结核分支杆菌Mtb8.4真核、原核表达质粒的构建与表达

低分子质量蛋白抗原Mtb8.4是一种非常重要的结核分支杆菌抗原,为了研制结核病核酸疫苗和进行结核病的诊断,分别将其构建到原核和真核载体中进行表达。以结核分支杆菌标准菌株H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增目的基因Mtb8.4,扩增产物酶切后分别克隆到真核表达载体pJW4303和原核表达载体pGEX-4T-1中,构成重组真核表达载体pJW-Mtb8.4和重组原核表达载体pGEX-Mtb8.4,用限制性内切酶消化,PCR扩增及DNA序列分析等多种方法鉴定;并将正确构建的原核表达载体转入E.coliBL21(DE3)plysS中,IPTG诱导表达。结果表明,重组真核表达载体pJW-Mtb8.4和重组原核表达载体pGEX-Mtb8.4构建成功。构建的真核重组质粒pJW-Mtb8.4即可作为结核病DNA疫苗。原核表达载体pGEX-Mtb8.4在BL21(DE3)plysS中成功表达,将表达蛋白进行纯化,作为保护性结核分支杆菌抗原以便检测DNA疫苗的免疫效果。     

绵羊肺腺瘤病毒受体透明质酸酶-2的原核表达及纯化

为建立绵羊肺腺瘤病毒(jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)受体透明质酸酶-2(Hyal-2)的原核高效表达体系,本试验设计了扩增JSRV受体Hyal-2基因的特异性引物,应用PCR技术扩增出Hyal-2全长基因,将该基因定向重组于原核表达载体pGEX-4T-1中,构建pGEX-4T-1-Hyal-2重组质粒,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,逐步优化条件至稳定表达,经Western blotting检测融合蛋白成功表达后,通过亲和层析法对融合蛋白进行纯化。结果表明,Hyal-2基因正确地插入到原核表达载体pGEX-4T-1中;经诱导含重组质粒pGEX-4T-1-Hyal-2的表达菌高效表达了带GST标签的目的蛋白;SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白分子质量为80 ku,与预期大小一致,经Western blotting验证为带GST标签的融合蛋白;通过谷胱甘肽亲和层析法获得纯化的目的蛋白。本试验结果为进一步制备Hyal-2蛋白的多克隆抗体及深入研究其功能奠定基础。     

小鹅瘟病毒VP3基因的原核表达

根据GenBank已发表的小鹅瘟病毒B株基因序列,设计并合成1对特异性引物,经PCR扩增得到了1 457 bp的目的片段,并将该片段克隆至pMD-18T simple载体中,再将其亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-VP3.经0.1 mmol/L IPTG诱导,目的蛋白在大肠杆菌中得到表达.Western-blot分析表明,该蛋白具有良好的反应原性.为开发相应的基因工程疫苗奠定了理论基础.     

瑟氏泰勒虫p33基因与牛IL-18基因的串联表达

为研究牛IL-18基因对瑟氏泰勒虫p33疫苗的免疫佐剂效应,根据GenBank上已经发表的p33基因序列和牛IL-18基因序列(IL-18)设计2对特异性引物,以瑟氏泰勒虫基因组DNA和pMD-19-T-IL-18质粒DNA为模板,采用SOE-PCR技术将2个基因连接在一起,经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切,获得1 416bp的目的基因IL-18-p33,克隆于原核表达载体pGEX-4T-1中,构建了双基因重组表达载体pGEX-4T-1-IL-18-p33,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,表达出预期大小为79 000的融合蛋白。Western blotting检测结果显示,该蛋白与瑟氏泰勒虫抗血清呈阳性反应,表明融合蛋白具有反应原性,为进一步研究IL-18对瑟氏泰勒虫p33基因疫苗的免疫佐剂效应奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SCQ株M蛋白基因截断片段原核表达载体构建及其表达的初步研究

