结核分枝杆菌Rv2626c蛋白对RAW264.7细胞凋亡的影响

试验旨在研究结核分枝杆菌Rv2626c蛋白对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞凋亡的影响。根据GenBank数据库中结核分枝杆菌Rv2626c基因序列设计引物,并以结核分枝杆菌国际标准株H37Rv cDNA为模板,PCR扩增Rv2626c基因并克隆至慢病毒表达载体pLEX-EGFP中,包装慢病毒并感染RAW264.7细胞,使用Western blotting和流式细胞仪技术检测Rv2626c蛋白表达水平和RAW264.7细胞凋亡率变化。结果显示,成功构建慢病毒表达载体pLEX-EGFP-Rv2626c;成功包装慢病毒并感染RAW264.7细胞;Rv2626c蛋白在RAW264.7细胞中高水平表达显著促进了细胞凋亡。本试验结果表明,在RAW264.7细胞中过表达结核分枝杆菌Rv2626c蛋白能显著性增加其凋亡水平。     

VDAC1参与调控BCG感染RAW264.7细胞凋亡

旨在研究电压依赖性阴离子通道(voltage dependent anion channel1,VDAC1)对卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin, BCG)诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7凋亡的调控作用及其机制。设计并合成VDAC1的小干扰RNA(si-VDAC1)转染小鼠巨噬细胞RAW264.7后,再用BCG感染。后续采用MTT法检测RAW264.7细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率、线粒体膜电位及细胞内ROS水平,进而通过实时荧光定量PCR和Western blot检测凋亡相关因子Cyt C、Caspase-3、PARP1、Caspase-9基因(mRNA)及其蛋白的表达。随后,通过使用VDAC1寡聚抑制剂VBIT-4对RAW264.7进行孵育2 h后感染BCG,并采用免疫荧光染色技术观察Caspase-3和Western blot检测凋亡相关因子Cyt C、Cleaved-Caspase 3、Cleaved-PARP1、Cleaved-Caspase 9的含量变化。BCG感染巨噬细胞12 h后,与对照相比,BCG感染后小鼠巨噬细胞存活率约下降至50%,而...     

结核分枝杆菌溶血磷脂酶对RAW264.7细胞因子及细胞凋亡的影响

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病,中国是结核疫情非常严重的国家之一,发病率排名世界第二,占全球所有结核病例的15%左右。结核分枝杆菌是典型的胞内寄生菌,其脂类含量占细胞壁干重的60%。研究发现,许多脂类都与结核分枝杆菌的致病性和病原性相关,如索状因子（pac A基因）[1]可以破坏细胞线粒体膜,影响细胞呼吸,抑制白细胞游走和引起慢性肉芽肿;磷脂不但能促使单核细胞增生,而且还能抑制蛋白酶对组织的分解,使病灶组织溶解不完全,形成千酪样坏死,引起结核性病变,最终形成结核结节。     

布鲁氏菌OMP16对RAW264.7细胞凋亡与免疫活性的影响

旨在研究布鲁氏菌外膜蛋白OMP16对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞凋亡和免疫活性的影响及其机制探讨。以OMP16处理RAW264.7细胞为模型,通过MTT以及Hoechst法检测OMP16对细胞活力的影响,通过Western blot检测Caspase-3、GRP78、CHOP的表达情况,流式细胞术检测OMP16对细胞凋亡的影响以及RT-PCR检测免疫因子IL-1β、IL-6和TNF-α的变化。结果表明,OMP16能够影响RAW264.7细胞的活力,且有浓度依赖性;添加OMP16后能够显著增加凋亡标志因子Caspase-3的表达（P<0.001）,并促进RAW264.7细胞的凋亡;作用24、36 h之后,显著引起内质网应激标志蛋白GRP78、CHOP的表达;并且能显著上调IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子的mRNA表达水平。布鲁氏菌OMP16能够诱导RAW264.7凋亡,OMP16显著引起内质网应激CHOP通路的激活。     

