双齿围沙蚕CYP4基因的克隆及序列分析

根据已知的绿沙蚕Nereisvirens细胞色素氧化酶CYP342A1保守区设计引物,采用RACE技术首次从双齿围沙蚕Perinereisaibuhitensis体壁肌肉中克隆出细胞色素氧化酶CYP4基因全长序列。分析结果表明,该序列全长为1857bp,5’端非翻译区为186bp,3’端非翻译区为225bp,阅读框为1446bp,编码为481个氨基酸。第422～431氨基酸序列符合P450所具有的结构保守共有序列FxxGxxxCxG,第319～322氨基酸序列为K螺旋特征基序ExxR区,第282～294氨基酸序列含有CYP4家族特征序列EVDTFMFEGHDTr。经Blast与GenBank中已知物种的氨基酸序列进行同源性比对,CYP4与多毛类绿沙蚕Nereisvirens CYP4BB1、CYP342A1（AY453408）氨基酸同源性为73％、36％,与多毛类小头虫CapiteUacapitataCYP4ATI（AY574044）同源性为39％。据此推断,双齿围沙蚕CYP4基因属于CYP4B亚家族。     

一品红转化酶基因片段的克隆和序列分析

根据植物酸性转化酶基因的保守区序列,设计1对PCR引物,以一品红基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出长约500 bp的DNA片段,克隆入pM D-18T载体,测序结果表明:获得1个一品红酸性转化酶基因家族的成员,该基因片段长523 bp,编码173个氨基酸,属于开放阅读框的一部分,不含内含子。在G enB ank中进行同源性检索的结果表明,该成员编码的氨基酸与其他植物细胞壁酸性转化酶编码的氨基酸同源性较高。     

水稻耐盐相关基因ZRP4的克隆及其植物表达载体的构建

采用RT-PCR技术克隆了水稻O-甲基转移酶ZRP 4基因的cDNA片段,并进行了序列测定与分析。结果表明,该序列全长1 101 bp,编码366个氨基酸,与G enB ank中水稻ZRP 4基因序列比对,核苷酸同源性为99.8%,氨基酸同源性为99.7%。将克隆片段插入中间载体pBPFΩ7,经H indⅢ酶切回收带有P 35s启动子和nos终止子片段,连接pCAM B IA 1301载体,成功构建ZRP 4基因的植物表达载体。     

薹菜CYP79B5基因的克隆及原核表达

以薹菜品种京研薹菜叶片cDNA为模板,采用RT-PCR技术,获得了编码薹菜CYP79B5基因全序列1 847 bp,包含有1 620 bp的开放阅读框,编码540个氨基酸.以薹菜基因组DNA为模板,获得了2 112 bp的目的片段.经比对发现其氨基酸序列与油菜、白芥、拟南芥等CYP79B5编码的氨基酸序列具有较高同源性,与油菜同源性达100%.经过生物信息学分析,发现所推导的氨基酸序列具有明显的CYP蛋白信号域,且可以在SWISS-MODEL数据库中搜索到与之相近的三维结构.扩增CYP79B5完整的编码区序列,构建pET-24α(+)重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导融合蛋白高效表达,SDS-PAGE电泳检测发现在相对分子质量64 000处有一特异条带,与预期的目的产物蛋白带大小一致.     

人参CYP716A53v2基因的克隆与序列分析

研究人参皂苷生物合成途径中的影响因子。以五年生人参根组织为试验材料,提取总RNA,反转录合成c DNA的第1条链,利用PCR法对人参中的原人参三醇合成酶(CYP716A53v2)基因的c DNA进行克隆及序列分析。获得CYP716A53v2基因全长片段为1 506 bp,开放阅读框长1 410 bp,编码470个氨基酸多肽。生物信息学分析显示,CYP716A53v2基因编码蛋白质不含跨膜区域。说明CYP716A53v2基因与其他植物氨基酸序列具有较高同源性,其中与人参、西洋参、三七同源性分别为99%、98%、98%。     

鹅Mel 1c基因的克隆及生物信息学分析

从鹅脑组织中提取总RNA,利用RT-PCR扩增Mel 1c基因c DNA序列。结果表明,Mel 1c基因序列长为1 118 bp;与已报道其他物种的Mel 1c同源性为58.4%~72.2%;氨基酸序列的同源性为74.7%~97.0%;该基因编码的蛋白质为N端在胞内的六次跨膜蛋白,含有信号肽的分泌蛋白,N端亦含有两个糖基化位点;该蛋白也含有G蛋白偶联受体家族的结构域。     

