum. After enzyme treatment, the epithelial suspension showed free ciliated and non-ciliated cells, and cell mass. The non-ciliated cells contained secretory granules in the cytoplasm. The cell mass was composed of ciliated and secretory cells. The cell mass adhered to the dish within 12-24 hr, while the free ciliated cells attached on Day 2 of the culture. The cells grew into confluent monolayers on Day 4. The cell monolayers contained ciliated and non-ciliated cells. The monolayered non-ciliated cells showed a few secretory granules. When the cells were further cultured without subculturing, ciliary activity diminished on Day 5 and was rarely detected on Day 9. When the cells were subcultured on Day 3, ciliary movement was detected on the monolayers for only 2 days. Cell mass that did not adhere to the dish and remained floating in the medium formed ball-like structures on Day 2. Active ciliary beating was observed on the cells that were cultured in the medium supplemented with 10(-5) and 10(-9) M estradiol-17 beta, however, the ciliary activity diminished on Day 5. No difference in the cell growth was observed between the follicular and luteal phases or between the ampulla and isthmus regions.