巴西橡胶树乳管细胞HbWRKY1基因克隆及表达分析

采用PCR和RACE技术,从巴西橡胶树无性系热研7-33-97的乳管细胞中克隆了WRKY转录因子家族的一个成员HbWRKY1。该基因全长为1755 bp,含有1个1440 bp阅读框,编码479个氨基酸。生物信息学分析表明,HbWRKY1含有2个WRKY结构域和C2H2锌指结构基序,与蓖麻、杨树、葡萄、黄瓜、拟南芥的WRKY成员的氨基酸序列同源性分别为64.14%、60.04%、42.54%、40.61%和35.4%,属于Ⅰ类WRKY家族成员。实时荧光定量PCR分析表明,割胶和乙烯显著上调HbWRKY1基因的表达,但茉莉酸和机械伤害对HbWRKY1的表达没有明显影响,表明HbWRKY1可能在乙烯信号途径对防卫蛋白的调节中起重要作用。     

茉莉酸在巴西橡胶树伤害防卫结构形成中的作用

研究了巴西橡胶树（Hevea brasiliensis)芽接树的萌条受机械伤害时外施茉莉酸（JA）对2种防卫结构创伤周皮和乳管的形成的影响。结果表明：（1）割伤幼茎树皮直至形成层或刮伤幼茎树皮去掉表皮和2-3层皮层细胞，都能在6d后看到诱导维管形成层分化出次生乳管。在伤口上施用JA或JA生物合成的前体亚麻醉（LA），能够使伤害诱导的乳管增加；而施JA生物合成的抑制剂indomethacin（IND）则产生抑制伤害诱导乳管分化的作用。（2）割伤或刮伤都能诱导形成创伤周皮，而在伤口施用JA和IND，JA可能不参与诱导创伤周皮的形成。（3）施用乙烯利和6-苄基腺嘌呤（BA）都不能引起创伤周皮形成，但BA能促进伤害诱导的创伤周皮细胞层数目增加。     

巴西橡胶树乳管分化的研究

巴西橡胶树的乳管组织，是决定橡胶产量的是最重要的结构成份。人们一直从两个方面来研究乳管分化，即乳管分化的细胞学和植株内外固子对乳管分化的影响。我们认为，在这些研究中，最值得注意的结果，是采胶对乳管分化的影响。有证据表明，排胶促进乳管分化和原有全部成熟乳管的死亡或去除导致形成密集乳管。据此，我们假定在已有的成熟乳管中存在有抑制将来乳管分化的物质。我们相信，这一假定是深入研究这分化的一个可能的途径。     

巴西橡胶树HbCXE1基因克隆及其生物信息学分析

采用PCR和RACE技术从巴西橡胶树无性系热研7-33-97的乳管细胞中克隆到一条CXE羧酸酯酶蛋白家族基因HbCXE1,该基因cDNA全长1272 bp,含有一个长951 bp的阅读框,编码含316个氨基酸的HbCXE1蛋白。生物信息学分析表明,HbCXE1蛋白理论分子量为35.5437 ku,理论等电点为5.94,HbCXE1蛋白与蓖麻、杨树、葡萄、苹果、拟南芥的CXE蛋白同源性分别为75.08%、62.81%、62.31%、59.43%、57.68%。HbCXE1蛋白具有羧酸酯酶蛋白家族的特征结构,     

巴西橡胶树HbCytb561的克隆及表达分析

细胞色素b561通过参与抗坏血酸的再生在活性氧淬灭、生长发育和抗旱等生理过程中起作用。从巴西橡胶树热研7-33-97叶片中克隆一个细胞色素b561基因,其推导氨基酸含有特征性Cyt_b561家族结构域,命名为HbCytb561。该基因在花、叶片和胶乳中表达,在树皮中不表达。干旱、机械伤害和白粉菌侵染均显著上调该基因在橡胶树叶片中表达。结果说明HbCytb561基因受逆境反应诱导,参与橡胶树抗逆响应的生理和分子机制。     

巴西橡胶树乳管细胞HbSKP1基因克隆及原核表达

SKP1蛋白是茉莉酸信号途径关键环节之一的SCFCOI1复合体的成员,在CUL1和COI1之间起连接作用。本文采用RT-PCR和RACE技术,从巴西橡胶树无性系热研7-33-97的胶乳中克隆了HbSKP1基因。该基因全长778bp,含一个543bp的开放阅读框,编码180个氨基酸。生物信息学分析表明,推导的HbSKP1氨基酸序列含有SKP1家族特征性的Skp1-POZ和Skp1结构域。HbSKP1与蓖麻、毛果杨、拟南芥、油棕、啤酒花、苜蓿的SKP1类蛋白的氨基酸序列同源性分别为64%、61%、47%、47%、47%和47%。原核表达了HbSKP1-His(6)融合蛋白。本研究为进一步鉴定乳管细胞中茉莉酸途径核心环节SCFCOI1复合体打下良好基础。     

