以色列二穗短柄草休眠及遗传多样性分析

【目的】为探讨以色列地区二穗短柄草的休眠及其遗传多样性,对来自以色列不同地区的13个基因型二穗短柄草进行籽粒休眠深度和EST-SSR标记遗传位点多态性分析。【方法】休眠深度分别测定籽粒在40℃高温不同贮藏时间下的最大发芽率(Gmax),并对其Gmax进行动态方程拟合;SSR标记的扩增片段采用PEGA凝胶电泳分离并用银染法进行显影。【结果】13个基因型中,EG5休眠最深,而基因型Ko12和SB2休眠较浅。SSR标记扩增片段的聚类分析中,Sha4与Bd群体的基因型遗传结构较类似。【结论】以色列不同地区籽粒休眠深度差异较大;北部Shlomi地区的基因型与土耳其地区的二穗短柄草有较近的亲缘关系。     

二穗短柄草BdGPX4基因的克隆及酶学性质

为解析模式植物二穗短柄草中谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GPX)在抗氧化过程中的作用机制,对二穗短柄草BdGPX4基因进行克隆,获得681bp的cDNA序列,该基因编码226个氨基酸残基的蛋白质,预测相对分子量是24.49ku。通过亚细胞定位预测,BdGPX4蛋白位于叶绿体和线粒体中。生物信息学分析发现BdGPX4基因启动子具有植物激素、光信号、干旱以及冷胁迫响应元件。结合二穗短柄草基因芯片数据和RT-PCR表达检测结果,发现BdGPX4基因在根、茎、叶、叶鞘、苗芽、穗状花序和种子等部位均表达,在光合组织和生长旺盛部位的表达显著高于非光合和衰老部位,并在根部受到SA诱导表达上调。成功构建BdGPX4基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化BdGPX4蛋白,检测到对H_2O_2和COOH具有较高活性,但对底物tBOOH活性较低,与直系同源蛋白OsGPX4相比功能发生分化。基因表达模式及酶学活性的特点预示着二穗短柄草BdGPX4基因在光合器官和胁迫条件下具有重要的抗氧化作用。     

二穗短柄草钙依赖型蛋白激酶基因 BdCDPK14克隆及表达分析

[目的]克隆分析二穗短柄草钙依赖型蛋白激酶(CDPK)基因BdCDPK14,并检测其在干旱胁迫下的表达量,为揭示钙依赖型蛋白激酶的抗旱调控机制打下基础.[方法]根据NCBI检索结果设计特异引物,以二穗短柄草cDNA为模板,采用PCR扩增二穗短柄草CDPK基因家族成员BdCDPK14,利用在线分析软件对BdCDPK14基因编码蛋白进行生物信息学分析,并采用RT-PCR检测PEG-6000干旱胁迫下的BdCDPK14基因表达量.[结果]从二穗短柄草叶片中克隆获得的BdCDPK14基因(GenBank登录号XM_003564390)片段长度1750 bp,其开放阅读框(ORF)1545 bp,编码514个氨基酸,其编码蛋白分子量56.78 kD,理论等电点5.45,脂肪指数78.21,不稳定指数38.66,属于稳定蛋白.BdCDPK14蛋白与小麦TaCPK13蛋白(ABY59018)的亲缘关系最近,含有4个EF-hands结构、蛋白酪氨酸激酶结构域、脂多糖激酶家族、ATP结合区域、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶激活区和预测跨膜区等结构域,主要由无规卷曲和α-螺旋构成,位于叶绿体和细胞质膜上.在PEG-6000干旱胁迫下,BdCDPK14基因在胁迫3 h内的相对表达量无明显变化,胁迫6 h后相对表达量开始升高,至胁迫12 h时的相对表达量最高.[结论]克隆获得的BdCDPK14基因为二穗短柄草CDPK基因家族成员之一,参与其抗干旱胁迫反应,可作为候选基因用于二穗短柄草抗旱机制研究.     

