鸡痘病毒282E4株Bam HI部分片段的重组载体质粒构建与序列分析

在中国鸡痘病毒２８２Ｅ４弱毒株基因组部分ＢａｍＨＩ片段的质粒ｐＵＢ、ｐＵＣ、ｐＵＤ、ｐＵＤ２、ｐＵＥ和ｐＵＦ酶切分析的基础上,对ｐＵＦ进行了亚克隆获得ｐＵＦ－Ｅ和ｐＫＳ－Ｘ,对最可能存在非必需区的ｐＵＥ质粒进行了序列分析,改造了含Ｐ１１Ｐ７．５－ＬａｃＺ报告基因盒,并在上述质粒的相应单一酶切位点插入Ｐ１１Ｐ７．５－ＬａｃＺ报告基因盒,构建成ｐＵＢ１、ｐＵＦＣ１、ｐＵＦＥ１、ｐＵＦ－Ｅ１和ｐＫＳＦ－Ｘ１５个重组载体质粒。体内重组等工作正在进行中。     

鸡痘病毒282E4弱毒株TK基因限制性酶切图谱分析

以限制性内切酶ＢａｍＨＩ、Ｘｂａｌ、Ｃｌａｌ、Ｈ１ｎｄⅢ、Ｎｃａｌ对含有鸡痘病毒（ＦＰＶ）２８２Ｅ４弱毒株３．７ｋｂＨｉｎｄⅢＴＫ基因片段的重组质粒ｐＳＬ１进行单酶和它们之间双酶酶切。结果表明：３．７ｋｂＨｉｎｄⅢＴＫ基因片段上有２个Ｃｌａｌ切点，２个Ｘｂａｌ切点，１个Ｎｃａｌ切点，没有ＢａｍＨＩ切点。随后，用澳大利亚ＦＰＶ２．２ｋｂＨｉｎｄⅢ＋ＣｌａｌＴＫ基因作探针，对各种酶切片段进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，进一步确定ＴＫ基因位于２．２ｋｂＨｉｎｄⅢ＋Ｃｌａｌ片段中。杂交结果与限制性酶切图谱分析结果相一致。该基因的限制性酶切图谱与澳大利亚ＦＰＶ疫苗株的基本相同。     

减蛋综合征病毒基因组HindⅢ酶切片段的克隆及酶谱分析

以ＰＵＣ１９质粒为载体,采用鸟枪法克隆减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）基因组的ＨｉｎｄⅢ酶切片段,用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－ｄＵＴＰ标记的ＥＤＳＶＨｉｎｇⅢ片段探针打点杂交,证实１３个克隆插入了ＥＤＳＶＤＮＡ的ＨｉｎｄⅢ片段。酶切分析结果表明,克隆到了Ａ、Ｂ、Ｆ、ＧＨ、Ｉ、Ｊ７个不同大小的片段,选取上述插入片段的、具有代表性的７个相应质粒ＰＵＨＡ、ＰＵＨＢ、ＰＵＨＦ、ＰＵＨＧ、ＰＵＨＨ、ＰＵＨＩ、ＰＵＨ     

鸡痘病毒复制非必需区的筛选及酶切分析

本实验对鸡痘病毒２８２Ｅ４株基因组ＰｓｔⅠＨｉｎｄⅢ或ＢａｍＨⅠ片段进行了克隆、鉴定，并对部分克隆进行酶切分析，在此基础上对其中６个克隆插入Ｐ１１Ｐ７．５－ＬａｃＺ报告基因盒，构建了含报告基因的重组质粒。用其中的三个重组质粒以磷酸钙法共转染鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ），其中有２个产生了蓝色空斑．经三次空斑纯化能稳定产生子代病毒．证明所使用ｐＦＢ１７６和ｐＦＨ１３３为病毒复制非必需片段，分别是２．９ｋｂＢａｍＨⅠ片段和４．７ｋｂ的ＨｉｎｄⅢ片段，并绘出了它们的物理图谱．     

