百合三种病毒的多重RT-PCR检测

根据基因库中黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）、百合斑驳病毒（Lily mottle virus,LMoV）、百合无症病毒（Lily symptomless virus, LSV）的外壳蛋白基因序列,设计了3对特异引物,通过对扩增条件进行优化,建立了同时检测CMV、LMoV和LSV的多重RT-PCR检测方法。该方法可以从带有CMV、LMoV和LSV的样品中同时扩增出3条大小与试验设计相符的657 bp (CMV) 、428 bp（LMoV）、171 bp (LSV)的特异性多重RT-PCR扩增带。扩增产物测序表明,CMV、LMoV和LSV 3种病毒与GenBank中登录的亚洲和荷兰多数分离物核苷酸同源性在90%以上,地域差异不明显,外壳蛋白序列高度保守。     

喇叭水仙中百合斑驳病毒的RT-PCR检测及序列分析

 根据基因库中已发表的百合斑驳病毒（Lily mottle virus, LMoV）外壳蛋白基因序列设计引物,通过RT-PCR方法从喇叭水仙Narcissus pseudonarcissus‘Pink-charm’ 样品中扩增出1条大小与试验设计相符的553 bp的特异性LMoV RT-PCR带。扩增产物序列分析表明：与GenBank中百合斑驳病毒百合分离物核苷酸相似性在90%以上。将该序列翻译为外壳蛋白的氨基酸序列ABW16938发现它完全存在于GenBank上已登录的LMoV病毒外壳蛋白序列NP-945145中,确认喇叭水仙该样品感染了百合斑驳病毒。     

百合斑驳病毒靖宇分离物全基因组序列测定与进化分析

以采自吉林省白山市靖宇县的野生百合感病叶片为试材，采用小RNA深度测序法检测到1株百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV),采用分段克隆方法，对LMoV靖宇分离物(LMoV-JY)的全基因组进行测定并分析，以期对吉林省百合病毒病的检测和防控提供参考依据。结果表明：LMoV-JY基因组大小为9 648个核苷酸(nt)序列(GenBank登录号MT795719),该核苷酸序列在第154～9 444位存在1个大的开放阅读框(ORF),编码1个多聚蛋白(分子量351.46 kD)。LMoV-JY与GenBank中登录的其他LMoV分离物的全基因组核苷酸序列比较，其一致性为82.82%～97.85%,在氨基酸水平上的一致性为92.96%～98.64%,其中与百合斑驳病毒大连分离物LMoV-DL(HM222521)的一致性在该2种水平上均为最高。对比LMoV-JY外壳蛋白与其他54个分离物的氨基酸序列，发现可将LMoV分离物分为2个类群。     

百合无症病毒CP基因的克隆及其RNA i载体的构建

 以感染百合无症病毒(LSV) 的百合叶片总RNA为模板, 利用反转录聚合酶链式反应(RT2PCR) 扩增出了876 bp的LSV CP基因, 经Blast比对发现该片段与GenBank上发表的LSV CP基因序列高度同源, 同源率98% , 由该序列推导出的氨基酸序列相似性达到98%。应用Gateway技术将扩增的片段通过BP反应连接到入门载体pDONR201, 并进行序列测定, 再通过LR反应将目的片段插入到RNAi植物表达载体pH7GW IWG2 ( Ⅱ) , 成功构建了适合农杆菌介导的百合转化的RNAi载体。     

香蕉两种主要病毒多重PCR检测方法的建立

 根据香蕉束顶病(Banana bunchy top virus, BBTV) 和香蕉花叶心腐病(Cucumber mosaic virus,CMV) 的复制酶基因、外壳蛋白基因序列分别设计特异性引物对, 在BBTV单一PCR和CMV RT-PCR优化体系的基础上, 建立了可同时检测BBTV、CMV的多重PCR检测方法。此方法可以特异地从感染BBTV和CMV的样品中扩增出2条带, BBTV (748 bp) 和CMV (557 bp) 。扩增产物序列测定结果表明, BBTV扩增产物与GenBank中其他分离物的核苷酸序列同源性为91% ～99% , CMV扩增产物与GenBank中其他分离物的核苷酸序列同源性为93%～98%。     

