微载体培养技术及其在疫苗生产中的应用

微载体培养技术是一种新兴的细胞大规模培养技术,是目前贴壁依赖型细胞大规模培养的重要方法,其兼具贴壁培养和悬浮培养的优势,温度、溶氧浓度和pH等培养条件易控制,培养过程自动化、系统化,不易被污染。现就微载体培养技术的发展及其在疫苗生产中的应用进行了综述,并提出了动物细胞微载体大规模培养技术的发展方向。     

生物反应器中PRRSV工业规模增殖工艺的建立

分析比较了3种不同微载体悬浮培养工艺——分批换液式、消化传代放大式、循环灌注培养式对Marc-145细胞微载体培养效能及生理代谢的特点及差异,并实现了从5 L至60 L反应器放大过程的PRRSV实际增殖应用。结果表明,在5 L动物细胞反应器中使用相同的微载体用量6 g/L,分批换液式培养和消化传代放大式培养仅获得27×105~28×105cells/m L的细胞密度,低于循环灌注培养式的培养能力(59.4×105cells/m L)。根据这3种不同培养工艺的特点,设计并实施了可应用于实际生产的工艺流程,即Marc-145种子细胞以循环灌注培养方式在5 L反应器中完成初级培养,经消化传代工艺,将种子细胞放大接种于60 L反应器中进行分批换液式的二级培养,用于PRRSV的大规模增殖,结果显示PRRSV增殖滴度可达到108.3TCID50/m L。该过程成功地模拟了Marc-145细胞在工业级水平上的放大培养操作工艺,其放大倍数达到1∶3的传代系数,具备实际应用价值。     

微载体培养技术在生物医药领域的应用

微载体培养是一种新兴的大规模细胞培养技术,是当前贴壁依赖型细胞大规模培养的主要方法,该技术具有均相培养、平板培养、悬浮培养的优势,比表面积大,能有效提高贴壁性细胞密度.目前微载体培养技术已被广泛应用于一些具有重要价值的生物制品及细胞产品研发和生产领域,如病毒疫苗、干扰素、激素、单克隆抗体等.本文介绍了微载体培养技术在病毒疫苗、基因工程药物、组织工程等领域的应用.     

ST悬浮细胞系的驯化与猪细小病毒的培养

将贴壁的ST细胞驯化为可单细胞悬浮生长的细胞,并进行猪细小病毒大规模培养。采用逐步降低培养基中血清含量的方法获得可悬浮生长的ST-S细胞。结果表明,经悬浮驯化后的ST-S细胞呈现较好的单细胞悬浮生长状态,细胞呈圆球形,结团现象较少,胞体大小基本一致,生长速度正常,最大细胞密度可以达到每毫升4.5×10~6个细胞。说明经驯化获得的可在无血清培养基中悬浮生长的ST细胞株,为大规模工业化生产ST细胞提供技术支持。     

无血清微载体培养Vero细胞增殖传染性法氏囊病毒

为了获得用生物反应器无血清培养基微载体悬浮培养Vero细胞增殖传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)的工艺参数,通过驯化Vero细胞适应无血清微载体悬浮培养后,再优化传染性法氏囊病毒在此细胞上的增殖工艺参数,包括初始细胞密度、微载体浓度、IBDV的感染复数(MOI)、接种时间和病毒收获时间。结果表明:获得适应无血清培养的细胞株——V0株,建立细胞库。获得3 L反应器中培养V0细胞增殖IBDV工艺参数,其初始接种密度为3×105cell/m L、微载体浓度为3 g/L、细胞培养1 d后按MOI为0.2接种IBDV,接毒后120 h收获病毒,可达最高病毒效价109.307TCID50/m L。本研究获得的Vero细胞、IBDV以及各项工艺参数为后续大规模悬浮培养制备法氏囊疫苗提供了生物材料和技术支持。     

