我国木本植物致病性土壤杆菌的分子检测和比较鉴定

根据根癌土壤杆菌Ti质粒的保守序列设计了2对引物,对我国不同木本植物上分离鉴定的10株致病性根癌土壤杆菌进行PCR,致瘤性根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)扩增出427 bp和338 bp的特异性DNA片段,而发根土壤杆菌(A.rhizogenes)仅扩增出338 bp片段,放线土壤杆菌(A.radiobacter)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)和泡桐丛枝病植原体(phytoplasma)皆未有特异扩增带.用CYT/CYT'引物对也可鉴定T-DNA遗传转化瘤组织,而VirD2A/VirD2E可用于工程土壤杆菌株侵染能力鉴定.从北京通州杨树苗圃和河北廊坊桃园的病树冠瘿组织和土壤中经选择培养基分离菌株,然后PCR筛选出6个致病性根癌土壤杆菌菌株,而未能从施用过抗根癌生防制剂的北京玉渊潭公园樱花根癌病园中分离和鉴定出典型的致病根癌土壤杆菌株.将杨树根癌土壤杆菌菌株(CFCC1001)异戊烯基转移酶基因(ipt)片段克隆和序列测定结果显示与A.tumefaciens Ti15955菌株的ipt基因序列同源性为83.64%.用此片段制备的ipt cRNA基因探针进行斑点杂交和Northern blot,结果显示此探针与杨树根癌土壤杆菌以及玫瑰、樱花、海棠、桃树等木本植物上分离鉴定的致病土壤杆菌菌株所扩增出的427 bp片段都有明显杂交信号,但与引起泡桐丛枝病植原体染色质和染色质外DNA均未有明显杂交信号.     

枣疯病和泡桐丛枝病原植原体分离物的组织培养保藏和嫁接传染研究

分别从河北唐县赞皇大枣、辽宁凌源梨枣和河南濮阳扁核酸3个品种的枣疯病和来自山东、江西和北京的不同无性系的泡桐丛枝病树上采集丛枝枝条作为组织培养材料,获得的枣疯病和泡桐丛枝病组培苗皆表现典型的丛枝症状。其中感染植原体的赞皇大枣组培苗(Ft)和扁核酸组培苗(HPD)在未加任何激素的MS培养基和其它培养基交替继代培养1a以上仍能维持丛枝苗生长;而发病梨枣(LD)除产生丛枝外,还出现叶片黄化和植株矮化、枯梢等衰退症状。泡桐丛枝病植原体可在不同无性系组培苗上通过各种培养基交替和单纯的MS培养基继代培养,并已在实验室内连续保藏达10a,其引致丛枝症状的能力无明显的改变。用枣树Ft染病材料作接穗,以健康冬枣(DJ)和抗病婆枣(W14)砧木进行组培苗间嫁接传病试验,可使部分DJ和W14发病;而嫁接未发病的砧木多数像健苗一样正常生长。用感染山东泡桐丛枝病植原体ZD株系丛枝组培苗为接穗,嫁接健康泡桐无性系组培苗致使无性系MB33、TY2T和C125发病。用植原体16SrDNA通用引物进行PCR,确证了泡桐和枣树发病苗和嫁接发病组培苗体内存在植原体。用DAPI荧光显微镜技术比较组培苗韧皮部筛管中的植原体浓度,结果显示,Ft和嫁接发病冬枣(DJ-Ft)筛管中植原体浓度相对较高,但仍低于各泡桐无性系染病丛枝组培苗;HPD和LD浓度中等,而发病的W14砧木含有植原体的筛管数量较少、且浓度很低。在嫁接不成功或未发病的DJ和W14砧木组织及健康对照组织中皆检测不到植原体荧光。     

以tuf基因为靶标的5种16SrⅠ组植原体环介导恒温扩增技术

【目的】建立一种能够特异性检测和鉴定16SrⅠ组植原体的环介导恒温扩增技术,实现16SrⅠ组植原体的快速检测。【方法】以植原体tuf基因作为靶标,通过序列比对,设计多组具有特异性的LAMP引物组,筛选出一套适用于16SrⅠ组植原体的特异性检测体系。以16SrⅡ组、16SrⅤ组、16SrⅩⅨ组植原体样品按照此检测体系进行反应,来验证其特异性;同时将稀释后的感病组织样品同步进行PCR和LAMP检测,以确定其检测灵敏度。对来自不同省市的6份田间样品以及9份组培样品进行检测,以验证其检测的稳定性。【结果】16SrⅠ-LAMP在恒温63℃条件下40 min内完成扩增,能检测5种分别引起泡桐丛枝、苦楝丛枝、桑树萎缩、莴苣黄化和长春花绿变病的16SrⅠ组植原体,不能检测其他组植原体包括16SrⅡ组的花生丛枝、甘薯丛枝、臭矢菜丛枝、16SrⅤ组的枣疯病、红花槐丛枝、樱桃致死黄化和16SrⅩⅨ组的板栗黄化皱缩植原体。通过在反应液中加入钙黄绿素肉眼判断绿色为阳性结果,褐色为阴性结果,与用荧光定量设备进行判读扩增曲线的结果一致。相比于PCR检测,16SrⅠ-LAMP检测的灵敏度提高了8倍;16SrⅠ-LAMP能够快速检测出来自不同区域的田间泡桐发病样品、感病泡桐组培苗和嫁接传病脱毒苗。【结论】以tuf基因作为靶标,建立能同时检测5种16SrⅠ组植原体的环介导恒温扩增技术,具有高效、特异、操作简便、检测时间短及成本较低等优点,适合于基层和现场检测。     