以色列二穗短柄草谷胱甘肽过氧化物酶活性分析

二穗短柄草是一种理想的研究温带禾谷类植物和牧草的模式植物.本文对来源于以色列4个不同地区105个生态型二穗短柄草的根、茎、叶中的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性进行了测定分析.结果表明:在贵州的自然气候条件下,以色列二穗短柄草根、茎、叶部位的GSH-Px活性存在显著性差异,其活性的高低顺序为:叶>茎>根;不同生态...     

二穗短柄草CYP72A亚族成员表达分析及亚细胞定位

细胞色素P450是一类重要的氧化酶,几乎参与植物所有的代谢途径,CYP72A属于CYP450的一个亚族,主要参与次生代谢及生物胁迫响应。以二穗短柄草(Brachypodium distachyon L.)基因组数据库为基础,利用生物信息学方法鉴定获得了14个CYP72A亚族成员。为鉴定二穗短柄草CYP72A亚族成员的功能,利用RT-qPCR方法分析CYP72A亚族基因在不同组织中及在禾谷镰刀菌处理下的表达模式。组织表达模式结果显示,在14个CYP72A亚族基因中,有7个基因在种子中的相对表达量较高,4个基因在叶片中的相对表达量较高。禾谷镰刀菌处理下的CYP72A亚族基因表达模式结果显示,有7个基因受禾谷镰刀菌诱导而上调表达,其中上调倍数超过8倍的有4个基因,分别是Bradi2g41110、Bradi2g44160、Bradi2g44190和Bradi2g44200,通过原生质体瞬时转化方法分析这4个CYP72A亚族成员的亚细胞定位,结果显示,4个CYP72A亚族成员都定位于内质网。综合以上研究结果可知,二穗短柄草CYP72A亚族基因在根、叶片中高表达,并且可能通过内膜系统参与生物胁迫响...     

二穗短柄草DREB1G基因表达模式分析和在拟南芥中的异源过量表达

CBF/DREB基因是一类植物特异性转录因子,通过调控下游抗逆相关基因的表达,在植物逆境胁迫应答过程中发挥重要作用。为了研究新型的禾本科模式植物二穗短柄草DREB基因的功能,克隆BdDREB1G的cDNA序列,分析该基因在各种非生物胁迫条件下的表达,构建过表达载体,获得转基因拟南芥。结果表明:高温、低温和水杨酸胁迫处理显著诱导BdDREB1G的表达,暗示该基因响应高温和低温胁迫。初步观察结果说明,该与野生型拟南芥相比,转基因植株生长发育迟缓。这些为研究该基因响应非生物胁迫的功能奠定基础。     

短柄草2C 型蛋白磷酸酶基因BdPP2C2 的克隆及表达分析

从短柄草中克隆获得一个2C 型蛋白磷酸酶基因,命名为BdPP2C2。序列分析结果表明,该基因ORF 的 长度为1 368 bp。进化分析结果表明,该基因所编码的蛋白与拟南芥AtPP2C56 的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR 分析结果表明,该基因的表达显著受ABA、乙烯、双氧水3 种信号分子诱导,并且受高盐和低温胁迫诱导。这些结果 表明,BdPP2C2 是非生物逆境胁迫中的一个应答因子,并且可能受相关信号分子调控。     

二穗短柄草FRUITFULL1基因表达分析及RNA干扰和过表达载体的构建

为了揭示BdFUL1的生物学功能,利用生物信息学和分子生物学方法,分析二穗短柄草转录因子FRUITFULL1-2(BdFUL1-2)的结构、序列特征以及与不同植物AP1/FUL的亲缘关系,构建进化树。利用定量RT-PCR等分子生物学方法,分析非生物逆境和外源激素处理条件下两个转录本BdFUL1-1和BdFUL1-2的表达水平。结果表明:BdFUL1属于典型的植物MADS-box基因,与小麦的WFUL1有很近的亲缘关系;在高温、低温、干旱胁迫以及不同激素ABA、6-BA和SA处理下,BdFUL1-1的表达水平显著升高,暗示BdFUL1可能通过激素信号传导而参与响应非生物胁迫。同时,构建BdFUL1-1和BdFUL1-2的RNA干扰和过表达载体。     

