鸡毒支原体与鸡滑液囊支原体双重PCR检测方法的建立

为建立能同时检测鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum, MG)和鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)的双重PCR诊断方法,该研究根据GenBank中登录的MG gapA基因序列和MS heat shock ATP-dependent protease基因序列,设计2对特异性引物,通过对PCR扩增条件的优化,建立了能够同时检测MG和MS的双重PCR诊断方法。特异性检测结果显示,该方法能够扩增出729 bp的MG和309 bp的MS特异性片段,对禽巴氏杆菌、大肠杆菌、鸡白痢沙门菌、副鸡禽杆菌核酸扩增均为阴性;敏感性检测结果显示,对MG和MS DNA的最低检出量均为5×10^-2 ng/μL;临床样品的检测结果显示,所建立的双重PCR方法可同时有效地检测出MG、MS混合感染和单独感染。该研究建立的鸡毒支原体与鸡滑液囊支原体双重PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,为快速、高效检测MG和MS提供了技术支持。     

鸡毒支原体与滑液囊支原体双重PCR检测方法的建立与应用

为建立鸡毒支原体(MG)与滑液囊支原体(MS)双重PCR检测方法,一次反应即可诊断鸡毒支原体与滑液囊支原体感染情况.根据GenBank公开的MG和MS基因序列,设计了2对质粒构建引物和2对检测引物,优化检测反应体系与条件,进行灵敏性试验、特异性试验和临床检测应用.结果显示,该方法对MG和MS阳性质粒的最低检测限为10拷...     

应用多重套式PCR检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体

根据已发表的鸡毒和鸡滑液支原体血凝素基因序列pMGA和vlhA各设计两对引物,建立鉴别诊断两种支原体的多重套式PCR方法,对其进行温度条件、Ⅱ步模板浓度优化及特异性、敏感性实验。该方法在两步PCR后能特异性地扩增出MG(408 bp)和MS(688 bp)两个目的片段。应用于临床样品检测,与支原体分离、SPA检测比较结果PCR灵敏度高于病原分离。     

鸡毒支原体TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

为快速检测鸡毒支原体,根据鸡毒支原体的保守基因设计特异性引物和TaqMan探针,建立鸡毒支原体TaqMan实时荧光定量PCR方法并分析鸡毒支原体培养过程中颜色单位改变法(color change unit, CCU)和荧光定量PCR检测的相关性。结果显示,标准曲线y=-3.646x+44.208,相关系数R²=0.998,最低检测限度为1 copy/μL;与其他菌株等均无交叉反应;组内和组间变异系数均小于3%,表明该方法具有良好的稳定性和可重复性。用建立的实时荧光定量PCR检测方法对26份临床样品进行检测,该方法较普通PCR方法检出率更高。建立的荧光定量PCR与CCU显示鸡毒支原体在对数生长期时,两者具有一定的对应关系。表明建立了鸡毒支原体TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,可实现对鸡毒支原体的快速检测,为鸡毒支原体感染的防控提供技术基础。     

鸡毒支原体强弱毒株荧光定量PCR鉴别检测方法的建立

为建立一种能鉴别鸡毒支原体(MG)强、弱毒株的快速检测方法,本研究根据GenBank中MG强毒株和弱毒株的基因组序列,选取特异性保守区序列设计了2对引物和2奈探针,分别用于强弱毒株和弱毒株的检测,优化反应条件,建立了能区分MG强、弱毒株的荧光定量PCR检测方法.该法特异性强,对鸡常见呼吸道病原体的反应均为阴性;灵敏度高,可检测到100拷贝/μL的模板;稳定性好,批内和批间试验Ct值的变异系数小.本研究建立的MG强、弱毒鉴别检测方法简便、快捷,为该病的防控与净化提供新方法、新思路.     

微滴式数字PCR定量检测滑液囊支原体方法的建立及应用

为绝对定量滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae,MS）,试验根据已发表的MS VlhA基因序列,针对其保守区域分别设计了1对特异引物和1条探针,建立了ddPCR定量检测MS的方法,并检测该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示：建立的方法最佳引物浓度为20μmol/μL,最佳探针浓度为10μmol/μL,最佳退火温度为54℃;该方法仅检测出MS毒株,不能检测出其他禽源病原,MS重组质粒标准品最低检测限为3.5拷贝/μL,3个连续稀释的MS重组质粒DNA检测的变异系数均小于5%;45份病鸡喉拭子、肺脏及关节囊样品检测结果显示,该方法的MS阳性检出率（11.1%）高于荧光定量PCR(8.9%)。结果表明,建立的ddPCR方法定量检测MS特异性强、敏感性高、重复性好,为绝对定量MS提供了适合的技术手段。     

