鹅细小病毒VP1基因的克隆及序列分析

参照GenBank中收录的鹅细小病毒(GPV)B株基因序列设计并合成了扩增GPV H1株VP1的1对引物，利用PCR技术扩增出长约2．2kb的目的片段，将其克隆到pMD 18-T载体上，进行了序列测定及分析。测序结果表明，GPV H1株VP1基因由2199个核苷酸组成，编码732个氨基酸。经与B株、YG株进行同源性比较，核苷酸的同源性分别为98．50％和93．18％；推导的氨基酸同源性分别为98．09%和95．77％。     

2013年苏皖地区鹅细小病毒的分离鉴定及其VP3基因序列分析

鹅细小病毒(GPV)主要引起雏鹅和雏番鸭的高死亡率。本研究对2013年采集的苏皖地区疑似GPV感染的病鹅组织,通过鹅胚病毒分离以及PCR扩增,共分离鉴定出11株GPV病毒。这11株GPV病毒的鹅胚致死时间为43¹59h。与NCBI中检索到的21个VP3进行的序列分析发现,这些GPV的VP3氨基酸同源性为97.2%159h。与NCBI中检索到的21个VP3进行的序列分析发现,这些GPV的VP3氨基酸同源性为97.2%¹00%。进化树分析表明,新分离的GPV VP3与分离于1982年的台湾GPV毒株82-0308最接近。与其他分离株VP3比较,这11株中有3株VP3中存在N35D、V261L、Y293H共突变现象。这些苏皖地区GPV毒株的分离、鉴定以及序列特征,对进一步探究苏皖地区GPV病毒的分子演化特征以及流行病学提供了材料。     

鹅细小病毒吉林株的分离鉴定及其全基因序列分析

从患病鹅的病料中分离鉴定了2株鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV),命名为CH株和LS株。参考NCBI中多株GPV全基因序列,分段设计5对引物,对分离株的全基因序列进行PCR扩增、测序、拼接,并使用生物学软件对全基因序列进行比对和分析。遗传进化分析显示,CH株与LS株处于同一分支且相邻,表明具有较近的亲缘关系。由此推测,两株病毒可能起源于同一原始毒株。     

6株鹅细小病毒的分离鉴定及VP3基因序列分析

为了解吉林省不同地区小鹅瘟流行情况,从吉林省磐石、白城、九台、德惠、辽源、镇赉地区鹅养殖场采集疑似小鹅瘟病料,接种SPF鹅胚后分离到6株病毒(暂命名为PSH、BCH、JLJT、DH、LY、ZL株),经PCR鉴定为鹅细小病毒。VP3基因序列分析结果显示,分离到的6株病毒VP3基因、蛋白与近年来国内流行的鹅细小病毒同源性较高,分别为93.1%～99.6%与95.9%～99.4%。其中,BCH株、JLJT株、LY株属同一分支,与浙江、扬州等地区分离的鹅细小病毒相似性较高,达到99.4%-99.6%;ZL株、DH株、PSH株属同一分支,相似性较低。试验表明,吉林省流行的鹅细小病毒与我国南方地区流行毒株同源性较高,与其他地区流行毒株存在一定差异。     

番鸭细小病毒的分离及其VP1基因序列分析

广东省肇庆市某番鸭场1周龄雏鸭发生以腹泻、软脚为主要症状的疾病,结合流行病学调查、剖检变化等初步诊断为番鸭细小病毒(MDPV)感染。为进一步探明病原,本研究采集死亡鸭肝脏和胰脏处理后接种鸭胚上皮细胞,细胞出现变圆、脱落等典型的细胞病变。用番鸭细小病毒VP1基因特异性引物对病毒进行PCR扩增并测序。结果显示,VP1基因大小为2 199 bp,与GenBank已发表的6株MDPV参考毒株的VP1基因序列同源性达98%以上,其中与福建株同源性最高,达99.4%。利用鸭胚上皮细胞成功分离到一株番鸭细小病毒,将其命名为MDPV-ZQ株。本研究为掌握番鸭细小病毒的流行病学及其变异趋势提供参考依据。     