鸭疫里氏杆菌广西分离株16S rRNA基因序列的测定和系统进化分析

选取3株不同血清型的鸭疫里氏杆菌广西分离株GXRA 01、GXRA 07和GXRA 09,利用细菌通用引物,通过PCR方法成功扩增出16S rRNA的部分基因片段,通过克隆、序列测定获得3个分离株16S rRNA基因的核苷酸序列,并与G enB ank中注册的一些菌株的16S rRNA基因序列进行比较、系统进化关系分析发现:3株RA分属两个基因群,I群(GXRA 01)与AY 871818和AY 871819的16S rRNA序列的同源性达99.9%,Ⅱ群(GXRA 07、GXRA 09)与G enB ank中16S rRNA序列的同源性达99.3%-99.6%,GXRA 07与GXRA 09之间的同源性为100%,表明这3株菌株应为鸭疫里氏杆菌。     

磨盘和富有柿果实ACS基因片段的克隆

利用RT-PCR的方法,从磨盘、富有柿果实中克隆了ACC合成酶(ACS)的3个DNA片段。序列分析表明：Mopan-ACS1、Mopan-ACS2与平核无柿果实DK-ACS1的核苷酸同源性为75．6％,氨基酸同源性分别为98.7％和98.2％。Fuyu-ACS与DK-ACS1的核苷酸同源性为99．2％,氨基酸的同源性为99．4％。3个片段编码的氨基酸序列中,均含有植物ACS的保守氨基酸区和不变氨基酸残基。     

野桑蚕不同组织细胞色素P450 CYP305B1V1基因的诱导表达特征研究

[目的]研究不同诱导物对野桑蚕各组织中细胞色素P450CYP30581V1基因表达的影响。[方法]参照GenBank中公布的野桑蚕CYP305B1V1基因的mRNA序列,设计1对引物,采用半定量RT-PCR方法分析经NaF、芸香苷、氯氰菊酯和蜕皮激素处理的野桑蚕各组织中CYP305B1V1基因的表达情况,并对该基因的氨基酸序列进行同源性比较和进化分析。[结果]氯氰菊酯、芸香苷和NaF影响野桑蚕6TP305B1V1基因在组织中的表达,蜕皮激素无明显影响。氨基酸的同源性分析表明该基因氨基酸序列与家蚕CYP305B1的氨基酸序列同源性最高（100％）;与赤拟谷盗推测的CYP305A1、蜜蜂推测的CYP305A1、果蝇CYP305A1、冈比亚按蚊CYP305A2及库蚊CYP2L1有较高的同源性。[结论]野桑蚕CYP30581V1基因可能主要参与外源性化舍物的代谢,对揭示细胞色素P450的功能和不同药物的代谢机理具有重要意义。     

猪Caspase-3基因的克隆及序列分析

天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(C aspase)是与细胞凋亡有关的一类蛋白酶,其中C aspase-3是细胞凋亡的最终执行者。为了进一步研究C aspase-3的生物学功能,从PK-15细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出猪C aspase-3基因,序列分析表明克隆的C aspase-3基因与G enB ank上登录的猪C aspase-3基因核苷酸与推导的氨基酸序列同源性分别为98.9%和98.6%,与人和鼠的C aspase-3基因核苷酸、氨基酸序列同源性分别为88.6%、83.5%和87.8%、86.7%,而且猪、人、鼠的C aspase-3上的催化和剪切位点都极为保守。     

Identification,Characterization, and Expression of P450 Gene Encoding CYP6BQ13v2 from the Red Flour Beetle,Tribolium castaneum （Herbst） （Coleoptera： Tenebrionidae）

An allele of CYP6BQI3, named CYP6BQ 13v2 （GenBank accession no. FJ209361）, was isolated from the red flour beetle, Tribolium castaneum （Herbst） （Coleoptera： Tenebrionidae） by RT-PCR. The cDNA sequence of CYP6BQ13v2, 1 563 bp in length, contains an open reading frame of 1 554 nucleotides encoding a putative protein of 518 amino acid residues with a predicted molecular weight of 59.92 kDa and a theoretical pl of 7.60. The putative protein contains the classic hemebinding sequence motif F××G×××C×G （residues 456-465） conserved among all P450 enzymes as well as other characteristic motifs of all cytochrome P450s. It shares 98% identity with the previously published sequence of CYP6BQ13 （GenBank accession no. XP967146） from the T. castaneum genome project. Phylogenetic analysis of amino acid sequences from members of various P450 families indicated that there was closer phylogenetic relationship of CYP6BQ 13v2 with CYP302A1 and CYP307A1 mediating synthesis of the insect molting hormone, distant relationship with CYP6B1 metabolizing plant allelochemicals, CYP6D 1 linking to pyrethroid resistance and other members of CYP6 family. Expression test of the gene in the adults and immature stages of T. castaneum by quantitative real-time PCR revealed that CYP6BQ13v2 is expressed in all life stages investigated. The mRNA expression level in 1st instar larvae was 14.9- and 3.86-fold higher than those in pupae and adults, respectively. The CYP6BQ13v2 expression levels appeared in the order of 1st instar larvae, followed by 4th instar larvae, 7th instar larvae, adult, and pupae from high to low. The more bioinformation of CYP6BQ 13v2 was also analyzed.     

