大肠埃希氏细菌中ESBLs耐药质粒的传播与消除研究

【目的】研究大肠埃希氏细菌中超广谱β-内酰胺酶(Extended-spectrumβ-lactamases,ESBLs)耐药质粒的传播及氯丙嗪对其的消除效果。【方法】采集河南开封和安阳疑似大肠埃希氏细菌病病死鸡、猪典型病料,经细菌学检验后,用试管二倍稀释法测定头孢噻呋和头孢曲松对致病性大肠埃希氏细菌的最小抑菌浓度(MIC),用双纸片协同法和PCR扩增法进行ESBLs检测。以安阳猪和开封鸡大肠埃希氏细菌作供体菌、DH5α为受体菌,进行ESBLs耐药质粒的接合传递试验。用氯丙嗪作消除剂,以SDS为对照,对大肠埃希氏细菌分离株ESBLs耐药质粒进行消除试验。【结果】从疑似大肠埃希氏细菌典型病料中分离到了大肠埃希氏细菌;头孢噻呋和头孢曲松对分离菌株的最小抑菌浓度分别为32~64和64~128μg/mL;检测到了ESBLs耐药质粒的存在,且其能在大肠埃希氏细菌间传播,氯丙嗪对其第12次的消除率高达98.83%。【结论】ESBLs耐药质粒可通过接合转移方式传递至感受态大肠埃希氏细菌中,氯丙嗪对其消除效果很好。     

畜禽源大肠杆菌质粒介导β-内酰胺酶检测及其耐药基因特性研究

为探讨畜禽源大肠杆菌临床菌株产β-内酰胺酶及其基因特性,采用常规检测法检测菌株产β-内酰胺酶情况,PCR法检测ESBLs、AmpC基因型,质粒结合转移试验研究耐药基因分子传播机制,并使用微量肉汤稀释法检测供体菌及接合子的药物敏感性。结果显示:467株食品动物源大肠杆菌未检出产碳青霉烯酶和金属β-内酰胺酶,产ESBLs和AmpC分别达36.83%和13.70%;176株产β-内酰胺酶菌株检出blaTEM、blaCTX-M、blaOXA、blaCIT和blaDHA分别为84.09%、60.80%、14.77%、35.80%和1.70%;本次质粒转移率为50%,多数转化子获得了供体菌的耐药性及耐药基因。以上结果说明,产ESBLs、AmpC菌株广泛存在于本次检测菌株中,blaTEM、blaCTX-M和blaCIT是β-内酰胺酶基因主要流行基因型,质粒在β-内酰胺酶基因的水平传播起主要作用。     

河南省鸡致病性大肠杆菌耐药性质粒的研究

对河南省32个县市的93株鸡致病性大肠杆菌进行耐药性质粒的分析,并对其中12株100%耐庆大霉素(GM)的菌株进行耐药质粒的转化试验,成功获取了2个转化子。质粒检测结果表明:93株鸡致病性大肠杆菌可以分为49种质粒图谱类型,质粒电泳条带最多6条,最少1条,其中质粒图谱为1条条带的菌株占测试菌株的45.16%;同一地区、同一鸡场菌株的质粒图谱相同或相似,不同地区菌株的质粒图谱不同,但它们之间会有相同或相近的少量流行质粒存在。质粒转化结果表明:同一质粒可编码1个至数个抗药性基因,不同质粒可以携带相同或不同的抗性基因,证明了质粒可以传递多种耐药性,细菌的抗药性与抗药性质粒的转移有很大关系。     

宠物源大肠杆菌中质粒介导喹诺酮类耐药基因qnrD的研究

 【目的】对临床分离的宠物源大肠杆菌进行质粒介导喹诺酮类耐药基因qnrD的检测,并对该基因进行序列分析和传播机制的研究。【方法】采用微量稀释法对阳性菌株进行15种抗生素的最小抑菌浓度试验;通过PCR对基因克隆,并对克隆产物和菌株阳性质粒进行转化;同时对菌株进行接合转移试验。【结果】从164株宠物源大肠杆菌中检测出1株qnrD阳性菌株(GP2009-036),GP2009-036对14种兽医临床常用抗生素耐药严重,表现为多重耐药(14耐);PCR产物经连接PMD19-T载体后可转化入DH5α感受态细胞中;接合转移试验成功地将质粒转移到大肠杆菌J53中;可从GP2009-036与其转化子中抽提出阳性质粒。【结论】该qnrD阳性菌株对临床常用抗生素耐药严重,且阳性质粒可在病原微生物间进行水平传播,其水平传播机制可能使该基因在宠物临床上进行传播。     