马立克氏病病毒糖蛋白B基因克隆及其在家蚕细胞中的表达

将马立克氏病病毒（ＭＤＶ）ＧＡ株基因文库中的ＢａｍＨＩＩ３和Ｋ３克隆质粒分别用双酶切消化，获得２．８ｋｂ的ＢａｍＨＩ－ＳａｌⅠ片段和１．１ｋｂ的ＢａｍＨＩ－ＥｃｏＲＩ片段，然后将这２个片段定向克隆于载体ｐＵＲ２２２中，构建了含ＭＤＶ糖蛋白Ｂ（ｇＢ）基因的重组质粒。为了基因操作方便和高效表达，设计了１对带有酶切位点的引物，用ＰＣＲ扩增了ＭＤＶｇＢ基因部分片段，并按正确方向插入去磷酸化的载体质粒中，得到起始密码子前带有ＥｃｏＲＩ酶切位点的ＭＤＶｇＢ基因克隆，再将该基因插入去磷酸化的家蚕核型多角体病毒（ＢｍＮＰＶ）转移载体ｐＢＦ１４中，ＤＮＡ序列分析确证了克隆基因及阅读柜架的正确性。以重组转移载体与野生型ＢｍＮＰＶ共转染家蚕细胞，用有限稀释法点杂交结合空斑技术纯化重组病毒。用荧光抗体试验检查重组病毒感染的家蚕细胞，可见感染细胞的胞浆及胞膜出现强荧光反应     

新城疫病毒融合蛋白裂解位点基因的分离克隆及在原核细胞中的表达

用ＳＰＦ鸡胚繁殖新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４６Ｅ９株（强毒）、ＬａＳｏｔａＥ４株（弱毒），对病毒进行纯化，抽提ＲＮＡ。用１对均为２７个碱基的引物进行ＲＴ－ＰＣＲ，扩增出了２个毒株的融合蛋白裂解位点（Ｆｃ）基因。将Ｆｃ基因定向克隆入ｐＵＣ１８的ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ位点之间，获得２个毒株Ｆｃ基因克隆ｐＵＣＦ４６Ｆｃ和ｐＵＣＬａＦｃ，用ＥｃｏＲＩ／ＳａｌⅠ双酶切法、ＰｓｔⅠ单酶切法、ＰＣＲ法和核酸探针法对其进行了鉴定。将鉴定好的ＬａＳｏｔａＥ４Ｆｃ基因定向导入表达载体质粒ｐＢＶ２２１，获得重组子ｐＢＶＬａＦｃ。ＰＣＲ和内切酶酶切法鉴定表明，Ｆｃ插入的位置和方向都正确无误。用Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α通过热诱导法进行了表达。用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ法检测了表达产物。结果表明，有１条能够与ＮＤＶ多抗反应的特异条带，分子量约１５７００，与预期大小一致，说明是Ｆｃ基因的表达产物     

鸡痘病毒282E_4株基因7．3kbBamHI非必需片段酶谱分析和鉴定

鸡痘病毒２８２Ｅ＿４株基因７．３ｋｂＢａｍＨＩ非必需片段酶谱分析和鉴定顾万钧，金宁一，周复春，毛春生，殷震（农牧大学军事兽医研究所长春１３００６２）鸡痘病毒（ＦＰＶ）基因组长达３００ｋｂ，其中存在着广泛的非必需区，可以重组插入几个或多个外源基因，适于...     

PCR结合分子杂交法检测鸡传染性支气管炎病毒

利用逆转录－ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）特异性扩增鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）基因组中Ｍ基因和Ｎ基因之间一段核酸片段。以ｐＵＣ１９质粒载体将此片段克隆，用ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切此重组质粒，回收克隆片段后，制成生物素标记的核酸探针。用ＲＴ－ＰＣＲ及生物素核酸探针法分别对ＩＢＶ，ＩＢＤＶ，ＩＬＴＶ，ＭＤＶ及ＮＤＶ进行检测，结果证明该方法为ＩＢＶ特异性检测方法。对人工感染ＩＢＶ的ＳＰＦ鸡口腔棉拭样品进行跟踪检测，证明本方法能在ＳＰＦ鸡接毒后１～１０ｄ内检出ＩＢＶ。     

鸡产蛋下降综合征病毒NE4株DNA的EcoRI＋BamHI部分酶切片段的克隆

用ＳＤＳ－蛋白酶Ｋ消化ＥＤＳＶ抗原－抗体复合物、酚－氯仿抽提ＤＮＡ,得到了完整的ＥＤＳＶ基因组ＤＮＡ（约３３ｋｂ）,用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ＋ＢａｍＨＩ双酶切,得到７个片段,分别回收各片段,与双酶切线性化的ＰＵＣ１９载体质粒连接,转化Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α,成功地克隆了其中的５个片段。     