泡桐无毒组培种苗规模化生产技术研究

本文研究了组培技术在泡桐良种大规模繁殖上的应用，解决了脱除植原体泡桐组培无毒苗移栽过渡难点，并对泡桐全年最佳组培苗移栽时期进行了探讨。     

泡桐无毒组培种苗规律化生产技术研究

本文研究了组培技术在泡桐良种大规模繁殖上的应用，解决了脱除植原体桐组培无毒苗移栽过渡难点，并对泡桐全年最佳组培苗移栽时期进行了探讨。     

泡桐丛枝病发生与代谢组变化的关系（英文）

【目的】通过对泡桐健康苗和丛枝病苗进行代谢组分析,探讨代谢物变化与泡桐丛枝病发生的关系。【方法】利用非靶标的高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)对长度为1.5 cm的健康和植原体感染的毛泡桐组培苗顶芽进行代谢组分析,将上机检测得到的质谱数据用主成分分析和偏最小二乘判别分析法进行分析得到最终差异的荷质比,并将其比对到KEGG代谢物数据库中,通过分析找到植原体感染的毛泡桐组培苗与健康组培苗之间代谢物含量和种类的差异。【结果】毛泡桐病苗和健康苗中有1 612种代谢物发生变化。与健康苗相比,在病苗中有765种代谢物含量下降,847种代谢物含量增多。KEGG代谢通路分析表明,这些代谢物中有460种代谢物参与111个代谢途径,其中变化显著的3个代谢途径为"异喹啉生物碱合成"、"双萜类生物合成"和"黄酮生物合成"。另外,病苗中参与植物激素信号转导的代谢物也发生明显变化。其中在植原体感染的毛泡桐病苗中玉米素、玉米素核苷、赤霉素、二氢玉米素核苷、花葵素、黄芩素和花青色素等含量发生明显变化,表明这些代谢物含量的变化可能与丛枝病发生有一定关系。【结论】通过比较健康苗和病苗中代谢物含量和种类的变化,找出可能与丛枝病发生密切相关的代谢物及其相应的代谢通路,该结果有助于进一步阐明泡桐和其他植物丛枝病发生分子机制,并为泡桐丛枝病有效防治奠定基础。     

丛枝病植原体侵染对泡桐组培苗组织内H2O2产生的影响

用保存的不同泡桐无性系染病和健康组培苗为试材,对染病苗、机械损伤、嫁接接种和健康组培苗组织中H2O2及过氧化物酶的变化进行研究.用DAB组织染色方法对H2O2组织定位结果显示,在未损伤情况下多数染病泡桐苗和健康苗H2O2积累皆较少.机械损伤后,病与健苗皆出现H2O2过量积累,其中健苗强于病苗.在维管束部位,重症苗POD活性最强,轻症苗次之,无症和健康苗活性较低;而且所有苗在脉间叶肉组织POD活性都明显低于叶脉组织.用病接穗嫁接健康泡桐砧木的早期(3天以内)似乎与损伤反应类似(包括POD和H2O2产生);6天后损伤反应减弱.嫁接接种成功的组合至20天,在嫁接接口处仍维持高的H2O2释放和强POD活性,并且砧木主茎和部分叶片出现系统性POD活性增强和H2O2积累.采用KI/淀粉试剂对H2O2组织定位结果显示:在健株主茎切片中皮层和髓细胞表面、木质部成熟导管管壁有较强的H2O2释放;而病株的相应部位产生量较少.在健康切片测定液中加入病主茎横切片可诱导健康切片H2O2积累量增加.用不同浓度的H2O2处理染病泡桐丛枝茎段外植体1 h,在25～100 mmol·L-1浓度范围内能明显缓解组培苗丛枝症状.抗坏血酸和低通气环境处理也有减轻病苗丛枝症状的作用.不同泡桐品系在活性氧代谢上的差异与其对植原体的抗性存在密切关系.     