菊欧氏杆菌细菌素基因的鉴别及探针的建构

放射自显影结果表明,质粒pZJ25::Tn5与Tn5诱变的不产细菌素的菊欧氏杆菌质拉DNA有同源杂交带,并且这些突变体的质粒分别能通过转化或接合转移到不产细菌素的去质粒菌株和大肠杆菌,得到抗卡那霉素的转化子和接合子。这证明转座子Tn5插入在质粒pWZ12产细菌素有关的基因上。 通过DNA重组的方法建构了一个分子量约为10.2Kb的细菌素探针质粒,pBR1210。它与质粒pWZ12有专一性的同源杂交带。     

噬菌体在环境耐药基因转移中的作用综述

耐药细菌随着畜禽粪便排出体外后,其携带的耐药基因可以通过质粒、转座子、整合子等可移动元件传递给其他环境微生物,从而导致耐药基因的传播和扩散。目前对耐药基因转移机制的研究多集中在质粒、转座子、整合子等,对噬菌体在耐药基因传播中的贡献了解甚少。在河流、海洋、污水等自然环境中通过噬菌体转导机制进行基因转移已经被证实,噬菌体作为可移动元件在基因转移和基因重组中的作用频率比人们预想的要高。为了能正确认识噬菌体在畜禽粪便抗生素耐药基因水平传播中的作用,结合国内外相关研究,介绍环境噬菌体的特性及其生态分布、环境噬菌体携带耐药基因情况、噬菌体介导的基因转移机制以及噬菌体在抗生素耐药基因传播中的作用,以期为了解环境噬菌体在耐药基因水平转移中的作用提供参考。     

侧孢短芽孢杆菌S62-9抗菌肽基因的初步定位

侧孢短芽孢杆菌S62-9可以产生高效广谱抑菌活性的细菌肽,为了确定该抗菌肽基因的遗传定位,本研究采用质粒消除和质粒转化进行正反论证。结果发现,电击法消除S62-9菌株的野生质粒pBLS62后,其突变株抑菌活性消失,而且对S62-9细菌肽的敏感性大大增强;而野生质粒pBLS62导入没有抑菌活性的枯草芽孢杆菌Wb800中,转化子Z4产生了抑菌活性,而且RP-HPLC结果表明Z4表达的抗菌物质与原始菌株S62-9抗菌肽为同一产物。从质粒消除和质粒转化与由此带来的表观性状的关系上,可以推断,侧孢短芽孢杆菌S62-9细菌肽及其免疫相关基因位于质粒而不是染色体上。     

碳青霉烯类耐药基因快速传播机制研究获重要进展

<正>近日,中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物细菌病创新团队首次发现了产金属β-内酰胺酶猪源阴沟肠杆菌,并揭示了复制子不相容Inc HI2型接合转移质粒p IMP-4-EC62是介导耐药基因快速传播的主要原因。研究结果已在线发表《抗生素与化学治疗杂志》上。     

动物源细菌质粒介导的氟喹诺酮药物耐药性研究进展

质粒介导的氟喹诺酮药物耐药机制可加重许多革兰氏阴性细菌对氟喹诺酮药物耐药性,并可在细菌之间进行水平传播,现已成为临床用药的重大难题。综述了质粒介导的氟喹诺酮药物耐药性的发现过程、耐药机制、兽医临床分布、遗传背景及扩散等,以期为该类耐药机制的研究提供参考。     

猪、鸡大肠杆菌ESBLs的基因型检测

【目的】检测致病性大肠埃希氏菌中超广谱β-内酰胺酶(Extendβ-lactamase,ESBLs)的基因型,指导兽医临床合理用药。【方法】对产生ESBL的5株致病性大肠埃希氏菌,设计并合成TEM-1和SHV-1两对引物,用PCR方法进行了ESBLs耐药质粒的DNA扩增、测序和基因型分析【结果】以产生ESBLs细菌的ESBLs耐药质粒为模板均扩增出了与预期片段大小相符的TEM型ESBL产物,但都没有扩出SHV型ESBL产物。【结论】结果提示国内畜禽产生ESBLs的致病性大肠埃希氏菌未通过质粒进行细菌间耐药基因的交换;ESBLs的产生与动物种属没有关系;为克服细菌的该类耐药性问题,应该进行头孢噻呋复方制剂的研究。     