微绿球藻 (Nannochloropsis oculata培养基的优化

【目的】微绿球藻 (Nannochloropsis oculata) 是一种优良的单细胞饵料微藻,广泛应用于水产养殖。 优化微绿球藻培养基,以期提高其生长速率,降低生产成本。【方法】以宁波大学 3# 配方为基础微藻培养液, 以乙酸钠为碳源,硝酸钾、尿素和氯化铵为氮源,磷酸二氢钾和磷酸二氢钠为磷源,硫酸亚铁和柠檬酸铁为铁源, 通过单因子和正交试验,研究了碳、氮、磷、铁、维生素 B1 （VB1）和 B12（VB12）等主要营养元素对微绿球藻生长、 繁殖的影响。【结果】获得了以天然海水为基础的微绿球藻优化培养基：3 g/L CHCOONa、20 mg/L NH4CL-N、 2 mg/L KH2PO4-P、3 mg/L FeSO4-Fe、0.05 mg/L VB1 和 0.005mg/L VB12;采用优化培养基与宁波大学 3# 培养基对 比培养微绿球藻,结果表明 , 培养 2 ～ 6 d,优化培养基收获微绿球藻的生物量 ( 细胞密度 ) 比宁波大学 3# 培养 基的分别提高了 2.21、2.55、2.30、1.97、1.7 倍;培养 6 d,优化培养基中微绿球藻收获的生物量 ( 细胞密度 ) 达 到 1.74×107 个 /mL, 是宁波大学 3# 培养基的 1.7 倍。【结论】优化培养基极显著地提高了微绿球藻的生物量, 是微绿球藻的良好培养基。     

镰刀菌毒素研究进展

镰刀菌毒素是镰刀菌属真菌产生的多种次生代谢产物的总称,在自然界中分布极为广泛,是危险的食品污染物,对人畜健康危害十分严重.因此,关于镰刀茵毒素的研究已成为当前国际上最紧迫的课题之一.通过对受侵染的宿主细胞以及体外培养的动物细胞研究表明,镰刀菌毒素可影响植物细胞膜透性并破坏其组织超微结构,可诱导体外培养的动物细胞发生凋亡.笔者对镰刀茵产毒素的类型,镰刀茵毒素对植物细胞、动物细胞的毒害以及脱毒方法作一综述.并探讨了当前镰刀茵毒素研究过程中存在的问题和未来的研究方向.     

PK-15细胞在微载体悬浮放大培养及PCV2增殖工艺研究

为建立在生物反应器内微载体逐级放大培养PK-15细胞和增殖PCV2技术。采用分批式培养方法,研究了PK-15细胞在微载体胰酶消化放大悬浮培养及猪圆环病毒2型(PCV2)增殖工艺。结果表明,5 g/L的微载体和高糖DMEM下,采用4.0×105cells/m L的初始接种密度及培养至第2天进行换液操作工艺可以获得最佳的PK-15细胞生长效能。胰酶消化转移将PK-15细胞从1 L反应器放大至3 L反应器,微载体上细胞贴附均匀、生长旺盛,培养3 d细胞密度可达34.3×105cells/m L。采用感染复数为0.1的接毒比例,细胞接毒后在微载体上传至第3代收获毒液可获得最高的PCV2增殖效价107.25TCID50/m L。为PCV2疫苗的生物反应器规模化生产奠定了基础。     

鲫细胞与病毒微载体规模化培养工艺研究

本文研究了在Cephodex微载体悬浮培养系统中规模化培养鲫脑组织细胞(Gi CB)和鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirusⅡ,CyHV-2)的工艺。结果表明,Cephodex微载体适合GiCB细胞的贴壁培养,细胞贴壁期培养基中血清浓度为10%,微载体浓度为6 g/L;细胞初始接种密度为2.5×10~5cells/m L时,以转速35 r/min,每静置30 min搅拌2 min的间歇搅拌条件贴壁率最佳,8 h后贴壁率可达90%以上;增殖期以45 r/min的连续搅拌速度可获得最佳的细胞生长效能。采用优化的工艺条件,以感染复数为0.2的CyHV-2病毒接种规模化培养的GiCB细胞5 d后,出现典型的细胞病变效应,病毒滴度(TCID_(50)/m L)可达10~(6.50±0.30)。本项研究为鲫造血器官坏死症疫苗的规模化制备技术研究奠定了前期基础。     

乳鼠心肌细胞在旋转生物反应器中的微载体培养初探

实验尝试在旋转生物反应器(RCCS)中采用微载体培养技术对心肌细胞进行快速培养。采用顺序消化和差速贴壁法分离纯化1~2日龄新生大鼠的心肌细胞,并将其在RCCS内应用Cytodex-3微载体进行培养,于倒置显微镜和扫描电镜下对微载体表面的细胞进行动态观察,同时测定细胞的代谢活性。结果表明,心肌细胞可快速贴附于微载体表面,细胞伸展后生长加速,并可形成心肌细胞-微载体团块,细胞代谢旺盛,说明在RCCS内应用微载体培养技术可简便、快速地在体外培养心肌细胞,是心肌细胞培养的一条可行途径。     