用探针杂交法检测鸡毒支原体和滑液囊支原体

根据鸡毒支原体(MG)和滑液囊支原体(MS)的16SrRNA基因序列，设计并合成了探针MG和MS共同目的基因，跨幅为580bP的一对引物。用这对引物对2个标准的MG和1个标准的Ms菌株DNA模板进行聚合酶锭反应(PcR)，结果得到了预期大小约580bP的PcR产物。回收纯化琼脂糖电泳凝肢中的MG扩增产物克隆至T载体中，DIG随机引物法合成核酸探针，斑点杂交试验对MG和MS均呈阳性，检测灵敏度分别为2ng和3ng，其它对照菌(毒)株为阴性。     

PCR检测鸡毒霉形体和鸡滑液囊霉形体的研究

根据禽霉形体16S rRNA的基因序列设计，合成了1对引物，用这对引物对鸡霉素形体（Mycoplasma gallisepticum,MG)和鸡滑液囊霉形体（Mycoplasma synoviae,MS)菌株DNA进行PCR扩增，得到了与预期大小相一致的580bp的PCR产物，而这对引物对其他畜病病原DNA或RNA模板的扩增结果为阴性，PCR方法对MG和MS的最小检出量分别为2pg和3pg，应用已建立的PCR方法检测MG人工感染样品和临床样品，从人工感染样品中均检测到MG，临床样品的MG阳性检出率为10．25％，高于常规分离培养的阳性检出率。     

北京市鸡毒支原体和滑液囊支原体血清学调查

为了解北京市鸡毒支原体(Mycoplasma galliscepticum,MG)和滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)感染情况,2019年从北京市10个区127个养鸡场(户),采集3 910份鸡血清样品,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行MG和MS感染抗体检测。结果显示:北京市10个区均有不同程度的MG和MS感染,场群阳性率分别介于78.95%～100%、68.42%～100%,样品阳性率分别介于59.35%～93.13%、50.0%～94.53%,平均场群阳性率分别为89.0%和86.6%,平均样品阳性率分别为79.0%和75.6%;第三季度的场群阳性率和第二季度的样品阳性率最高,第四季度场群阳性率和样品阳性率最低(P0.01);110～180日龄的MG样品阳性率、251～320日龄的MS样品阳性率最高,462日龄以上均最低(P0.01);规模化商品鸡场的MG和MS场群阳性率和样品阳性率均最高(P0.01);蛋鸡的MG和MS样品阳性率均高于肉鸡(P0.01)。结果表明,北京市MG和MS感染较为严重,第二、三季度高发,110～320日龄鸡群、规模化商品鸡场和蛋鸡群感染尤其严重。结果提示,应采取包括加强生物安全管理、种鸡净化、疫苗预防和药物治疗在内的综合管理措施,有效控制该地区MG、MS的流行。     

鸡毒支原体MG荧光定量PCR技术评估实验室MG核酸污染方法

为了评估鸡毒支原体(MG)非免疫鸡群的MG感染,常采用MG荧光定量PCR技术进行监测;而在鸡群的MG净化监控前,需要对实验室进行MG核酸污染评估,无污染后才能进行后续的净化检测工作.本实验采用MG荧光定量PCR技术评估实验室各区域的MG核酸污染情况,如果存在核酸污染,需要采取一系列的消毒措施,直至实验室MG核酸污染监控...     

鸡毒支原体弱毒F株与强毒株二重荧光定量PCR鉴别检测方法的建立

研究根据基因库中鸡毒支原体(MG)S6毒株和F株的基因保守序列,设计了2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针,对反应条件和试剂浓度进行优化,建立能鉴别鸡毒支原体(MG)强、弱毒株的二重荧光定量PCR检测方法,与其它禽类呼吸道病原体无交叉反应,对MG模板的灵敏度检测限为10拷贝/μL,对MG强弱毒模板以不同的浓度进行组合,仍可有效地检测到毒株,批内和批间重复变异系数小,特异性强、灵敏度高、稳定性好。研究建立的二重荧光定量PCR方法可用于MG强、弱毒株的鉴别检测,为该病的防控与净化提供良好工具。     

鸡毒支原体PCR检测方法的建立

目前临床上常见的支原体主要为鸡毒支原体（MG）和鸡滑液囊支原体（MS）。由于MG和MS经常发生混合感染,给临床诊断和治疗带来极大的困难。为了快速诊断MG,特别是致病性鸡毒支原体,本研究针对MG的pvpA基因设计特异性引物,通过优化反应条件,进行灵敏性试验、特异性试验和重复性试验,建立快速高效检测MG的PCR方法。结果表明,该检测技术具有较好的灵敏性、特异性强且CV<3%,具有很好的符合性。     

鸡滑液囊支原体的分离和鉴定研究

从河南某肉种鸡场疑似鸡滑液囊支原体感染的病鸡跗关节样品进行病原的分离与鉴定.分离菌经瑞氏染色,在油镜下呈球形或椭圆形.在固体培养基上表现为细小、光滑、致密的小菌落,菌落形态为“煎蛋状”.L型细菌鉴定发现菌体仍保持原有形态.菌体能够吸附红细胞,分解葡萄糖,但不能分解精氨酸和尿素,还可致SPF鸡胚死亡,说明该分离菌为支原体.进一步的血清学试验结果表明,该分离菌为鸡滑液囊支原体,而不是鸡毒支原体.根据已发表的鸡滑液囊支原体血凝素基因序列vlhA设计合成一对引物,经PCR扩增,该菌体能够扩增出鸡滑液囊支原体(773 bp)的特异性片段.人工感染试验结果显示,SPF鸡能够复制出自然病例.     