巴西橡胶树HbCCoAOMT基因克隆及其表达分析

木质素是植物细胞壁的成分之一,其含量高低影响到细胞壁的弹性。橡胶树乳管膨压是割胶后胶乳排出的初动力,乳管细胞壁的物理性能可能是影响乳管膨压的因素之一。本研究采用QRT-PCR和RACE技术,从巴西橡胶树无性系CATAS7-33-97的乳管细胞中克隆到一个木质素合成关键酶CCo AOMT基因的同源基因,命名为HbCCoAOMT。该基因的开放阅读框为741 bp,编码1个由246个氨基酸残基组成的蛋白质。该蛋白质分子量为27.76 ku,理论等电点为5.255。实时荧光定量PCR结果表明,割胶和乙烯利处理均下调HbCCoAOMT基因在胶乳中的表达。该基因的表达量以及内层树皮的木质素含量在两个橡胶树品种(CATAS8-79和PR107)间存在显著差异。HbCCoAOMT差异表达可能影响到乳管细胞木质素含量和乳管细胞壁的物理性能。     

形成层活动对机械伤害诱导巴西橡胶树次生乳管分化的影响

为了进一步优化机械伤害诱导次生乳管分化的实验系统,采用实验形态学的方法,分析了形成层的季节性活动、新梢和顶芽的发育状态以及伤害程度对机械伤害诱导巴西橡胶树萌条次生乳管分化的影响。结果表明,橡胶树萌条的形成层活动具有明显的休眠期和活动高峰期。在形成层活动的高峰期,小面积的机械伤害容易诱导淡绿期和稳定期萌条分化次生乳管,而且稳定期萌条次生乳管分化程度显著大于淡绿期萌条。但在形成层活动的休眠期,小面积的机械伤害不能诱导萌条的次生乳管分化。新梢和顶芽发育状态对机械伤害诱导次生乳管分化程度的影响都与形成层的季节性活动密切相关。大面积的机械伤害抑制次生乳管分化,可能与伤害部位的形成层细胞分裂活性受抑制有关。     

巴西橡胶树剥皮再生及乳管发生的研究

用光学显微镜技术研究了巴西橡胶树剥皮再生过程中的组织分化和乳管发生。研究结果表明：（１）巴西橡胶树茎干小面积剥皮后,新皮再生经过愈伤组织形成和维管形成层发生２个阶段。愈伤组织由靠近伤口表面未成熟的木薄壁组织细胞和木射线细胞分裂产生,维管形成层在愈伤组织内层发生,且是一个渐进的过程。（２）愈伤组织细胞不能分化形成乳管细胞,新生皮中最初形成的乳管组织从新形成的维管形成层细胞分裂产生,成列分布,并具有不     

巴西橡胶树HbHMAD1的克隆及表达

根据已获得的在橡胶树自根幼态无性系与老态无性系胶乳中一个差异表达的片段序列设计引物,通过RACE法获得了橡胶树编码含有重金属相关结构域蛋白的cDNA,命名为HbHMADl.序列分析结果表明,HbHMA D1长为814bp,含有453 bp的阅读框,78bp的5’-UTR和283 bp的Y-UTR,编码150个氨基酸,分子量为16.9 ku,等电点为10.4.HbHMAD1含有重金属相关结构域,与蓖麻(Ricinus communis)、拟南芥(Arabodopsis thesis)(3个)和玉米(Zea mays)中的含有重金属相关结构域蛋白的同源性分别为85％、64％、63％、60％和55％.半定量RT-PCR分析表明HbHMA D1基因在胶乳和树皮中表达,在叶中微量表达,在花中基本不表达.     