转座子Tn5诱导菊欧氏杆菌产细菌素菌株突变的研究

通过接合的方法将转座手Tn5从供体菌(Escherichia coli s17/pZJ25t:∶Tn5)转移到菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)产细菌素菌株EchB3上。平板LB上的接合频率约为0.8×10~(-8)/每个受体细胞,而滤膜上的接合频率为0.3×10~(-7)/每个受体细胞。2200个接合子只带有转座子Tn5的卡那霉素(km)抗性标记,而没有载体上的氮霉素(Cm)抗性标记,也没有检测到载体质粒。试验证明供体菌中的载体质粒(pZJ25)不能在EchB3中复制表达。因此供体菌株是对菊欧氏杆菌基因分析的良好工具。从2200个接合子中提取全DNA和质粒DNA转化到去质粒的菊欧氏杆菌菌株EchB3rcl,能得到恢复产细菌素的转化子,从而进一步肯定了菊欧氏杆菌EchB3中的质粒在产细菌素中的作用。     

嗜水气单胞菌江西地区分离株耐药性及耐药质粒分析

为了解江西地区水产动物中嗜水气单胞菌的耐药性,从江西部分地区分离到52株嗜水气单胞菌,对其进行耐药性试验及耐药质粒抽提,绘制江西地区嗜水气单胞菌的耐药谱及耐药质粒指纹图谱,并将其对比分析.结果52株嗜水气单胞菌对19种抗生素呈现出不同程度的耐药性,其中阿莫西林耐药率为94％,青霉素耐药率为96％,利福平耐药率为62％,林可霉素耐药率为63％,甲氧嘧啶耐药率为75％.质粒提取结果发现52株细菌中有14株菌携带耐药1条～9条不等的质粒电泳条带,菌株提取到质粒的概率为26.93％.耐药质粒指纹图谱显示其质粒谱型可分为14种,每株菌都含有大小和数量不等的质粒,分析表明嗜水气单胞菌耐药性与质粒无明显的直接关系,但来源相同,耐药类型相似,质粒图谱也相似.     

CTX-M型超广谱β-内酰胺酶研究进展

产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)是细菌对β-内酰胺类抗生素最重要的耐药机制。近年来,随着抗菌药物尤其是头孢菌素类药物在临床的广泛应用,CTX-M型ESBLs菌株的蔓延势头愈发强劲,在许多国家和地区流行与传播,逐渐成为ESBLs流行的主要类型,给人类和动物的健康带来了很大威胁。鉴于此,就近年来CTX-M型ESBLs的发现、种类、生化特性、流行特点及治疗措施等方面进行综述,并对CTX-M型ESBLs基因的突变、转移及与之相关的转位因子、基因转移的遗传背景等方面进行综述,以期为产酶多重耐药菌的控制提供参考。     

广东地区鱼源大肠埃希菌ESBLs和PMQR流行分布调查

从广东地区食用鱼肠道分离鉴定了218株大肠埃希菌,用琼脂稀释法测定218株大肠埃希菌对17种抗菌药物的敏感性,并用PCR方法调查ESBLs和PMQR基因的流行分布情况.对10株β-内酰胺酶(包括ESBLs)和/或PMQR阳性菌株进行了接合转移试验,探讨ESBLs和PMQR基因的传播机制.敏感性测定结果显示:218株大肠埃希菌对17种抗菌药物的耐药率为0.5%～72.5%.在112株氨苄西林耐药菌株中,检测出2种ESBLs基因,分别为blaCTX-M-79和blaCTX-M-14,2株菌中还检测到β-内酰胺酶基因blaLEN-4和blaLEN-17.在80株环丙沙星耐药菌株中,检测到59株为PMQR阳性,分别为qnrB(33株),qnrD(5株),qnrS(21株),aac(6’)-Ib-cr(6株).接合转移试验结果表明,ESBLs和/或PMQR基因可同时存在于一个质粒上进行转移.     

肠杆菌的耐药酶检测及分析

目的:研究临床分离的肠杆菌产酶耐药情况,以指导临床合理用药.方法:按全国临床操作规程进行菌株分离鉴定,以Nifrocefin法检测β-内酰胺酶,用三维试验法与K-B法进行酶型分析与药敏试验.结果:本组197株肠杆菌产β-内酰胺酶54株,阳性率27.4%,其中产超广谱β-内酰胺酶(ESBLS)占88.9%, 头孢菌素酶(AmpC)占9.3%,同时产ESBLS和AmpC(即产超超广谱β内酰胺酶,SSBL)占1.8%,金属β-内酰胺酶未检出.对阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒服巴坦耐药率分别为19.8%、17.3%、10.2%,对头孢吡肟耐药率为6.1%,对阿米卡星耐药率为20.8%,而对亚胺培南敏感未检出产酶耐药株.结论:肠杆菌的耐药菌株以产ESBLS为主,对肠杆菌感染的治疗应选用头孢吡肟以及加酶抑制剂复合抗生素,必要时可选用亚胺培南.     