新城疫病毒融合蛋白裂解位点基因光敏生物素探针的制备及初步应用

将重组质粒ｐＵＣＬａＦｃ和ｐＵＣＦ４６Ｆｃ用ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ酶切,回收新城疫病毒融合蛋白裂解位点（Ｆｃ）基因,将此Ｆｃ片段用光敏生物素标记,制备出Ｆｃ探针。该探针能够与新城疫病毒（ＮＤＶ）的强毒株Ｆ４６Ｅ９、中毒株Ｍ株和弱毒株ＬａＳｏｔａＥ４株杂交,而不与对照的传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）、减蛋综合征（ＥＤＳ－７６）病毒杂交,说明探针是特异的。用ｐＵＣＬａＦｃ的Ｆｃ探针检测了各５份ＮＤＶ强中弱毒株的尿囊液,均为阳性。但强毒株和弱毒株的Ｆｃ探针都能与所用的强、中、弱毒株杂交,说明该Ｆｃ探针尚不能区分强、弱毒株。     

新城疫病毒融合蛋白裂解位点基因的分离克隆及在原核细胞中的…

用ＳＰＦ鸡胚繁殖新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４６Ｅ９株（强毒）、ＬａＳｏｔａＥ４株（弱毒）、对病毒进行纯一提ＲＮＡ。用１对均为２７个碱基的引物进行ＲＴ－ＰＣＲ，扩增出了２个毒株的融合蛋白裂解位点（Ｆｃ）基因。将Ｆｃ基因定向克隆人ｐＵＣＬａＦｃ，用ＥｃｏＲＩ／Ｓａｌ Ｉ双酶切法、ＰｓｔＩ单酶切法、ＰＣＲ法和核酸探针法对其进行了鉴定。将鉴定好的ＬａＳｏｔａＥ４Ｆｃ基因定向导入表达载体质粒ｐＢＶ２２１，ａｑｔ     

NDV小片段多肽F14a的融合表达和应用研究

将对应ＮＤＶ强毒株Ｆ基因裂解位点附近编码１４个多肽的双链寡核苷酸片段克隆到融合表达载体ｐＧＥＭＥＸ－１,构建重组质粒ＤＧＥＭＦ１４ａ并转化大肠杆菌ＤＥ３。将ＧＥＭＦ１４ａ／ＤＥ３的融合表达产物免疫兔,制备抗多肽抗体。该抗体与ＤＮＶ强毒株Ｆ４８Ｅ９呈ＥＬＩＳＡ强阳性反应,Ｐ／Ｎ〉３．５￣７．０,百与弱毒ＮＤＶ的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ系呈阴性反应,Ｐ／Ｎ〈２．０,证明制备的Ｆ１４ａ抗多肽抗体是特异的,中用于强     

鸡痘病毒282E4株Bam HI Fa,Fb,Fc片段非必需区筛选与序列分析

将亚克隆获得的分别含有鸡痘病毒（ Ｆ Ｐ Ｖ） Ｂａｍ Ｈ Ｉ相应片段的 ｐ Ｕ Ｆａ、ｐ Ｕ Ｆｃ 和 ｐ Ｕ Ｆｄ ３ 个质粒的单酶切位点,插入 Ｐ１１ Ｐ７．５ Ｌａｃ Ｚ报告基因盒,构建成 ｐ Ｕ Ｆａ１、ｐ Ｕ Ｆｃ１ 和 ｐ Ｕ Ｆｄ１ ３ 个重组载体质粒,在脂质体存在条件下,同 Ｆ Ｐ Ｖ 共同转染鸡胚成纤维细胞（ Ｃ Ｅ Ｆ）,９６ ｈ 后在 Ｘｇａ１ 存在条件下挑选蓝色重组病毒空斑,经３ 次空斑纯化和传代,获得 １ 株可稳定表达 β半乳糖苷酶的重组病毒,并对该重组用质粒作了序列分析。     