Marc-145细胞微载体悬浮培养及PRRSV增殖工艺的建立

采用分批式培养方法研究了Marc-145细胞微载体悬浮培养及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)增殖工艺。结果表明,在3 g/L的微载体用量下,采用1 ml 3×105个细胞的初始接种密度及培养至第3 d进行换液操作工艺可以获得最佳的Marc-145细胞生长效能。采用感染复数为0.05的接毒比例及接毒后48 h收获毒液可获得最高的PRRSV增殖效价。在5 L反应器中重复验证上述工艺,获得较为稳定的试验结果,最大细胞密度均可高于1 ml 2×106个细胞,PRRSV的增殖效价均高于108.0TCID50/ml。为猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗的生物反应器规模化生产奠定了基础。     

精原干细胞体外分离培养的研究进展

为探索提高精原干细胞分离和体外培养效率的技术方法,以建立长期稳定的动物精原干细胞培养体系,对动物精原干细胞的分离纯化和体外培养的研究进展进行综述。以"Spermatogonial stem cell,Isolation,Culture,Enrichment,in vitro"和"精原干细胞、分离、培养和体外扩增"为检索词,查阅精原干细胞相关文献,并进行归纳整理。精原干细胞分离主要有机械分离法和酶消化法,纯化精原干细胞的方法有差速贴壁法、密度梯度离心法、免疫磁珠法、流式细胞法等,目前大动物精原干细胞的富集常使用酶消化法、差速贴壁法和Percoll梯度离心法相结合。精原干细胞体外培养需模拟体内生境,通常在基础培养基中添加血清、饲养层细胞和各类生长因子等,培养条件会影响精原干细胞培养的效果。小鼠精原干细胞已建立较完善的培养体系,而人和多数大动物还缺乏完善的精原干细胞体外培养体系。     

Study on Propagation of Chicken Infectious Bursal Disease Virus on Vero Cells Using Microcarriers in Fermentor

It was in flask optimization tests proved that 2% serum, pH 7.0, 5:10 000 inoculation concentration of infectious bursal disease virus (IBDV) and 108 hours cultivation for IBDV harvest after its inoculation were the optimal conditions when IBDV was propagated on Vero cells. 250 mi self-made spinner bottle and 5 L stirring fermentor tests proved that IBDV could maintain higher titers for a long time and the highest titers of IBDV in a spinner bottle and a fermentor were 8. 875 and 8.58 ( - lgTCID50/0.1 ml) respectively when IBDV was proliferated on Vero cells using 2 g/L microcarriers in a spinner bottle and a fermentor and was cultivated under the optimum conditions obtained from flask tests after Vero cells had developed a confluent monolayer on microcarriers, which were at least one titer higher than the highest titer in the traditional rolling bottle. All these results suggested that this technology could be applied to large scale production for IBDV.     

氮磷浓度对条斑紫菜细胞培养的影响

氮和磷对紫菜的细胞生长和发育有很大的影响，本文讨论了不同氮源、不同氮和磷的浓度和不同细胞密度笃条斑紫菜细胞培养的存活率和细胞生长的影响。试验结果显示，对于细胞生长用ＮＯ３－Ｎ作为氮源估于用ＮＨ４－Ｎ的。前３天培养的细胞对Ｎ／Ｐ浓度的变化有一些忍耐性，３天后Ｎ／Ｐ的浓度对细胞存活率有影响，当Ｎ／Ｐ浓度为１８－２０／１．８－２．０ｍｇｌ＾－１时细胞存活率最高，第６天时，可达到７７－８０％，细胞分裂速度     

氮磷浓度对条斑紫菜细胞培养的影响

氮和磷对紫菜的细胞生长和发育有很大的影响，本文讨论了不同氮源、不同氮和磷的浓度和不同细胞密度笃条斑紫菜细胞培养的存活率和细胞生长的影响。试验结果显示，对于细胞生长用ＮＯ３－Ｎ作为氮源估于用ＮＨ４－Ｎ的。前３天培养的细胞对Ｎ／Ｐ浓度的变化有一些忍耐性，３天后Ｎ／Ｐ的浓度对细胞存活率有影响，当Ｎ／Ｐ浓度为１８－２０／１．８－２．０ｍｇｌ＾－１时细胞存活率最高，第６天时，可达到７７－８０％，细胞分裂速度     