多位点序列分析揭示我国16SrI组植原体不同株系间遗传变异和系统发育关系（英文）

【目的】16SrI组植原体对我国作物和生态植物危害严重。目前植原体尚不能分离培养,对于我国植原体不同株系间遗传变异和种群结构尚不清晰,通过多位点序列分析(MLSA)揭示我国不同地区16SrI组不同植原体株系的遗传多样性及其地理分布特征,比较不同植原体株系间不同持家基因的变异程度,为我国不同植原体株系的检测、分类鉴定和系统发育研究提供一定的参考方法和依据。【方法】应用rp,tuf,secA,secY,ipt,dnaK,fusA,gyrB,pyrG和rpoB共10个持家基因序列,结合16S rDNA序列,以全基因序列已完成的洋葱黄化植原体(OY-M)、翠菊黄化丛枝植原体(AYWB)、澳大利亚葡萄黄化植原体(CPA)、草莓致死黄化植原体(SLY)和苹果簇生植原体(CPM)共5种植原体株系为参照,分析我国10个省(市)苦楝丛枝、莴苣黄化、桑萎缩、泡桐丛枝和长春花绿变植原体株系(共18株)的遗传变异规律和系统发育关系,通过多重序列比对分析不同基因片段的序列多态性和变异程度。【结果】我国18株苦楝丛枝、莴苣黄化、桑萎缩、泡桐丛枝和长春花绿变植原体株系的rp,tuf,secA,secY,ipt,dnaK,fusA,gyrB,pyrG和rpoB多位点序列共有15种序列类型,从而揭示16SrI组不同植原体株系间丰富的遗传多样性。基于rp等10个基因多位点序列分析可将16SrI-B、D亚组的不同植原体株系清晰地分开。10株苦楝丛枝植原体株系与2株桑萎缩植原体株系系统发育关系最近,多位点序列分析可将这2种基于16S rDNA序列难以区分的植原体株系清晰地区分。10株苦楝丛枝植原体株系分为4个进化枝,其多位点序列存在8种序列类型,这4个分枝与植原体株系的地理分布关系密切。与我国长春花绿变和泡桐丛枝植原体株系相比,福建三明2株莴苣黄化植原体株系与日本洋葱黄化植原体株系OY-M系统发育关系较近。在已检测分析的植原体不同基因序列片段中,dnaK基因序列片段的变异水平最高。【结论】多位点序列分析可做为一种对植原体鉴定、区分以及株系遗传多样性全面检测的有效、可靠方法。在以后的研究中该方法可广泛应用于深入探讨植原体不同组间或亚组间株系的遗传变异和系统发育关系。     

泡桐丛枝植原体pPaWBNy-2-ORF4编码蛋白的抗体制备和表达分析

以感病泡桐组培苗提取的DNA为模板,采用PCR方法扩增pPaWBNy-2-ORF4的部分片段.将目的片段克隆到原核表达载体pGEX-4T-3,重组质粒pGEX-p2ORF4转化大肠杆菌Rosseta(DE3)菌株.IPTG诱导表达,分子量约为38 kDa的含GST标签的融合蛋白得到表达.切胶回收目的蛋白,免疫大白兔制备抗血清.间接ELISA测定抗血清的效价约为1:4096,免疫印迹实验显示:抗血清能够与原核表达的GST融合蛋白发生特异的免疫反应,与pPaWBNy-1-ORF5的原核表达蛋白无明显的交叉反应.利用制备的抗血清,在感病泡桐饲毒的茶翅蝽中检测到分子量约为18 kDa的蛋白条带,而在无菌茶翅蝽和感病泡桐组培苗中均未检测到,表明pPaWBNy-2-ORF4在饲毒的茶翅蝽中表达,而在感病泡桐组培苗中未表达或表达量低于检测水平.据此推测,该基因参与茶翅蝽传播泡桐丛枝植原体.     

抗病和感病泡桐无性系组培苗对嫁接传染植原体的不同反应

用感染了植原体并表现典型丛枝症状的组培苗作接穗或砧木，在无杂菌条件下嫁接７个表现不同田间抗性的无性系健康组培苗，并用ＤＡＰＩ荧光显微镜和１６ＳｒＲＮＡ基因扩增（ＰＣＲ）技术检验嫁接传病效果。Ｃ１２５和ＸｕＨ表现出较强的特异性接种诱发坏死反应，ＺＨ和Ｔ３５０２８坏死反应中等，ＱＬＭ、Ｃ０２０和Ｃ１６１的坏死反应较弱。培养基中添加植物生长调节剂（６ＢＡ或ＮＡＡ）可降低坏死程度，提高嫁接成功率，水杨酸处理或去掉健株砧木叶片和根系皆加重坏死反应程度。用病接穗嫁接抗病的ＱＬＭ无性系时，用ＰＣＲ检测到侵染砧木的植原体，但未表现丛枝症状，而将此无性系健康接穗嫁接到丛枝病砧木上时可诱致典型丛枝症状，从而表现出与根系和成熟叶相关的抗性反应。除Ｃ１２５外，其余６个无性系皆被嫁接传染，其继代培养表现出差异不显著的丛枝症状，其韧皮部金黄色自发荧光随着症状的加重而累积，也与抗病性有一定的联系。     