牛磺鹅去氧胆酸对小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞凋亡的影响

为了探讨牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA）对小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7的抗凋亡作用,试验采用二苯胺法及实时荧光定量PCR技术分别检测了针对RAW264.7细胞凋亡百分率及凋亡抑制蛋白CIAP-1、CIAP-2和XIAP的mRNA表达影响。结果显示,剂量为0.05、0.10和10 μg/mL TCDCA可以极显著地对抗地塞米松（DEX）诱导的RAW264.7细胞系凋亡（P < 0.01）。1 μg/mL TCDCA对正常RAW264.7细胞系CIAP-1和XIAP表达有显著的促进作用（P < 0.05）;10 μg/mL TCDCA对正常RAW264.7细胞系CIAP-1、CIAP-2和 XIAP表达均具有显著的促进作用（P < 0.05）。TCDCA给药后对DEX诱导的RAW264.7细胞系CIAP-1、CIAP-2和 XIAP表达均具有极显著的促进作用（P < 0.01）,但不同给药剂量的TCDCA作用有所差异。以上研究结果表明,TCDCA具有对抗DEX诱导的小鼠巨噬细胞系RAW264.7凋亡作用,且与上调凋亡抑制蛋白mRNA表达有关。     

结核分枝杆菌Rv2626c蛋白对RAW264.7细胞凋亡的影响

试验旨在研究结核分枝杆菌Rv2626c蛋白对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞凋亡的影响。根据GenBank数据库中结核分枝杆菌Rv2626c基因序列设计引物,并以结核分枝杆菌国际标准株H37Rv cDNA为模板,PCR扩增Rv2626c基因并克隆至慢病毒表达载体pLEX-EGFP中,包装慢病毒并感染RAW264.7细胞,使用Western blotting和流式细胞仪技术检测Rv2626c蛋白表达水平和RAW264.7细胞凋亡率变化。结果显示,成功构建慢病毒表达载体pLEX-EGFP-Rv2626c;成功包装慢病毒并感染RAW264.7细胞;Rv2626c蛋白在RAW264.7细胞中高水平表达显著促进了细胞凋亡。本试验结果表明,在RAW264.7细胞中过表达结核分枝杆菌Rv2626c蛋白能显著性增加其凋亡水平。     

太子参参须多糖对RAW264.7细胞免疫调节作用的研究

为研究太子参参须多糖(RPFRP)对小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7细胞)的免疫调节作用及作用机制,本研究利用MTT法检测不同浓度RPFRP作用下的RAW264.7细胞的增殖情况,筛选出RPFRP的适宜浓度为25μg/mL～400μg/m L。将25μg/mL～400μg/m L RPFRP作用于RAW264.7细胞并于不同时间后收获细胞培养物或上清液进行后续试验。采用中性红法检测不同浓度RPFRP作用下的RAW264.7细胞的吞噬活性,结果显示：RPFRP可极显著提高RAW264.7细胞吞噬活性(P<0.01),且该吞噬活性在PRFRP浓度为25μg/mL～200μg/mL时呈剂量依赖式升高;Griess法检测RAW264.7细胞的NO产生量,结果显示：RAW264.7细胞上清液中NO含量显著升高(P<0.05),且呈RPFRP剂量依赖式升高;ELISA法检测RAW264.7细胞的白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β (IL-1β)、白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量,结果显示：与空白对照组相比,RPFRP处理的RAW264.7细...     

不同毒力结核分支杆菌感染RAW264.7巨噬细胞不同时间细胞因子转录水平标准曲线的建立及应用

为检测不同毒力结核分枝杆菌感染巨噬细胞后细胞因子转录水平的变化,构建IL-6、IL-10、TNF-α重组标准质粒,建立了实时荧光定量PCR标准曲线。应用该方法对不同毒力结核分枝杆菌感染RAW264.7巨噬细胞6个时间点细胞因子的转录水平进行分析,结果显示H37Rv组、BCG组相比于对照组刺激后均使三种细胞因子的转录水平发生变化,其中IL-6和TNF-α发生明显变化。本试验通过对不同时间点细胞因子转录水平研究的分析为结核分枝杆菌对巨噬细胞凋亡机制的研究提供新思路。     