弓形虫主要表面抗原P30基因克隆与表达

将液氮保存的弓形虫 Ｎ Ｔ 株经小鼠复壮后，取腹腔液提取弓形虫基因组 Ｄ Ｎ Ａ，采用 Ｐ Ｃ Ｒ 方法从弓形虫 Ｎ Ｔ 株中扩增出约 ８００ ｂｐ 的片段。产物经 Ｅｃｏ Ｒ Ｉ和 Ｘｂａ Ｉ酶切后，克隆到 ｐ Ｕ Ｃ１９ 载体中，构建了 ｐ Ｂ Ｖ Ｐ３０ 非融合表达质粒和 ｐ Ｅ Ｔ Ｐ３０ 融合表达质粒。ｐ Ｂ Ｖ Ｐ３０ 转化到宿主菌 Ｄ Ｈ５α、ｐ Ｅ Ｔ Ｐ３０ 转化到宿主菌 Ｂ Ｌ２１ （ Ｄ Ｅ３）后，分别经温控诱导和 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 诱导，产物经 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 分析，ｐ Ｂ Ｖ Ｐ３０ 未发现表达产物，ｐ Ｅ Ｔ Ｐ３０ 出现约 ３０ ０００ 的产物。 Ｗ ｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 显示，该蛋白与兔抗弓形虫血清发生特异性反应；薄层扫描显示，该蛋白占菌体总蛋白的 ２０％ 以上。     

产蛋下降综合征（EDS－76）病毒DNA探针的制备及应用研究

用纯化的产蛋下降综合征（ＥＤＳ－７６）病毒（Ｈ９１毒株）悬液提取的核酸，经琼脂糖凝胶电泳只出现１条分子量较大、背景清晰的核酸带。用ＢａｍＨＩ酶消化产生４个片段，大小分别为１７ｋｂ、１０ｋｂ、４．０ｋｂ和２．０ｋｂ。将其中的２．０ｋｂ片段克隆进ｐＵＣ１８ＤＮＡ载体中，重组质粒ＤＮＡ用ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记作为ＤＮＡ探针，在ｄｏｔｂｌｏｔ中该探针不与鹅胚尿囊液核酸抽提物、马立克氏病病毒（ＭＤＶ）ＤＮＡ、鸡传染性贫血病毒（ＣＡＶ）ＤＮＡ、ＳＰＦ鸡基因组ＤＮＡ等核酸反应，只与３株ＥＤＳ病毒（ＥＤＳ标准毒株ＡＶ－１２７、ＥＤＳＨ９１毒株和从健康鹅体中分离的ＥＤＳＹ８１毒株）ＤＮＡ呈阳性反应。人工感染产蛋母鸡和雏鸡后２４ｈ即可用该探针从泄殖腔棉拭子样品中检测出ＥＤＳ病毒ＤＮＡ，在感染后３５ｈ仍能从部分感染鸡样品中检出。对部分探针检测阳性鸡的泄殖腔棉拭子样品用ＳＰＦ鸡胚分离病毒，并用ＨＡ和ＨＩ试验检测分离病毒的特异性；在感染过程中，同时检测了血清中ＨＩ抗体的消长情况。结果表明，人工感染鸡排毒至少可以维持２个月左右，而且血清中ＨＩ抗体即使很高，也不能阻止感染鸡的排毒。     

人肿瘤坏死因子α逆转录病毒表达载体的构建

应用ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｌｌｋｓ质粒构建了含人肿瘤坏死因子－α　ｃＤＮＡ的过渡性载体ｐＢＴ１和ｐＢＴ２。用限制性内切酶ＢａｍＨＩ与ＥｃｏＲＶ消化ｐＢＴ１ＤＮＡ，分离出了ＴＮＦ－α　ｃＤＮＡ基因片段，并在其平末端加入了ＢａｍＨＩ接头。进而将带有ＢａｍＨＩ粘性末端的ＴＮＦ－αｃＤＮＡ克隆到了逆转录病毒载体ｐＺＩＰＮｅｏＳＶ（Ｘ）１５′－端长末端重复序列（ＬＴＲ）下游的ＢａｍＨＩ切点上，构建了重组质粒ｐＺＩＰＴＮＦ。该重组质粒经琼脂糖凝胶电泳，限制性内切酶消化和核酸杂交鉴定分析，证明ｐＺＩＰＮｅｏＳＶ（Ｘ）１中插入了ＴＮＦ－α　ｃＤＮＡ，并且方向正确。本研究为应用重组逆转录病毒介导ＴＮＦ－α基因转移与治疗奠定了基础。     