从我国20种感病植物中扩增植原体16S rDNA片段及其RFLP分析

本研究收集了２０种感染植原体的植物材料,从患病材料和相应健康植物组织中提取总ＤＮＡ用作ＰＣＲ模板,选择两对通用引物进行巢式ＰＣＲ,扩增植原体的１６ＳｒＤＮＡ片段,回收扩增产物,通过限制性酶切片段长度多态性（ＲＦＬＰ）分析进行分类。２０种患病植物材料中的植原体有１３种属于翠菊化种,２种属于白对黄化种,３种属于花生丛枝种,２种属于三叶草丛生种。     

北京市丰台区主栽枣品种对枣疯病抗性试验

采用以感染枣疯病的枣树作砧木嫁接健康休眠接穗的方式,对丰台区8个主栽枣品种进行了抗病性鉴定,并应用DAPI荧光显微方法和PCR方法对接穗进行了枣疯病植原体检测.结果表明,8个供试品种均能被感染,并表现丛枝症状,对枣疯病植原体均无免疫性,其中金芒果枣和冬枣为易感痛品种,尜尜枣和京枣39为相对抗性品种.     

Relationship between Witches' Broom Protein and Dynamic of Some Amino Acids in Paulownia Tree Leaves

IntroductionWitches'broomisaseriousdiseasetothegrowthanditslifeofPaulowniatreesandisoneofproblemsneededtobesolvedurgentlyinforestry.Tenyearsago,physiologicalandbiochemicalchangesduringtheoc-currenceofwitches'broomwerefoundout(Jiang,l992;Ren,l987).Recentye…     

泡桐丛枝植原体抗原膜蛋白基因序列分析与蛋白结构预测

泡桐(Paulownia spp.)原产中国,栽培历史悠久.其自然分布或栽培区遍布全国23个省(市)、自治区,北起辽宁,南至广东、广西、云南南部,东起台湾及沿海诸省,西至甘肃.     

Regeneration of phenotypically normal English elm (Ulmus procera) plantlets following transformation with an Agrobacterium tumefaciens binary vector

A transformation system was developed for English elm (Ulmus procera Salisbury) using Agrobacterium tumefaciens C58 pMP90 p35SGUS/INTRON, allowing for the transfer of foreign genes and regeneration of phenotypically normal elm plantlets. The PCR analysis indicated that both nptII and uidA genes were stably inserted in the plant genome. beta-Glucuronidase histochemical and fluorimetric assays revealed expression of the uidA gene in the shoots, leaves, stems and roots of regenerated transgenic plants. The DNA-DNA hybridizations confirmed the presence of the uidA gene in regenerant plants. Factors influencing successful transformation and regeneration of elms included: identifying gene-transfer-proficient Agrobacterium strains for use with elms; developing an infection protocol allowing T-DNA transfer while retaining the ability to remove inciting bacteria; and identifying selection conditions to eliminate non-transformed material and choice of regeneration medium to allow shoot production. The potential utility of an effective elm transformation and regeneration system in the control of Dutch elm disease is discussed.     

我国不同地区枣疯病发生动态和主导因子分析

对我国陕西清涧、佳县 ,河南濮阳 ,山西临县、太原枣品种圃 ,安徽 ,浙江和北京等部分枣树传统分布区的枣疯病进行了典型调查研究。通过不同地区枣疯病发生历史和危害现状的比较分析 ,初步摸清了各地区枣疯病发生的不同特点和为害状况 ;发现根蘖苗繁殖方式仍是目前多数枣产区病园内苗期和幼树发病以及病害从病区传入无病区的主要原因。不同枣树品种对枣疯病的田间抗性存在明显差异 ;局部空气污染以及施肥等枣树管理措施不当会导致枣树的抗病性降低。用DAPI荧光显微镜和PCR技术检测植原体结果显示 ,病园内存在比例不等的无症带菌树 ;由此判断 ,高比例的无症带菌苗的人为传病及不利于枣树生长的环境应力是导致许多地区病害加重和爆发流行的主导因素     

甜椒抗菌蛋白基因(harp)转化桉树的研究

用不同浓度的2,4-D与IAA对桉树叶盘进行了愈伤组织的诱导及植株再生的试验,建立了新的桉树再生体系.进一步用含甜椒抗菌基因(hrap)的农杆菌侵染桉树叶盘,发现侵染后对愈伤组织诱导率无明显影响,却抑制了桉树的植株再生.对再生苗的PCR和Sou thern杂交检测证实已将hrap基因已转入桉树植株的基因组中.