橡胶树枝条初生乳管形态发育研究

橡胶树的初生乳管主要存在幼嫩树干、枝条、叶片、花和果实中,其发育过程依然不清楚。本研究利用石蜡制片和改良的碱处理剥离2种方法研究了幼嫩枝条初生乳管的形态发育过程,发现碱处理剥离法能观察到乳管从起源到发育成熟的连续过程,优于石蜡制片。采用碱处理剥离法系统研究橡胶树枝条不同发育时期初生乳管形态特征。从古铜期枝条不同部位分离的乳管形态差异较大,顶端分生组织附近的乳管呈线性长管状、不分支、无隔,外凸结构不明显;距顶端7 cm左右的乳管具有明显的外凸结构或珠状结构;距顶端14 cm处的乳管明显增粗,相邻乳管间外凸结构联结贯通形成乳管桥,最终形成网状结构。稳定期枝条各部位的乳管形态趋同,外凸或珠状结构的密度和乳管桥的密度均显著高于古铜期枝条对应的部位,都形成了复杂的网络结构。同时发现初生乳管是多核的。本研究结果表明橡胶树枝条初生乳管为无节联结乳管,是一种新的乳管类型。本研究对植物乳管发育研究有重要意义。     

橡胶树树皮miRNA定量表达分析的内参筛选

世界所需天然橡胶主要来自橡胶树,橡胶树的乳管是合成和储存天然橡胶的组织,树干树皮中的次生乳管与天然橡胶生产密切相关,由维管形成层分化而来。次生乳管数量与天然橡胶产量呈显著正相关。因此,乳管分化是天然橡胶生产面临的一个重大理论课题。植物miRNAs是一类长约20~24个核苷酸的非编码小RNA分子,通过介导基因沉默在植物生长发育、细胞分化及逆境适应中起着非常重要的调节作用。橡胶树乳管分化过程中差异miRNAs的鉴定对于进一步认识乳管分化的分子机理具有重要的作用。实时荧光定量PCR（qPCR）已广泛用于miRNA的定量表达分析,选择合适的miRNA内参对于准确进行miRNA的表达定量至关重要。本研究以冠菌素（coronatine, COR）诱导橡胶树萌条分化次生乳管的实验系统,采用小RNA Poly A加尾的qPCR技术分析COR处理对形成层区3个非编码RNA（U6 snRNA、5S rRNA、18S rRNA）和6个miRNA（hbr-miR159b、hbr-miR396b、miR169-x、miR172-y、miR535-x、miR894-x）候选内参的表达稳定性的影响。geNorm和NormFinder软件的联合分析结果显示,表达稳定性最高的是hbr-miR396b和miR894-x,稳定性较差的是U6 snRNA。hbr-miR396b和miR894-x可作为合适的内参基因,用于分析COR影响下的miRNA相对定量表达,为鉴定橡胶树次生乳管分化相关的差异表达miRNAs奠定良好基础。     

TSA诱导橡胶树次生乳管分化过程qRT-PCR内参基因的筛选

橡胶树乳管分化过程中差异表达基因的鉴定对于进一步认识乳管分化的分子机理具有重要的作用。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）是进行基因表达分析的常用技术手段,合适内参基因的选择是准确进行基因表达定量的前提。以组蛋白去乙酰化抑制剂曲古抑菌素A（trichostatin A, TSA）诱导橡胶树次生乳管分化的实验系统,采用qRT-PCR技术分析TSA处理橡胶树萌条及对照内层树皮中22个候选内参基因的表达情况。结果显示：TSA诱导橡胶树萌条次生乳管分化的过程中,稳定性最高的3个基因分别为UBC3、UBC4和eIF1Aa,而稳定性最差的3个基因分别为ROC3、PTP、CYP2。以UBC3、Actin和ROC3基因为内参,分析组蛋白去乙酰化酶基因HDA1和HDA2在TSA处理下树皮中表达量相对于对照的变化,结果初步证实TSA诱导橡胶树萌条次生乳管分化的过程中,UBC3是最佳的内参基因,ROC3不适合作为内参基因。     

橡胶树排胶机理与调控研究进展

排胶是巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Muell.Arg.)树皮乳管细胞中胶乳采收的重要环节,与天然橡胶的生物合成、胶乳再生、割胶技术、韧皮部膨压等众多因素相关,占生产成本的60％以上.近年来,天然橡胶异戊二烯途径合成与调控机制、胶乳诊断指标、乳管伤口堵塞和过度排胶导致的死皮发生和修复机理等领域均取得...     