三个HTA基因植物表达载体的构建及其转化鉴定

通过PCR扩增,将二穗短柄草基因Bradi1g25390(BdHTA11)、Bradi1g25400(BdHTA12)与拟南芥基因At1g54640(AtHTA14)连接到植物表达载体pBINPLUS的多克隆位点,分别构成3个重组载体pBINPLUSBdHTA11、pBINPLUS-BdHTA12和pBINPLUS-AtHTA14,载体pBINPLUS由烟草花叶病毒35s启动子启动目的基因的表达.采用农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法,将这3个基因转化到拟南芥rat5突变体中,经过筛选获取转基因植株.经半定量RT-PCR分析,初步确定目的基因已经整合到拟南芥rat5突变体基因组中并过量表达.     

短柄草14-3-3基因家族的生物信息学及表达模式研究

在短柄草基因组中共鉴定出7个14-3-3蛋白家族成员,与水稻、拟南芥14-3-3蛋白的系统进化分析发现,7个短柄草14-3-3蛋白中有1个属于ε类蛋白,其他6个属于非ε类蛋白.对短柄草14-3-3蛋白家族的序列相似性、基因结构以及蛋白结构分析发现,短柄草14-3-3蛋白序列及三维结构高度保守.RT-PCR分析显示,7个短柄草14-3-3基因在不同的组织中均表达,预示着它们在植物体内可能都具有生物学功能.     

桑树MaDFR的克隆及功能分析

【目的】克隆桑树（Morus alba L.）二氢黄酮醇4-还原酶（dihydroflavonol-4-reductase,DFR）基因,并通过烟草过表达研究其对烟草黄酮生物合成的影响,为该基因功能分析及应用提供理论参考。【方法】采用RT-PCR的方法从桑树中克隆出MaDFR,采用农杆菌介导的遗传转化技术,将MaDFR导入模式植物烟草中,获得具有卡那抗性的转基因烟草植株,通过基因组PCR鉴定转基因阳性植株,采用反向PCR的方法分析T-DNA在烟草中的插入位点。通过定量PCR的方法分析MaDFR在烟草中的表达水平,AlCl₃分光光度法测定转基因烟草中总黄酮含量,通过DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）清除能力分析总黄酮酸水解前后的抗氧化活性,最后通过高效液相色谱（HPLC）分析烟草花冠中花青素的含量及种类。【结果】从中桑5801中克隆并获得了全长为1 026 bp的MaDFR,编码341个氨基酸残基,其蛋白质具有典型的NADPH结合位点。获得7株具有卡那抗性的烟草转基因株系。分子鉴定4株为转基因阳性株系。MaDFR在转基因烟草中能够表达,但不同转基因株系之间MaDFR表达水平存在较大差异。转基因烟草叶片中总黄酮含量明显增加,其中,DFR-4和DFR-7 2个株系分别增加了30.4%和27.6%,DFR-2和DFR-5分别增加了19.8%和14.2%。抗氧化活性分析发现转基因株系叶片中未酸解总黄酮抗氧化活性存在较大差异,DFR-2、DFR-4的抗氧化能力比对照组提高了近5倍,而DFR-5和DFR-7与对照组没有显著性的差异,转基因株系叶片中总黄酮的抗氧化活性与MaDFR的表达水平具有显著的正相关性。转基因株系叶片中酸解总黄酮抗氧化活性与总黄酮的含量具有显著的正相关性。MaDFR在烟草中的过表达能够增加花冠中花青素的含量,DFR-4株系中花青素含量增加了15%,DFR-5和DFR-7 2个株系中花青素的含量增加了一倍,但转基因烟草花冠中花青素种类没有发生改变。【结论】MaDFR在烟草中的过表达能够显著增加烟草的总黄酮含量及抗氧化作用,也可以显著增加烟草花冠中花青素的含量,但不能改变花青素的种类,说明该基因在矢车菊素类花青素的生物合成代谢路径中具有重要作用。     