牦牛lncRNA ENSBGRT00000000387.1慢病毒载体构建及其对卵泡GCs凋亡的影响

旨在构建牦牛lncRNA ENSBGRT00000000387.1过表达慢病毒载体,并将其感染牦牛卵泡颗粒细胞(granulosa cells, GCs),了解它对细胞凋亡的影响。本研究提取牦牛卵泡RNA,以RT-PCR技术扩增lncRNA ENSBGRT00000000387.1全长序列,而后构建其重组质粒,并以慢病毒包装系统(pVSVG:pMDL:pRev)包装后利用qPCR法测定在293T细胞上的感染滴度,再感染分离培养的牦牛GCs,以qPCR检测GCs中lncRNA ENSBGRT00000000387.1的表达水平,并以流式细胞仪检测GCs的凋亡率,以Western blot和qPCR分别检测促凋亡基因CASPASE3、BAX和抑凋亡基因BCL-2的mRNA和蛋白表达水平。结果显示,由牦牛卵泡中成功扩增出lncRNA ENSBGRT00000000387.1的全长2 566 bp序列,将其与LV-EF1a-EGFP-2A载体同源区的片段同源重组,经酶切鉴定及测序验证表明成功构建了重组质粒,将之经慢病毒包装系统包装和浓缩后,在293T细胞的感染效率达(75.77±0.850)%...     

AEE对RAW264.7细胞中iNOS表达及NO合成的影响

为了探讨阿司匹林丁香酚酯(AEE)对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的RAW264.7细胞中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达及一氧化氮(NO)合成的影响,试验首先采用CCK-8法检测细胞存活率,采用油红O染色法观察细胞内脂滴形成情况,采用实时荧光定量PCR扩增、免疫荧光技术和Western-blot技术测定iNOS mRNA和蛋白的相对表达量,最后通过硝酸盐还原酶测定法测定NO含量。结果表明：AEE和ox-LDL对RAW264.7细胞没有毒性。利用80μg/mL的ox-LDL可成功诱导RAW264.7细胞泡沫化,建立泡沫细胞模型,并且AEE可明显抑制细胞内脂滴的形成。ox-LDL可极显著上调细胞中iNOS mRNA及蛋白的相对表达量(P<0.01),并且极显著增加了细胞内NO含量(P<0.01)。经AEE预处理的RAW264.7细胞中iNOS mRNA及蛋白相对表达量显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01),细胞内NO含量也极显著减少(P<0.01)。说明AEE可通过抑制iNOS的表达降低NO的合成,缓解RAW264.7细胞泡沫化,进而发挥抗...     

羊口疮病毒感染对巨噬细胞RAW264.7凋亡的影响

羊口疮(Orf)是由羊口疮病毒(ORFV) 引起的一种急性、接触性和高度嗜上皮性人畜共患的动物传染病,主要感染绵羊和山羊,有时威胁人类。本研究将ORFV(OV/HLJ/04株)纯化后作为试验材料,采用巨噬细胞系RAW264.7作为病毒细胞宿主,RAW264.7在LPS体外激活的情况下,接种ORFV,研究ORFV感染对巨噬细胞凋亡的影响。结果表明,用LPS处理的试验组巨噬细胞形态学改变较大,凋亡量也较大;而没用LPS处理过的试验组巨噬细胞变化则相对较少。Western blotting研究结果显示,细胞凋亡信号Caspase-3与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)在24 h时对比,凋亡信号明显减弱,表明在24 h的巨噬细胞凋亡水平有所下降。     

重组UBC13对RAW264.7炎症因子mRNA表达的影响

为了研究重组蛋白UBC13对RAW264.7小鼠巨噬细胞炎症因子mRNA表达量的影响,采用噻唑蓝(MTT)法检测UBC13对RAW264.7细胞活力的影响,qPCR法检测不同浓度UBC13(20、10、5μg/mL)在不同时间点(3、6、9、12、24h)对RAW264.7细胞产生的IL-6、IL-1β、TNF-α和COX-2 4种炎症因子mRNA表达量的影响。结果表明,在整个试验时间范围内IL-6、IL-1β、TNF-α和COX-2mRNA表达量呈现逐步降低的趋势;与细胞对照组组相比,在24h时IL-6、IL-1β、TNF-α和COX-2mRNA表达量显著降低(P0.05)。说明重组蛋白UBC13作用于RAW264.7细胞24h时能够明显抑制RAW264.7细胞中IL-6、IL-1β、TNF-α和COX-2的mRNA表达,并且具有药物剂量依赖性。     