马传染性贫血病毒弱毒株LTR的克隆及序列分析

从马传染性贫血病毒（ＥＩＡＶ）弱毒株感染的驴胎皮肤（ＦＤＤ）细胞中提取前病毒ＤＮＡ，以其为模板，通过ＰＣＲ扩增出ＥＩＡＶ弱毒株的ＬＴＲ，并将其克隆到载体质粒ｐＵＣ１９中。经酶切分析，ＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交筛选、鉴定，获得含有ＥＩＡＶ弱毒株ＬＴＲ片段的重组质粒ｐＬＴＲ。对该质粒的序列分析发现，在中国ＥＩＡＶ弱毒株ＬＴＲ的Ｕ３区含有４个与细胞转录因子结合的位点，其中有３个ＰＵ．１位点和１个ＡＰ－１位点，Ｕ３区还存在１个ＴＡＴＡＴＡＡ启动子序列；Ｒ区长为８１ｂｐ，含有１个帽位点ＧＧ和１个Ｐｏｌｙ（Ａ）信号序列ＡＡＴＡＡＡ；在帽位点下游是１个病毒Ｔａｔ蛋白结合位点，即ＴＡＲ位点；Ｕ５区长为３９ｂｐ。中国ＥＩＡＶ弱毒株ＬＴＲ序列与国外发表的其他毒株序列相比，在ＬＴＲ的一些调控部位有变异发生，中国ＥＩＡＶ弱毒株与美国ＥＩＡＶ原型株（Ｗｙｏｍｉｎｇ株）ＬＴＲ区核苷酸序列有１８．７２％的差异。     

猪瘟病毒保护性抗原E2基因的克隆及在原核细胞中的表达

应用ＲＴ－ＰＣＲ分两段扩增猪瘟病毒（ＨＣＶ）石门株Ｅ２基因,然后对其进行了克隆。利用两个片段重叠部分的单一ＢｇｌⅡ位点,将它们连接成为完整的Ｅ２基因,并克隆到ＰＵＣ１９质粒中,获得重 质粒ＰＨＣＦ２。另设计一对引物,以ＰＨＣＦ２为模板扩增出不含信号肽的Ｅ２基因,然后将其克隆到表达载体质粒ｐＢＶ２２０和ＰＥＴ＿２８ａ（＋）中,获得重组质粒ＰＢＶＥ２和ＰＥＴＥ２,用酶切,ＰＣＲ和序列分析鉴定Ｅ２基因插     

鸡痘病毒282E4株2.2kbTK基因序列分析

将鸡痘病毒２８２Ｅ４弱毒株基因组中的３．７ｋｂＨｉｎｄⅢ片段克隆到ＫＳ（－）质粒中，亚克隆后，获得含ＴＫ基因正反方向插入的２．２ｋｂＨｉｎｄⅢ－ＣｌａＩ片段的质粒ｐＫＦＡ和ｐＫＦＢ，进而构建出正反方向的系列嵌套缺失质粒。用Ｔ７、Ｔ３引物所做的核苷酸序列分析表明，２．２ｋｂＨｉｎｄⅢ－ＣｌａＩ ＴＫ基因序列长为２１５９ｂｐ，含有两个完整的读码框架（ＯＲＥ）Ｘ和ＴＫ，并确证了ＴＫ基因内存在单一酶切点Ｎ     

NDV融合蛋白裂解位点基因的重组昆虫杆状病毒表达载体的构建…

将新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４６Ｅ９株和ＬａＳｏｔａＥ４株的融合蛋白裂解位点（Ｆｃ）基因从本实验室构建的重组质粒ｐＵＣＦ４６Ｆｃ和ｐＵＣＬａＦｃ中用ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ切出。将这２个毒株的Ｆｃ基因定向克隆入昆杆状病毒表达载体ｐＳＸＩＶＶＩＸ３的ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ位点之间，获得２个毒株的Ｆｃ基因克隆ｐＸ３Ｆ４６Ｆｃ和ｐＸ３ＬａＦｃ。重组质粒用ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ，ＰｓｔＩ酶切法，ＰＣＲ和核酸探针法进行