不吸水链霉菌辽宁变种基因转移系统的建立

以嘧肽霉素生物合成阻断突变株UV2136为研究对象,建立了不吸水链霉菌辽宁变种的基因转移系统.UV2136对硫链丝菌素高度敏感,选择含有该抗生素标记的质粒pU702和pWHM3,探索其转化UV2136的可能性.结果表明:UV2136含有较强的限制修饰系统,采取热衰减法获得原生质体、原生质体热处理、冷处理、EDTA处理、质粒DNA变性等,均不能实现质粒pH702向UV2136的转化.来自非甲基化宿主E.coli ET12567的pWHM3也无法实现转化,而源于E.coli DH5α的甲基化pWHM3.可以低频转化菌株UV2136,转化效率分别为4转化子·μg-1 pWHM3,经自身修饰的pWHM3可实现高效转化,达到104转化子·μg-1pWHM3.     

β-内酰胺酶的研究进展

β-内酰胺环类抗生素如阿莫西林、头孢氨苄等是临床常用的抗生素之一,在猪禽细菌病的防治上具有十分重要的地位。但近年来的广泛使用,耐药菌株显著增加,疗效已严重下降。β-内酰胺酶是造成这类抗生素失活的主要原因。本文对β-内酰胺酶的分类、作用机制和有关酶提取物的制备、鉴定及对抗生素水解率的测定方法做了综述。     

稀有放线菌小单孢菌与大肠杆菌接合转移体系的构建

为将外源基因导入小单孢菌,建立小单孢菌(Micromonospora)与大肠杆菌两亲接合转移方法,将包含小单孢菌内源质粒pJTU112复制区的4.7kb片段插入质粒pOJ260的BamHⅠ酶切位点,构建了能在大肠杆菌和小单孢菌中复制的穿梭载体pSCU207,将质粒pSCU207转化大肠杆菌ET12567/pUZ8002,再与小单孢菌LXH20进行两亲接合转移,挑取接合转移子,并进行验证。结果表明:质粒pSCU207通过大肠杆菌与小单孢菌新鲜菌丝之间接合转移导入小单孢菌中,并可稳定遗传;大肠杆菌与小单孢菌新鲜菌丝之间的最佳接合转移体积是40μL和400μL。     

blaCTX-M型鸡大肠杆菌中mcr-1的分子流行病学分析

检测了不同时期从河南省分离的162株blaCTX-M型鸡大肠杆菌对黏菌素的耐药性,进行了耐药基因blaCTX-M和mcr-1的质粒接合试验,并比较了各亚型的水平传播规律.结果表明:随着时间的推移,blaCTX-M型鸡大肠杆菌对黏菌素的耐药率由0％显著增加到42.2％;在头孢噻肟单药筛选下获得的21株接合子有5株同时携带mcr-1,在黏菌素单药筛选下获得的18株接合子有11株同时携带blaCTX-M,且blaCTX-M和mcr-1基因的接合频率无明显差异;原菌及对应接合子的blaCTX-M亚型均属于blaCTX-M-1和blaCTX-M-9亚群,部分原菌同时携带两种亚型,但接合子均仅携带一种亚型(blaCTX-M-9亚群).说明在单一药物(黏菌素或头孢噻肟)的选择性压力下,blaCTX-M和mcr-1基因均易水平传播,且携带blaCTX-M和mcr-1的质粒既可单独转移也可同时转移.     

西部白眉长臂猿支气管败血波氏杆菌的分离鉴定及其耐药基因检测

为探究某动物园西部白眉长臂猿死亡的可能原因,无菌采集病死白眉长臂猿肺脏组织进行细菌分离鉴定。通过分离纯化、培养特性观察、革兰染色镜检、生化试验以及16S rDNA克隆测定对分离菌株进行鉴定;进一步研究分离株的致病性、耐药性,并进行超广谱β-内酰胺酶耐药基因检测及测序分析。结果表明,分离得到1株革兰阴性小杆菌,命名为J181121,该分离菌的培养及生化特性符合支气管败血波氏杆菌,其16S rDNA基因序列与Genbank中支气管败血波氏杆菌(登录号:CP018761.1)的同源性为99%,对小鼠致病力强。药敏试验结果显示,分离株对β-内酰胺类抗生素耐药,PCR检测到超广谱β-内酰胺酶耐药基因bla-SHV。