微滴式数字PCR定量检测鸡毒支原体方法的建立

为建立微滴式数字PCR（droplet digital PCR,ddPCR）定量检测鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum,MG）方法,以MG的mgpc基因序列为目的序列,在其保守区域内设计合成了1对特异性引物和1条探针,通过各反应条件优化,建立了检测MG的ddPCR方法,并测定了建立方法的特异性、敏感性以及重复性。结果显示：建立方法的最佳引物浓度为20 μmol/μL,探针浓度为10 μmol/μL,退火温度为55 ℃;该方法只检出MG,没有检出鸡滑液囊支原体、禽衣阿华支原体、禽流感病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、禽脑脊髓炎病毒、禽偏肺炎病毒、禽呼肠孤病毒、鸡沙门氏菌和鸡大肠杆菌,且相互间没有交叉反应;本方法最低检测MG重组质粒标准品的检测限为3.9拷贝/μL。重组质粒标准品浓度在3.9~41 025拷贝/μL范围内,绘制的ddPCR绝对定量曲线与测得值呈良好的线性关系（R2 = 0.999）;3次重复检测试验结果的变异系数均小于5%。对采集的60份病鸡喉拭子、气囊拭子及肺样品进行MG检测,结果ddPCR方法的阳性检出率（15.0%）高于荧光定量PCR方法（13.3%）。结果表明,本研究建立的ddPCR方法定量检测MG特异性强,灵敏度高,重复性好,为绝对定量检测MG提供了技术手段。     

应用多重聚合酶链式反应检测鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和禽衣阿华支原体的研究

根据鸡毒支原体 (MG)、禽衣阿华支原体 (MI)、鸡滑液囊支原体 (MS)的基因文库 ,设计了 3对分别与MG、MI、MS某段基因序列互补的引物。用这 3对引物对同一样品中的MG、MI、MSDNA模板进行多重聚合酶链式反应 (PCR)扩增 ,结果均同时得到了 3条特异性的大小与实验设计相符的 732bp (MG)、 2 99bp (MI)、 2 0 7bp (MS)多重的PCR扩增带 ,而对其他 6种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性 ;敏感性测定结果能同时检出 1pg的MG、MI和MSDNA模板     

二重荧光RT-LAMP鉴别检测禽呼肠孤病毒和鸡滑液囊支原体

本研究旨在建立一套通过添加荧光探针FD,反应后可使用成像仪直接观测结果的鉴别检测禽呼肠孤病毒(ARV)和鸡滑液囊支原体(MS)的二重荧光RT-LAMP检测方法。根据ARV和MS的保守基因片段,设计了2套LAMP引物,并各添加1条FD荧光探针,2条FD探针分别标记CY5和6-FAM荧光基团。结果：ARV阳性对照在成像仪下发出红色荧光,MS阳性对照发出绿色荧光,双重模板经过图像融合后为黄色荧光;特异性结果显示,该二重荧光RT-LAMP检测方法仅能扩增ARV和MS两种病原,对其他常见病原如鸡毒支原体(MG)、禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)等无扩增反应;敏感性结果显示,该二重荧光RT-LAMP检测方法对ARV和MS的最低检测量分别为1.7×10² copies和1.9×10² copies;使用该方法检测40份临床样品,检出率与本实验室前期建立的二重荧光RT-PCR检测结果相同。综上,该二重荧光RT-LAMP检测方法可特异、敏感地鉴别检测ARV和MS,通过添加FD荧光探针和成像仪观测结果,为不同条件的实验室提供了新的检测手段。     

鸡滑液囊支原体病的防治

鸡滑液囊支原体病由滑液囊支原体感染所引起,呈世界流行,病鸡以关节肿大,跛行,机体消瘦和营养不良为主要表现特征,产蛋鸡群出现蛋品质下降;本病应以预防为主,不断提高鸡场的管理水平,通过净化鸡舍和药物防控的方法将疾病发生率降至最低。     

鸡滑液囊支原体病诊治

鸡滑液囊支原体病又被称为传染性滑膜炎,患病期主要表现为关节和脚掌显著肿大,不能正常站立行走、跛行,感染该种疾病后患病鸡生长发育迟缓,严重的会导致大量死亡。由于病变位置主要集中在关节的滑液囊和腱鞘,常会引起关节渗出性滑膜炎、腱鞘炎,造成的危害十分严重。该文结合一起实际病例,分析鸡滑液囊支原体病的发病经过、流行特点、临床症状、病理学变化、诊断方法和防治手段,以进一步提高该种疾病的治疗效果。