一种快速高效适于橡胶树叶片AFLP分析的DNA提取方法

以近200个巴西橡胶树种质材料(品种及无性系)幼嫩叶片为材料,采用改良的CTAB法对其基因组总DNA的提取进行了研究。结果表明,该方法提取的DNA溶液无色透明,OD260 /OD280 的比值均为1.8～2.0,1%琼脂糖凝胶电泳为清晰的一条带,无降解现象,RNA去除干净,能被限制性内切酶完全消化;其AFLP分析(引物EcoRI- TA/MseI- CTT)条带清晰,多态性好,说明此方法提取的巴西橡胶树幼嫩叶片基因组总DNA较适于AFLP分析。     

草甘膦对巴西橡胶树芽接苗叶片莽草酸和4种激素含量的影响

为探究草甘膦诱导橡胶树芽接苗叶片畸变的作用机理,以巴西橡胶树品种‘热研7-33-97’芽接苗为材料,喷施188 g a.i/hm2的草甘膦剂量,分析芽接苗不同形态叶片莽草酸和4种激素含量变化规律。结果表明：莽草酸积累量在草甘膦施药前后呈显著差异,当叶片出现半黄半绿表型时,莽草酸积累量较未施药前上升12.40%,而在2种再生畸形叶(叶片长度＜7 cm和＞7 cm)和恢复叶时分别下降75.01%、77.48%和62.69%;喷施草甘膦后各类型叶片生长素和赤霉素的含量均与未施药前对照叶片差异不显著,脱落酸和玉米素含量较对照差异显著,半黄半绿叶片脱落酸含量较未施药对照下降12.40%,玉米素较施药前下降33.54%;2种再生畸形叶出现后,脱落酸含量较未施药前分别升高30.40%和45.61%,玉米素分别升高41.48%和86.02%。说明莽草酸和植物激素共同调节着橡胶树的生长,且影响了橡胶树叶片畸形。     

一种测定巴西橡胶树树皮中过氧化氢含量的方法

研究植物体内 H2O2 的含量变化有助于确认植物提高非生物胁迫耐性的生物技术策略。Ti(Ⅳ)-PAR-H2O2 比色法灵敏度高、特异性强、稳定性好,广泛用于植物 H2O2 测定,但不同研究所用的反应条件不一致。在本研究中,系统优化了 Ti(Ⅳ)-PAR-H2O2 比色法的反应条件,并比较了丙酮提取法和 TCA 提取法对橡胶树萌条韧皮部 H2O2 的提取效果。结果表明,丙酮提取法稳定性差,TCA 提取法稳定性好。本研究报道了一种简单、快速的测定橡胶树树皮 H2O2 的方法,为进一步研究橡胶树中 H2O2 的生理功能打下良好基础。     

一种测定巴西橡胶树胶乳中过氧化氢含量及其在胶乳各组分中分布的方法研究

胶乳活性氧产生与清除失衡是导致橡胶树发生死皮的一个重要因素。由于直接用丙酮提取胶乳中的过氧化氢,存在测定结果重复性不好和准确性不高的问题。笔者在加入丙酮前使用不同提取液对胶乳样品进行预处理,在加入丙酮后使用萃取剂,建立了一种适合测定胶乳中过氧化氢的方法,发现胶乳中的过氧化氢主要分布于C-乳清和黄色体组分,为进一步研究橡胶树乳管活性氧代谢打下良好基础。     

一种测定巴西橡胶树树皮中过氧化氢含量的方法

研究植物体内 H2O2 的含量变化有助于确认植物提高非生物胁迫耐性的生物技术策略。Ti(Ⅳ)-PAR-H2O2 比色 法灵敏度高、特异性强、稳定性好,广泛用于植物 H2O2 测定,但不同研究所用的反应条件不一致。在本研究中,系统 优化了 Ti(Ⅳ)-PAR-H2O2 比色法的反应条件,并比较了丙酮提取法和 TCA 提取法对橡胶树萌条韧皮部 H2O2 的提取效果。 结果表明,丙酮提取法稳定性差,TCA 提取法稳定性好。本研究报道了一种简单、快速的测定橡胶树树皮 H2O2 的方法, 为进一步研究橡胶树中 H2O2 的生理功能打下良好基础。     

巴西橡胶树磷饥饿调控基因HbPHR1克隆与生物信息学分析

天然橡胶主要来源于巴西橡胶树。海南植胶土壤磷素缺乏,而缺磷会导致橡胶树生长缓慢、干胶产量降低。本文通过RT-PCR技术从橡胶树中克隆了一个磷饥饿信号关键调控基因HbPHR1,基因全长1 560 bp,包含一个1 476 bp的完整读码框(ORF),编码491个氨基酸,分子量约为53.48 kD。HbPHR1具有MYB结构域和CC结构域,属于MYB-CC家族成员,为酸性不稳定蛋白,具有较强的亲水性。进化树分析表明,HbPHR1与拟南芥AtPHR1、油菜BnPHR1归为一个亚类。HbPHR1的克隆对解析橡胶树磷信号转导机制、创制磷营养高效利用橡胶树材料具有重要意义。