貉细小病毒分离鉴定及其VP2基因序列分析

本研究从山东省某貉养殖场发病貉粪便样品中分离到一株貉细小病毒(raccoon dog parvovirus,RDPV)。为了解该毒株的特性及其致病特点,对发病貉粪便处理后接种F81细胞,收获病毒液进行VP2基因序列分析、理化特性研究以及貉人工感染试验。结果显示:该分离株与RDPV参考株核苷酸同源性高达99.4%,属于犬细小病毒2型(CPV-2);对氯仿等不敏感,耐酸耐热,符合细小病毒特征;分离毒株对貉具有较强的致病力。结果表明,山东省仍存在RDPV流行且致病性有增强风险,须针对性研发RDPV疫苗,加强对RDPV流行的控制。本试验为RDPV流行病学研究提供了数据支持。     

番鸭细小病毒和鹅细小病毒广东株VP1基因的克隆与序列分析

参考GenBank中的MDPV FM株和GPV B株全基因序列,设计并合成一对引物,分别对MDPV GD株和GPV GD株的结构蛋白基因(VP1)进行PCR扩增,并克隆到pMD18-T载体,筛选到重组质粒并测序.通过对MDPV GD株和GPVGD株的VP1基因的核苷酸序列分析,这两种病毒VP1基因大小均为2 199 bp,核苷酸序列同源性为87%,而位于VP1基因上的VP2至VP3基因起始密码子之间的核苷酸序列的差异较大,同源性仅为64%.另外对MDPV GD株和GPV GD株与各地方毒株的VP1和VP3基因核苷酸序列的同源性比较,显示它们之间差异较小.     

新型鸭肝炎病毒的分离鉴定及VP1基因序列分析

为了解新型鸭肝炎病毒(N-DHV)的变异情况,本实验从广西、河南、山东临床发病鸭体内分离到3株病毒.通过RT-PCR检测为N-DHV.将分离株进行鸭胚传代培养,并测定鸭胚毒的ELD50为10-3.29/0.2 mL～10-465/0.2 mL.以1型和N-DHV阳性血清分别与分离株进行血清交叉中和试验,结果表明,Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-1)阳性血清对分离株无保护性.动物回归试验表明,分离株致死雏鸭的临床症状和病变与DHV-1相同,分离株的致死率为30％～70％.将分离株接种鸡胚,不产生任何病变,在鸡胚成纤维细胞中连续传5代后,细胞产生明显、规律的病变.扩增3株分离株的VP1基因,并进行氨基酸序列比对,结果表明3个分离株与DHV-C的同源性最高,与DHV-A的同源性最低,并存在氨基酸的插入和缺失.本实验表明3个分离株与韩国N-DHV属于同一血清型.     

鹅细小病毒H1株VP2基因的克隆和序列分析

参考GenBank发表的鹅细小病毒(GPV)B株全基因序列，设计并合成一对引物，采用PCR方法对国内鹅细小病毒分离株H1(GPV-H1)株的结构蛋白VP2基因进行扩增，将扩增产物与pMD18-T载体连接并测序。结果表明：H1株VP2的核苷酸序列全长1764bp，编码587个氨基酸，与GenBarrk发表的GPV-B株、GPV-SHM株、GPV-YG株、番鸭细小病毒(MDPV)FRANCE株、FM株的VP2相比，核苷酸同源率分别为98．6％、96．2％、93．2％、80．3％、80．0％，推导氨基酸序列同源率分别为98．3％、97．5％、96．1％、88．2％、87．4％。     

貉细小病毒SD1607株的分离鉴定及VP 2基因序列分析

从疑似患细小病毒性肠炎的貉子肠道组织样品中分离到一株貉细小病毒(RDPV-SD1607)。为研究其分子遗传特征,对该分离株VP2基因进行克隆序列分析,结果显示,RDPV-SD1607的VP2序列与RDPV-HB3的相似性最高,为99.49%,属于CPV-2亚型;利用其核苷酸序列建立系统进化树发现,RDPV-SD1607处于犬细小病毒分支,且处于CPV-2亚型和CPV-2a亚型分支之间。结果表明,RDPV-SD1607株与犬细小具有共同的遗传起源,推测其可能正处于CPV-2亚型向CPV-2a亚型进化的中间状态,或是CPV适应貉而形成的新毒株。     