大豆蚜CYP4G51基因克隆及吡虫啉胁迫对其诱导效应

细胞色素P450是昆虫体内重要的解毒代谢酶,与昆虫对杀虫剂抗性有关。试验通过转录组测序获得1条新的大豆蚜细胞色素P450的cDNA序列,经国际P450命名委员会命名为CYP4G51,该基因GenBank登陆号为MG829857。cDNA序列全长2 347 bp,含1个长度为1 701 bp开放阅读框,编码566个氨基酸,等电点约为6.46,分子质量约为64.5 ku。氨基酸序列中包含昆虫P450基因共有保守结构域。LC10、LC30和LC50不同浓度吡虫啉诱导3 h后,基因相对表达量均显著上调,与浓度呈正相关;LC50浓度下诱导12 h时相对表达量最高,为未诱导的5.467倍,表明该基因参与大豆蚜对吡虫啉的解毒代谢过程。     

玫烟色棒束孢几丁质酶基因部分序列的克隆及分析

为了得到玫烟色棒束孢几丁质酶基因的保守区域,根据GenBank中几丁质酶基因的同源性序列设计简并引物,采用DNA和RNA分别作为模板扩增玫烟色棒束孢的几丁质酶保守区域。结果表明,DNA扩增的含有3个内含子,RNA扩增的不含内含子;所得到的氨基酸序列具有几丁质酶18族的典型特征,即1个酶作用活性位点和几丁质结合区。     

北方梭囊孔菌漆酶基因DNA片段的克隆与序列分析

根据报道的10几种真菌漆酶氨基酸序列的保守区域设计了一对简并引物,以北方梭囊孔菌总DNA为模板,通过PCR扩增到一个1 201 bp的基因片段.将片段序列在NCBI的BLAST软件上进行同源性搜寻,显示99个序列,全部为漆酶基因及其类似基因,因而认为克隆到的片段就是北方梭囊孔菌漆酶基因片段.经过与同源性最高的粗毛革孔菌（laccase lcc1）同一区段编码区序列进行ClustalW比较,其中有6个间隔区,确定为内含子区.去除内含子后,推导的氨基酸序列为286个残基.经与其他几种真菌漆酶的氨基酸序列进行ClustalW比对,同源性均在51%以上.      

番木瓜GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶基因的克隆及分析

采用cDNA末端快速扩增方法,获得了番木瓜果实GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶(GMP)基因的cDNA全长序列,将其命名为CpGMP,GenBank登录号为FJ489652.然后,根据拼接序列设计开放性阅读框上、下游引物,扩增得到了CpGMP基因的开放性阅读框序列和DNA序列.ORF序列编码361个氨基酸,DNA序列包含4...     

昆虫CYP4基因家族多样性和进化

CYP4基因家族属于P450基因超家族中的一个基因家族。CYP4基因家族在昆虫中表现出极大的多样性,如亚家族及其成员的多样性、基因变异体、表达多样性等。所以,CYP4基因家族是研究进化的好材料。为了确定CYP4基因家族真正的进化机制,人们对它的内含子、外显子、氨基酸、假基因、镶嵌基因、启动子等其他功能片断进行过研究,但是不够深入。CYP4基因家族属于功能基因,所以,不仅要研究其核苷酸或者氨基酸序列,应该进一步研究其高级结构。     

野桑蚕不同组织细胞色素P450CYP30581V1基因的诱导表达特征研究

1材料与方法 1．1材料与试剂野桑蚕采自苏州大学独墅湖校区桑园;宿主菌E．coli TOP10为苏州大学基础医学及生物科学学院生物资源与功能基因组学研究室保存;植物次生性物质芸香苷和内源性物质蜕皮激素均购自SIGMA公司;氯氰菊酯购自拜耳杭州作物科学有限公司;外源性化合物NaF（分析纯）购自西安化学试剂厂;RNAiso reagent试剂盒购自TakaRa公司;其他常用试剂购自TaKaRa公司或上海生工生物工程技术服务有限公司：     

4株猪链球菌2型分离株主要毒力因子(MRP、EF)的全基因序列分析

猪链球菌2型(SS2)是一种重要的人兽共患病病原菌,溶菌酶释放蛋白(MRP)和胞外因子(EF)是其重要的2种毒力因子.参照GenBank上已发表的MRP和EF基因序列,设计引物,对4株国内SS2分离株进行MRP和EF全基因序列测定并进行分析.结果表明:4株SS2国内分离株MRP基因的完整开放阅读框(ORF)都为3 771 bp、编码1 256个氨基酸,EF基因的完整ORF都为2 532 bp,编码843个氨基酸;与国外参考株D282之间的MRP核苷酸和蛋白质的同源性都为99.9%,EF核苷酸的同源性为99.9%、蛋白质的同源性为99.5%～100.0%.