Host status of Brachypodium distachyon to the cereal cyst nematode

Cereal cyst nematode(Heterodera avenae, CCN) distributes worldwide and has caused severe damage to cereal crops, and a model host will greatly aid in the study of this nematode. In this research, we assessed the sensitivity of 25 inbred lines of Brachypodium distachyon to H. avenae from Beijing, China. All lines of B. distachyon were infested by secondstage juveniles(J2s) of H. avenae from Daxing District of Beijing population, but only 13 inbred lines reproduced 0.2–3 cysts/plant, showing resistance. The entire root system of the infested B. distachyon appeared smaller and the fibrous roots were shorter and less numerous. We found that a dose of 1 000 J2s of H. avenae was sufficient for nematode infestation. We showed that Koz-1 of B. distachyon could reproduce more cysts than TR2A line. Line Koz-1 also supported the complete life cycles of 5 CCN geographical populations belonging to the Ha1 or Ha3 pathotype group. Our results suggest that B. distachyon is a host for CCN.     

紫花苜蓿盐诱导类受体蛋白激酶基因MsSIK1的克隆及功能分析

【目的】对紫花苜蓿（Medicago sativa L. cv. Zhongmu-1）stress-induced protein kinase gene 1（MsSIK1）进行克隆与表达研究,了解该基因的分子机制及其应用。【方法】以紫花苜蓿叶片总RNA为模板,根据同源克隆设计简并引物,利用RT-PCR结合RACE技术,获得MsSIK1的编码序列。利用同源性比对进行序列分析。通过SMART网站（http://smart.embl-heidelberg.de/）模拟该基因的蛋白结构。构建MsSIK1的亚细胞定位瞬时表达载体,使用基因枪转化法将MsSIK1与GFP在洋葱表皮细胞中融合瞬时表达并观察其亚细胞定位荧光信号。通过Real time-PCR分析MsSIK1在NaCl、ABA和干旱处理条件下的表达特征。利用农杆菌侵染方法获得转基因拟南芥植株,通过RT-PCR对转基因植株进行表达鉴定,获得转基因植株后,利用转基因株系进行盐处理进而对成苗期转基因拟南芥性状鉴定。在盐胁迫处理下,测定野生型与转基因株系的叶绿素含量、MDA含量进而验证该基因的抗盐功能。【结果】获得MsSIK1编码序列2 478 bp,编码825个氨基酸。该蛋白C端与多种植物激酶具有相当高的同源性,模拟蛋白结构发现该基因具有类受体蛋白激酶高度保守的丝氨酸/苏氨酸结构域、跨膜结构域和富含亮氨酸重复序列的膜外结构域。Real time-PCR分析表明该基因在NaCl、ABA和干旱处理条件下上调表达,其中在盐处理条件下,MsSIK1表达先升高后降低,在处理4 h时达到最大值（约为对照值的7倍）。在干旱胁迫处理时,MsSIK1受诱导表达增强明显,当处理2 h时表达量达到最大值（约为对照值的6倍）;ABA处理时,MsSIK1被诱导表达明显,当处理3 h时表达量达到最大值,约为对照值的6.8倍。MsSIK1与GFP融合瞬时表达的洋葱表皮细胞中的荧光信号主要集中于质膜附近,转化空载体的洋葱表皮细胞中的荧光信号分布于细胞各个部位。转基因植株的RT-PCR鉴定表明,T₁代6个株系中所得到的MsSIK1条带明显、亮度高,且T₁-10中表达量最高;但在野生型中检测不到该条带,说明外源基因已经整合到拟南芥染色体中并能遗传到子代。成苗期转基因拟南芥盐处理后发现T₃-2、T₃-6、T₃-10转基因株系较野生型植株长势好,说明MsSIK1的转入提高了拟南芥的抗盐性。与对照相比,转MsSIK1拟南芥在NaCl处理下,叶绿素含量下降较少,其中,野生型叶绿素含量降低了77%,T₃-3降低了53%,T₃-6降低了44%,T₃-10降低了35%;同样盐胁迫下,3个转基因株系的MDA含量积累较少,其中,野生型MDA的含量是T₃-10株系的1.3倍。【结论】MsSIK1作为一个类受体蛋白激酶受多种逆境胁迫诱导,该基因的过量表达提高了拟南芥的抗盐性。     