鹅细小病毒不同毒株VP3基因的序列分析比较

分别将GPV4个分离株通过PCR技术，从病毒基因组DNA中扩增出病毒衣壳蛋白VP3完整基因片段，并与PMD18-T质粒载体连接，转化到感受态大肠秆菌TG1中，提取重组质粒经PCR鉴定和酶切鉴定后，对插入片段进行序列测定及分析。结果表明：VP3基因全长1605bp，编码534个氨基酸。不同毒株主要结构蛋白VP3基因同源性较高(95．64％—99．81％)。但强弱毒株间也存在一定差异。     

犬细小病毒昆明流行株的分离鉴定与VP2基因序列分析

为了解昆明市犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)流行及抗原变异情况,有针对性地筛选疫苗及研发新疫苗,本研究从昆明市部分宠物医院收集6份疑似CPV粪便样品进行病毒分离培养,对获得的疑似病毒液进行PCR、免疫荧光试验(IFA)、血凝效价测定、TCID50测定及VP2基因序列分析。结果显示,分离的1株病毒能使F81猫肾细胞产生明显的细胞病变(CPE),PCR扩增产物大小为164bp,IFA鉴定感染的F81细胞出现绿色荧光,血凝效价为1∶512,病毒TCID50为10-4.375/0.1mL,VP2基因PCR扩增条带大小为1 755bp。对分离株VP2结构蛋白进行测序分析,判定该分离株为CPV-2a亚型,与标准毒株存在5个变异氨基酸位点,属于变异株。将测序结果与商品化疫苗株及国内参考株序列进行比对分析,结果显示与弱毒苗Intervet/vaccine/06和Pfizer/vaccine/06核苷酸同源性均为98.7%;与国内参考毒株序列同源性为98.2%～99.5%,与ANTU-1和WH02/06株同源性最高;与ANTU-1株、WH02/06株及BJ01株亲缘关系最近,位于进化树的同一簇。本研究对监测CPV的遗传变异趋势及疫苗的研制具有重要意义。     

犬细小病毒的分离鉴定及其VP2基因序列分析

本试验从北京某动物医院疑似犬细小病毒(CPV)感染犬粪便中分离出一株病毒。通过电子显微镜观察、血凝试验、动物回归试验和分子生物学鉴定,本试验成功分离出一株CPV,命名为BJ-24。对BJ-24株的VP2基因序列分析发现该分离株为CPV-2a亚型,其VP2基因与GenBank中19株CPV VP2基因核苷酸序列有较高的同源性,均在98.7%以上,甚至与CPV-JS2株达到100.0%。系统进化分析结果表明所分离的BJ-24株属于中国分支,与CPV-JS2株遗传距离最近。本试验对进一步开展北京地区CPV的流行病学调查提供基础依据,并对防制病毒传播和疫苗研制奠定了坚实的基础。     

新型鹅星状病毒的分离鉴定与全基因序列分析

为了解近年鹅星状病毒的流行情况,通过鹅胚接种、鹅胚半数致死量测定(ELD_(50))、RT-PCR检测和基因组序列测定等方法,从2019年山东某养鹅场雏鹅疑似星状病毒引起鹅内脏痛风病的病料中分离出1株新型鹅星状病毒,命名为AstV/Goose/SD776/2019。该分离株能引起鹅胚典型的临床症状,病毒无血凝活性,ELD_(50)为10~(-4.0)/0.2 mL,动物回归试验中死亡的雏鹅可以复制出与临床自然感染相似的病变。用RT-PCR对分离株全基因组序列分析结果显示,分离株的3个ORF和与新型鹅星状病毒毒株(JSHA、SD01、SDPY、GD)的核苷酸和氨基酸同源性较高(99.2%以上);与能导致雏鹅肠炎的鹅星状病毒(FLX)及其他种属禽源星状病毒同源性相对较低,遗传进化分析结果显示,分离株在进化树上与4株新型鹅星状病毒的亲缘关系接近,表明分离毒株为新型鹅星状病毒。     

犬细小病毒DD株的分离鉴定和VP2基因序列分析

本实验室对从疑似犬细小病毒感染的发病犬分离的病毒采用同步培养法接种猫肾细胞（CRFK）增殖,通过PCR试验、IFA试验和VP2基因测序分析等方法进行鉴定并分型,获得一株犬细小病毒强毒株,命名为CPV-DD株。对分离病毒进行PCR扩增,可扩增出特异性DNA片段（1 163 bp）;盲传至第6代时,病毒液的HA效价为1∶1...     