结核分支杆菌Rv3117基因的克隆与原核表达

以结核分支杆菌H37Rv株染色体DNA为模板,应用Rv3117基因特异性引物对该基因进行PCR扩增,获得约800bp的DNA片段。将PCR纯化产物克隆至pMD-18T Vector中,构建出重组质粒pMD-18T-Rv3117。以EcoRⅠ和SamⅠ双酶切pMD-18T-Rv3117重组载体和pGEX-4T-1原核表达载体,并将纯化的Rv3117基因亚克隆至pGEX-4T-1中,构建出原核重组表达质粒pGEX-4T-1-Rv3117。将pGEX-4T-1-Rv3117重组质粒转化至感受态E.coli BL21中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约30ku目的蛋白带。Western blot分析结果显示,该蛋白能与抗结核分支杆菌阳性血清发生特异性反应。研究结果为结核病临床诊断抗原的筛选奠定了基础。     

泛素相关修饰蛋白SUMO-2对RAW264.7细胞内布鲁氏菌16M存活的影响

为探究泛素相关修饰蛋白SUMO-2对布鲁氏菌16M的影响,本试验构建了SUMO-2基因干扰和过表达小鼠巨噬细胞RAW264.7模型,并用布鲁氏菌16M进行侵染。参照GenBank中SUMO-2基因序列设计特异性干扰片段和过表达引物,克隆成功后连接至相应的慢病毒载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,选取阳性克隆菌提取质粒转染HEK-293FT细胞,将重组的慢病毒感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,利用布鲁氏菌16M分别侵染构建成功的干扰和过表达细胞模型。通过实时荧光定量PCR检测SUMO-2 mRNA的转录水平,Western blotting检测SUMO-2蛋白的表达,ELISA检测IFN-γ和TNF-α水平,菌落计数来确定布鲁氏菌在细胞中的存活能力。结果显示,与对照组相比,干扰组SUMO-2 mRNA水平极显著降低（P<0.01）,过表达组SUMO-2 mRNA水平极显著升高（P<0.01）,成功构建了SUMO-2干扰和过表达细胞模型。Western blotting结果显示,布鲁氏菌16M感染能以时间依赖的方式下调SUMO-2蛋白的表达。经菌落计数后发现,SUMO-2过表达后布鲁氏菌的数量极显著减少（P<0.01）,抑制布鲁氏菌16M的细胞内繁殖。而SUMO-2干扰后布鲁氏菌的数量显著或极显著增加（P<0.05;P<0.01）,促进布鲁氏菌16M的细胞内繁殖。同时,经SUMO-2过表达后,IFN-γ和TNF-α水平极显著升高（P<0.01）。经SUMO-2干扰后,TNF-α水平显著降低（P<0.05）,IFN-γ水平极显著降低（P<0.01）,SUMO-2在RAW264.7细胞中的表达变化也影响IFN-γ和TNF-α的产生。综上所述,SUMO-2蛋白在布鲁氏菌胞内存活中起着重要作用,可能有助于阐明布鲁氏菌感染的致病机制。     

猴头菇多糖对MDRV感染RAW264.7细胞TLR3/TRIF诱导表达及病毒复制的影响

试验旨在探究猴头菇多糖（HEP）预处理RAW264.7细胞对番鸭呼肠孤病毒（MDRV）复制的影响及其机制,从Toll样受体3/β干扰素TIR结构域衔接蛋白（TLR3/TRIF）信号通路解析HEP在调节MDRV所致的雏番鸭机体免疫抑制中的作用机制并提供体外试验参考。试验设空白对照组（BCG）、病毒感染对照组（VCG）、HEP对照组（HCG）和HEP预防病毒感染组（HPG）,RAW264.7细胞在MDRV感染12和24 h后,通过Western blotting检测各组细胞中TLR3、TRIF和肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）的蛋白表达量;病毒感染24 h后,用ELISA法检测各组细胞培养液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-10（IL-10）、IL-6、IL-1β、干扰素-β（IFN-β）的含量。TCID₅₀检测结果表明,MDRV病毒的TCID₅₀为10^3.46。病毒感染后12 h,细胞未出现明显变化;病毒感染后24 h,细胞变圆;病毒感染后36 h,细胞大量死亡。MDRV在RAW264.7细胞中的复制结果显示,在感染病毒12~24 h内,σNS的表达量呈现上升趋势;在24~36 h,σNS的表达量维持在较高水平。Western blotting结果显示,与空白对照组相比,VCG组细胞TLR3、TRIF和TRAF6蛋白的表达量在感染后12和24 h均显著升高（P<0.05）,HCG组TRIF蛋白的表达量均显著升高（P<0.05）;与感染组相比,HPG组的σNS、TLR3、TRIF和TRAF6蛋白表达量在病毒感染12和24 h均显著降低（P<0.05）。ELISA检测结果显示,与空白对照组相比,VCG组细胞培养液中TNF-α、IL-6、IL-1β和IFN-β的含量均显著升高（P<0.05）;与感染组相比,HPG组细胞培养液中TNF-α、IL-6、IL-1β含量均显著降低（P<0.05）,IFN-β的含量显著升高（P<0.05）。结果表明,HEP可调节MDRV感染诱导RAW264.7细胞TLR3信号转导通路活化,抑制TLR3信号转导通路下游产物TNF-α、IL-10、IL-6和IL-1β的过度表达,同时上调IFN-β的表达,从而抑制MDRV在RAW264.7细胞中的复制。     