紫萼玉簪查尔酮合酶基因的克隆及功能验证

查尔酮合酶是花色素生物合成过程中的关键酶.为研究玉簪查尔酮合酶基因的结构及功能,基于玉簪转录组数据库信息,利用RT-PCR的方法克隆得到紫萼玉簪查尔酮合酶基因,命名为HvCHS,构建pCAM-BIA3301-HvCHS载体,农杆菌介导法转化烟草,验证HvCHS基因功能.结果表明:HvCHS基因的ORF全长1 176 b...     

大豆水杨酸结合蛋白基因GmSABP2的克隆及功能分析

【目的】对大豆（Glycine max）水杨酸结合蛋白基因GmSABP2进行克隆与表达分析,并转化拟南芥进行耐盐、耐干旱分析,进一步了解该基因耐盐、耐干旱的分子机制。【方法】以拟南芥SABP2为探针,搜索大豆基因组数据库,从中挑选出同源性最高的序列,将其命名为GmSABP2。利用电子克隆技术,从大豆叶子中克隆得到大豆水杨酸结合蛋白基因GmSABP2。通过DNAMAN程序进行氨基酸的多序列比对,利用NCBI的CD-search进行氨基酸的保守结构域分析,应用MEGA程序进行系统进化树分析。对大豆幼苗进行盐和干旱胁迫处理来分析其在胁迫下的表型变化。通过Real time-PCR分析大豆幼苗在盐和干旱处理条件下GmSABP2的表达特性。利用Gateway技术构建植物表达载体pEarleyGate103-GmSABP2,转入根癌农杆菌EHA105,利用蘸花法侵染拟南芥,经抗性筛选得到转基因株系。对野生型植株和转基因植株进行盐和干旱胁迫处理,并统计在胁迫条件下两者的种子萌发率、主根长和成熟植株的存活率。【结果】克隆得到GmSABP2的cDNA序列,序列全长1 235 bp,其开放阅读框为786 bp,编码261个氨基酸,分子量为29.15 kD,等电点为5.58。氨基酸序列比对发现大豆和毛白杨、可可以及烟草相似度较高。利用NCBI的CD-search发现大豆SABP2序列中存在一个Abhydrolase_6（pfam：12697）水解酶保守结构域。大豆SABP2蛋白属于α/β水解酶超家族。应用MEGA程序构建多物种的系统发生树,发现大豆和毛白杨及可可亲缘关系较近,而与拟南芥亲缘关系较远。对大豆幼苗胁迫后的表型分析发现,在盐和干旱条件下大豆幼苗均受到明显的胁迫效应。Real time-PCR分析表明大豆幼苗叶子中的GmSABP2在盐和干旱处理条件下均上调表达。拟南芥耐逆性分析发现,在正常培养条件下,野生型植株和转基因株系均能正常萌发、生长。在高盐（150 mmol·L^-1 NaCl）处理条件下,野生型植株的种子萌发率为38%,12 d大小幼苗主根长为0.4 cm,成熟植株的存活率为49%;转基因株系的种子萌发率为67%,12 d大小幼苗主根长为1.1 cm,成熟植株的存活率为78%。在模拟干旱（20% PEG6000）处理条件下,野生型植株的种子萌发率为31%,12 d大小幼苗主根长为0.5 cm,成熟植株的存活率为36%;转基因株系的种子萌发率为57%,12 d大小幼苗主根长为1.0 cm,成熟植株的存活率为66%。【结论】GmSABP2在拟南芥植株对盐和干旱的抗性中有一定的作用。