狮源猫细小病毒分离鉴定及其VP2基因序列分析

为对疑似感染猫细小病毒的非洲狮进行确诊,了解猫细小病毒的流行特点,通过猫肾细胞（F81细胞）对非洲狮粪便样品进行病毒分离并通过PCR鉴定,对检测到的细小病毒进行VP2基因扩增和分析。结果显示：成功从非洲狮粪便中分离出1株细小病毒,将其命名为FPV CHN-HN-1。该病毒接种到F81细胞上,能使细胞出现拉丝、脱落现象。该分离株与参考的26株细小病毒分离株相似性为97.8%~100%,其中与分离株JN-FPV-96（MZ836373.1）、TZ-FPV-112（MZ836368.1）、FPV-SH2003（MW811187.1）和BJ051（MT270580.1）相似性高达100%;与其他7株猫源细小病毒同属一个分支,与JN-FPV-96、TZ-FPV-112、FPV-SH2003、BJ051遗传距离最近,与其他参考毒株遗传距离较远。本研究为细小病毒病的诊断和治疗提供了依据,也为后期疫苗的研制打下了基础。     

一株犬细小病毒的分离及VP2基因序列分析

采集病犬的粪便,经处理后接种狗肾传代细胞系（MDCK）,培养96h无任何细胞病变,盲传到第3代时细胞系出现明显的细胞脱落,核圆缩,形成CPE（cytopathic effect）。继续传代到第7代。第1、2代的细胞培养物不能凝集猪的红细胞,第3代以后的细胞培养物可以凝集猪的红细胞。采用PCR技术,在各代次的培养物中均能扩增得到特异性的DNA片断,经序列测定后鉴定为犬细小病毒,定名为BJY06。为进一步研究该分离株的遗传演化情况,扩增得到了VP2基因的全序列。经序列测定,用DANStar软件分析表明BJY06毒株为CPV-2a亚型,所得到的VP2基因全长1755bp,含有完整的阅读框架,编码584个氨基酸。与其它亚型的毒株相比较核苷酸的同源性为98.3%～99.6%。氨基酸同源性为97.1%～100%。     

基因C型鸭甲肝病毒的分离鉴定及VP1基因序列分析

为确定发病鸭场的致病原,并掌握该致病原的遗传进化特征,进行了临床病料的RT-PCR检测、病毒分离与鸭胚病变特征观察、分离毒株半数致死量(ELD50)测定、动物回归试验、VP1基因序列分析等研究。结果显示:临床病料样品经DHAV-C特异性引物检测为阳性,病料样品可引起10日龄鸭胚规律性死亡以及肝脏肿大、出血等特征性病变,分离毒株对鸭胚的ELD50为10^-6.32/0.1mL,分离毒株对雏鸭的致死率达100%,并可引起雏鸭精神沉郁、运动障碍、肝脏肿大出血等典型症状,分离毒株VP1基因序列与GenBank中登录的DHAV-C VP1基因的同源性在96.5%~100%之间,遗传进化关系中分离毒株与DHAV-C各毒株处于同一个分支,而与DHAV-A、DHAV-B处于不同分支。试验结果为研制针对DHAV-C流行毒株的诊断试剂和新型疫苗奠定了基础。     

鹅细小病毒广西株的分离鉴定

将广西某养鹅场5日龄发病的雏鹅肝脾处理后接种于10日龄的鹅胚,分离到一株病毒,对死胚收集的尿囊液进行荧光PCR确诊后,对其VP3基因进行扩增测序,通过与GDFSH株(Guangdong)、82-0308株(Taiwan)、HLJ01株(Heilongjiang)和HBZF07株(Hebei)VP3基因序列分析,核苷酸序列同源性在96.2%以上,从分子水平上鉴定该分离株是鹅细小病毒.     

鹅细小病毒不同毒株VP13基因的克隆与序列分析

分别将鹅细小病毒(GPV)的5个分离株通过PCR技术,从病毒基因组DNA中扩增出病毒蛋白VP1和VP3非重叠区的基因片段(VP13基因),并与pMD18-T质粒载体连接,转化到感受态大肠埃希菌Top10中,经PCR鉴定后,对插入片段进行序列测定及分析。结果表明,5株GPV VP13基因全长均为594 bp,编码198个氨基酸。不同毒株主要结构蛋白VP13基因与国外已发表的鹅细小病毒B株核苷酸序列相似性较高(93.4%～98.7%),但毒株间也存在一定差异。