应用IC-RT-PCR方法检测水仙中百合斑驳病毒

水仙病毒严重影响水仙的品质与规模化生产,而快速检测水仙病毒可以有效防控其危害与扩散。根据已报道的百合斑驳病毒外壳蛋白基因序列设计PCR引物,利用免疫捕获PCR检测了水仙样品中百合斑驳病毒。PCR扩增产物回收后克隆到PMD19-T载体中测序。把克隆得到的百合斑驳病毒外壳蛋白基因部分序列提交到Genbank中。结果表明:基因登录号为JF714974,克隆的百合斑驳病毒外壳蛋白基因部分序列与国内外百合斑驳病毒同源性为90.4%~99.5%。建立了水仙中百合斑驳病毒的IC-RT-PCR的检测方法,简化了试验步骤,适合于水仙中百合斑驳病毒的快速检测。     

草莓轻型黄边病毒的RT-PCR检测及其3'端序列分析

 利用RT-PCR技术对草莓植株中草莓轻型黄边病毒( SMYEV) 的外壳蛋白基因片段进行特异扩增, 扩增产物经测序证明为SMYEV的特异片段。建立了稳定的SMYEV的RT2PCR检测体系, 并对19个草莓品种和2种野生草莓进行检测, 其中12个品种和五叶草莓带有SMYEV。从SMYEV 的沈阳分离物SY01上扩增出了932 bp的基因组3'末端区域, 其核酸序列与国外分离物的序列同源性为86% ～96%。系统进化树显示SMYEV分为3个组群, 沈阳分离物SY01与欧美分离物位于同一组群内, 但独立形成1个小的分支。RNA二级结构分析显示SMYEV基因组3'末端形成3个茎环结构, 不同分离物的序列变化并未引起茎环结构的明显变化。     

草莓轻型黄边病毒的RT-PCR检测及其3''端序列分析

利用RTPCR技术对草莓植株中草莓轻型黄边病毒(SMYEV)的外壳蛋白基因片段进行特异扩增,扩增产物经测序证明为SMYEV的特异片段。建立了稳定的SMYEV的RTPCR检测体系,并对19个草莓品种和2种野生草莓进行检测,其中12个品种和五叶草莓带有SMYEV。从SMYEV的沈阳分离物SY01上扩增出了932bp的基因组3末端区域,其核酸序列与国外分离物的序列同源性为86%～96%。系统进化树显示SMYEV分为3个组群,沈阳分离物SY01与欧美分离物位于同一组群内,但独立形成1个小的分支。RNA二级结构分析显示SMYEV基因组3末端形成3个茎环结构,不同分离物的序列变化并未引起茎环结构的明显变化。     

黄瓜上甜瓜黄斑病毒寿光分离物的初步鉴定及序列分析

在山东寿光黄瓜保护地种植区采集到疑似感染甜瓜黄斑病毒(Melon yellow spot virus,MYSV)的黄瓜病叶,采用RT-PCR对其进行检测,将扩增产物连接到pEASY-T1 Simple克隆载体后进行测序,结果显示目的片段的大小为505bp,与预期结果一致;序列同源性比对分析结果表明,黄瓜上MYSV寿光分离物与中国三亚的MYSV-Sanya分离物(甜瓜-GQ397254)和中国台湾MYSV-TW(西瓜-FJ386391)亲缘关系较近,同源性可达到98%。     

百合无症病毒16kD基因的克隆、原核表达及抗血清制备

以感染百合无症病毒(LSV)的百合叶片为试材,克隆LSV16 k D基因,连接到原核表达载体p ET-28a(+)上。将获得的重组质粒p ET-28a(+)+16 k D转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导得到了高效表达的16 k D蛋白,融合蛋白分子量约为20 k D。融合蛋白经过镍柱纯化后作为抗原免疫注射小鼠,制备得到16 k D蛋白抗血清。Western blot分析显示所制备的抗血清与诱导表达的融合蛋白发生特异性反应;通过ELISA检测和RT-PCR检测百合样品,证实制备的抗血清与LSV侵染的百合叶片发生了相同的特异性反应。结果表明,目的蛋白表达成功,所制备的抗血清具有特异性,可用于LSV的快速检测、免疫组织化学以及16 k D蛋白功能研究。     