栝楼细胞悬浮系的建立

[目的]为了解决栝楼悬浮细胞系在继代培养中容易退化,生长速度减慢的问题。[方法]以栝楼的茎为外植体诱导出愈伤组织,筛选出质地疏松、生长迅速、易于分散、可以长期进行继代培养的淡黄色半透明状愈伤组织系,将该愈伤组织接种在液体培养基中进行振荡悬浮培养,建立起分散程度好的栝楼悬浮细胞系。同时对影响愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养的条件进行研究,确定适合愈伤组织生长的条件及影响细胞悬浮培养的主要因素。[结果]看护培养可以使栝楼悬浮培养细胞长势良好,并在低密度下获得由单细胞形成的细胞系。[结论]该悬浮系的建立为栝楼细胞大规模培养,进而实现有效药物成分的工业化生产奠定了理论基础。     

胎牛血清和新生牛血清体外培养动物细胞的效果比较

为了比较进口胎牛血清、国产胎牛血清和国产新生牛血清的细胞培养效果,以2批进口胎牛血清、3批国产胎牛血清和2批国产新生牛血清为试验材料,采用细胞贴壁传代培养、最大增殖浓度和倍增时间以及集落形成率3种方法,比较了7批供试血清对VERO、CHO-K1、MDCK和Hela 4种细胞的培养效果。结果表明:连续传代培养时所有牛血清均有较好的促细胞生长的效果;进口胎牛血清、国产胎牛血清和国产新牛血清对4种细胞的平均最大增殖密度为67.8×104、62.1×104和64.8×104 cfu·mL-1,平均倍增时间为22.2、22.5和22.7h;对VERO、CHO-K1和Hela细胞的平均集落形成率为59.2%、57.6%和50.9%。3种牛血清对群体性细胞培养时效果差别不明显,对单细胞克隆培养时胎牛血清优于新生牛血清。     

Hepa1-6细胞的最佳培养条件研究

[目的]探索Hepa1-6细胞的最佳培养条件。[方法]以小鼠Hepa1-6肝癌细胞为材料,采用正交试验设计研究RPMI1640和DMEM2种不同培养基及细胞接种密度、血清浓度、双抗浓度、D-Hanks漂洗次数、胰蛋白酶浓度和消化时间6个不同因素对Hepa1-6传代培养的影响;根据细胞在6个时间点的生长状况评分,筛选出Hepa1-6细胞的最佳培养条件。[结果]Hepa1-6细胞在含有20%血清的RPMI-1640培养基,接种密度为4×104个/cm2,100U/ml的双抗浓度,贴壁率在90%以上时,D-Hanks漂洗1次,0.5%胰蛋白酶消化2min,传代效果最好。[结论]通过正交设计筛选,为Hepa1-6细胞体外培养探索出最佳培养条件。     

Hepa1-6细胞的最佳培养条件研究

[目的]探索Hepa1-6细胞的最佳培养条件。[方法]以小鼠Hepa1-6肝癌细胞为材料,采用正交试验设计研究RPMI1640和DMEM2种不同培养基及细胞接种密度、血清浓度、双抗浓度、D-Hanks漂洗次数、胰蛋白酶浓度和消化时间6个不同因素对Hepa1-6传代培养的影响;根据细胞在6个时间点的生长状况评分,筛选出Hepa1-6细胞的最佳培养条件。[结果]Hepa1-6细胞在含有20%血清的RPMI-1640培养基,接种密度为4×104个/cm2,100U/ml的双抗浓度,贴壁率在90%以上时,D-Hanks漂洗1次,0.5%胰蛋白酶消化2min,传代效果最好。[结论]通过正交设计筛选,为Hepa1-6细胞体外培养探索出最佳培养条件。     

肉苁蓉细胞悬浮培养动力学研究

肉苁蓉细胞悬浮培养的生长周期约为25 d,细胞内苯乙醇糖甙（PeG）的比生成速率YP/X与肉苁蓉细胞比生长速率μ大致成线性关系,为生长偶联型. 在培养过程中,培养基中的磷酸盐和氨盐被迅速消耗,而硝酸盐的利用稍慢,基于蔗糖、氨盐和硝酸盐的细胞收率系数分别为0.48、160和6.4 g/g,基于蔗糖的PeG收率系数为0.055 g/g. 根据细胞基本元素分析及各收率系数之间的关系,计算得出了肉苁蓉细胞悬浮培养的化学计量方程式,为细胞的生物反应器扩大培养提供理论依据.