结核分枝杆菌Rv1400c多抗制备及反应原性分析

将pET28b-Rv1400c重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,筛选出阳性菌株并增菌培养后IPTG诱导表达,离心后沉淀用SKL变性溶解,用亲和层吸树脂纯化Rv1400c蛋白,通过SDS-PAGE和Western-blot分析目的蛋白表达与纯化情况;利用Rv1400c蛋白免疫新西兰兔,制备多克隆抗体;Western-blot分析鹿结核阳性血清的反应情况。SDS-PAGE和Western-blot结果显示:Rv1400c以包涵体形式表达,蛋白分子质量为39 ku;目的蛋白免疫新西兰兔后,ELISA检测血清效价达到1∶51 200。纯化的Rv1400c重组抗原蛋白能与鹿的阳性血清发生体外结合反应。     

TLRs介导的信号通路在马链球菌感染RAW264.7细胞中的作用

为探究Toll样受体(TLRs)介导的信号通路在马链球菌马亚种(S.equi)感染小鼠巨噬细胞RAW264.7中的作用,收集S.equi感染后不同时间点的RAW264.7细胞,提取总RNA并反转录成cDNA,利用实时荧光定量PCR技术检测细胞Toll样受体1、2、6(TLR1、TLR2、TLR6)、接头蛋白骨髓分化蛋白88(MyD88)及细胞因子IL-1、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-αmRNA的表达情况。结果显示,S.equi感染RAW264.7细胞后6h时,TLR1、TLR2、TLR6与MyD88mRNA水平均较对照组没有显著差异(P>0.05);感染后12h时,TLR1、TLR2和TLR6mRNA表达量未出现明显上升(P>0.05),而MyD88mRNA水平极显著升高(P<0.01);感染后24h时,TLR1、TLR2和TLR6mRNA表达水平出现极显著升高(P<0.01),MyD88mRNA表达没有显著变化(P>0.05),且IL-10和IL-12mRNA水平与对照组相比极显著升高(P<0.01),IL-1、IL-6和TNF-αmRNA水平均极显著下降(P<0.01)。结果表明,TLRs介导的信号通路参与S.equi感染RAW264.7细胞的免疫应答反应。     

BCG诱导RAW264.7细胞脂肪酸氧化对细胞自噬和促炎因子表达的调控作用

旨在探究脂肪酸氧化（fatty acid oxidation,FAO）对BCG介导的RAW264.7细胞自噬和促炎因子表达的调控作用。用BODIPY染色和游离脂肪酸定量试剂盒检测BCG感染后RAW264.7细胞中脂滴聚集情况以及脂肪酸含量;Western blot检测BCG感染对肉毒碱棕榈酰基转移酶1A （CPT-1A）表达的影响;Etomoxir （100 μmol·L^-1）预处理细胞2 h后,BCG感染细胞6 h,检测RAW264.7细胞中BCG存留量,并用Western blot方法检测自噬相关蛋白（Beclin1、LC3-II）和溶酶体蛋白（Rab7）的表达情况;用免疫荧光方法和mRFP-GFP-LC3荧光双标腺病毒分别检测自噬小体聚集和自噬流;荧光定量PCR和ELISA分别检测促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表达情况以及在细胞培养上清中的含量。结果显示,BCG感染促进RAW264.7细胞中脂滴聚集和CPT-1A的表达,而游离脂肪酸含量降低;Etomoxir预处理抑制了细胞中BCG存活,并上调了Beclin1、LC3-II和Rab7表达,且细胞中出现大量自噬小体聚集,自噬流增强,却抑制了促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表达与分泌。综上表明,抑制FAO可促进BCG感染诱导的RAW264.7细胞自噬,并抑制BCG感染引起的炎症反应。