为表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M蛋白主要抗原表位基因序列,参照GenBank中发表的PRRSV SCQ株M蛋白基因设计并合成一对特异性引物,通过PCR方法从重组质粒pMD18-T-M扩增得到缺失N端跨膜区的M蛋白基因片段dM(deleting M),将其与pMD19-T simple vector连接,经测序正确后克隆至高效原核表达载体pGEX-4T-1,得到重组表达载体pGEX-4T-1-dM,并将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG于37℃诱导,PRRSV M基因获得表达。经SDS-PAGE分析,所表达的融合蛋白分子量约为35 kDa。以纯化的重组蛋白作为抗原,经Western Blot分析结果表明该重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别,可用于PRRSV的检测。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SGQ株M蛋白基因截断片段原核表达载体构建及其表达的初步研究

为表达猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）M蛋白主要抗原表位基因序列,参照GenBank中发表的PRRSVSCQ株M蛋白基因设计并合成一对特异性引物,通过PCR方法从重组质粒pMD18-T-M扩增得到缺失N端跨膜区的M蛋白基因片段dM（deletingM）,将其与pMD19-Tsimplevector连接,经测序正确后克隆至高效原核表达载体pGEX-4T-1,得到重组表达载体pGEX-4T-1-dM,并将其转化大肠杆菌Rosetta（DE3）,经IPTG于37℃诱导,PRRSVM基因获得表达。经SDS-PAGE分析,所表达的融合蛋白分子量约为35kDa。以纯化的重组蛋白作为抗原,经WesternBlot分析结果表明该重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别,可用于PRRSV的检测。     

西尼罗病毒糖蛋白第三结构域的原核表达及鉴定

根据西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)序列设计1对特异性引物,用PCR反应扩增糖蛋白第三结构域(WNVEDⅢ)基因,将PCR产物克隆至pGEX-4T-1原核表达载体上,获得重组表达质粒,将该质粒转化入E.coli DH5α,命名为pG-EDⅢ,鉴定正确后转入transetta表达菌中,经IPTG诱导后纯化重组蛋白,通过SDS-PAGE和Western-blot方法证实WNV-EDⅢ基因可在大肠杆菌中高效表达,小鼠免疫试验证明该原核表达蛋白有良好的免疫原性。     

猪生长分化因子11的原核表达及抗体制备

本研究旨在获得猪GDF-11的特异性抗体,以便于进一步研究猪GDF-11的功能.对猪GDF-11的编码区进行了克隆、表达载体的构建和转化、原核诱导表达和纯化以及将GDF-11注射到小鼠中并分离抗体.从猪胚肾中分离总RNA,经RT-PCR扩增得到猪GDF-11基因的编码区,插入pMD18-T载体中.再经限制性内切酶BarnH Ⅰ和EcoRⅠ双酶切,将回收的GDF-11酶切片段插入原核表达载体pGEX-4T-2中,获得重组原核表达质粒pGEX-4T-2-GDF-11.重组质粒经测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3),并经IPTG诱导产生了65 ku的GST-GDF-11融合蛋白.融合蛋白经凝血酶酶切,分离纯化出42 ku左右的GDF-11蛋白;然后注射小鼠,制备了多克隆抗体,其滴度最高可达1:25 600,而且特异性好,表明得到了猪GDF-11的多克隆抗体.     

梅花鹿鹿茸表皮生长因子基因原核表达载体的构建及鉴定

通过T-A克隆技术,成功地构建了克隆载体pMD-18T-EGF,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切克隆质粒pMD-18T-EGF后,回收EGF基因,并将此基因定向克隆至相同双酶切回收后的pET32a原核表达载体中,获得重组质粒pET32a-EGF。经限制性内切酶分析和PCR鉴定,结果表明:成功地构建了原核重组质粒。     

E种肠道病毒HY12毒株非结构蛋白3C单克隆抗体的制备与鉴定

为了研究国内分离的首株E种肠道病毒HY12毒株的非结构蛋白3C的功能,本研究以设计合成非结构蛋白3C的特异性引物,PCR扩增出3C的基因片段,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒.将构建的阳性质粒转化到大肠杆菌菌株BL21中,以IPTG诱导表达3C重组蛋白及应用尿素纯化包涵体的方法纯化重组蛋白...