香蕉3种病毒的多重PCR检测体系

根据GenBank中已发表的香蕉束顶病毒（Banana bunchy top virus,BBTV）﹑黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）和香蕉线条病毒（Banana streak virus,BSV）的基因序列,找出保守序列分别设计出特异引物,在建立各种病毒单项PCR技术的基础上,通过优化多重PCR反应条件,建立了能同时检测3种病毒的多重PCR检测体系。该体系可同时扩增BBTV的615 bp、CMV的480 bp和BSV的945 bp的特异片段。这些片段克隆测序结果表明,多重PCR扩增的不同病毒片段是特异和专化的,其核苷酸序列与相应的病毒基因片段的相似性都达91%以上。该体系的灵敏度测定结果表明,从相当于或大于10-2 mg感病植物组织中均能检测到这3种病毒。     

马铃薯5种病毒多重PCR检测技术的建立及应用

采用多重RT-PCR方法,建立可同时检测马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯M病毒（PVM）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯A病毒（PVA）和马铃薯S病毒（PVS）的方法。根据 GenBank中PVX、PVM、PVY、PVA及PVS（CP）基因序列设计特异引物,对多重RT-PCR退火温度、循环次数、延伸温度、引物组合浓度进行优化,建立了能同时检测5种马铃薯病毒的多重RT-PCR方法。该方法能同时扩增出PVX、PVM、PVY、PVA及PVS特异片段,其大小分别是138、213、369、468和657 bp。测序结果表明,5种病毒的序列与相应参考序列相似性达到97%以上。灵敏度分析结果表明,多重RT-PCR方法能够检测植物组织量为10-3 mg。应用建立的多重RT-PCR检测方法对田间样品和组培苗进行检测,结果显示,该方法可以准确、快速、灵敏地同时检测单一或复合侵染的5种马铃薯病毒。     

葡萄4 种病毒多重RT-PCR 检测体系的建立

 以复合感染4种病毒的‘红地球’（Red Globe）葡萄样品为试材,对影响多重PCR的dNTPS浓度、Taq酶浓度、引物浓度、退火温度及模板量进行了调整和优化,建立了能同时检测葡萄卷叶伴随病毒3（Grapevine leafroll-associated virus-3,GLRaV-3）、沙地葡萄茎痘相关病毒（Grapevine rupestris stem pitting associated virus,GRSPaV）、葡萄病毒B（Grapevine virus B,GVB）和葡萄病毒A（Grapevine virus A,GVA）的多重RT-PCR方法。灵敏度测验结果显示,多重RT-PCR与单一RT-PCR检测灵敏度基本一致。多重RT-PCR获得的特异性片段大小分别为905、546、460和196 bp,经过克隆、测序及序列比对,表明其序列与已报道的病毒序列具有较高的同源性。对7个已知带病毒的葡萄样品进行检测验证的结果表明,所建立的多重RT-PCR技术可用于大量田间样品中这些病毒的检测。     

柑橘黄龙病、裂皮病和衰退病病原的多重RT-PCR检测

 建立了一种同时检测柑橘黄龙病病原类细菌(Candidatus L iberibacter asiaticus, HLB) 、柑橘裂皮类病毒(Citrus exocortis viroid, CEVd) 、柑橘衰退病病毒(Citrus tristeza virus, CTV) 的多重RT-PCR技术体系。运用根据3 种病原核苷酸保守区序列设计的特异性引物, 成功的对同一样品中的HLB、CEVd、CTV进行多重RT2PCR扩增, 得到1 160 bp、371 bp、273 bp 3条特异性大小与试验设计相符的条带。就影响多重PCR 的主要因素引物浓度和退火温度进行了一系列优化, 建立了能同时检测HLB、CEVd、CTV的多重RT2PCR技术体系。该体系最低能从10 pg总RNA中检测出黄龙病类细菌和柑橘裂皮类病毒, 从1 pg总RNA中检测到柑橘衰退病毒。对采自田间37份材料的实际检测表明: 存在两种或3种病原的复合侵染。