锌对断奶后不同阶段仔猪抗菌肽PR-39 mRNA表达的影响

72头36日龄杜长嘉(♂杜洛克×♀长嘉)断奶仔猪按体重相近要求随机分成3个处理组,每个组设3个重复,每个重复8头猪(公母各半)。对照组(处理1)饲喂不添加任何锌源的基础饲粮(DE 13.2 5 MJ/kg,CP 18.5 % ) ,处理2和处理3分别饲喂添加硫酸锌(10 0 mg/kg Zn)和氧化锌(30 0 0 mg/kg Zn)饲粮。试验分两个阶段进行,分别在5 8日龄和80日龄屠宰取样。本实验室根据已报道的猪抗菌肽PR- 39和看家基因β-肌动蛋白(β- actin)基因序列,分别设计PR- 39和β- actin的引物,探讨了PCR体系中适宜的Mg Cl2 浓度、循环次数,以及两对引物间竞争情况。以此构建一优化的半定量RT- PCR法,以β- actin为内标,研究锌对不同阶段断奶仔猪抗菌肽PR- 39基因表达的影响。结果显示,5 8日龄仔猪试验组与对照组相比,高氧化锌组(30 0 0 mg/kgZn)显著提高了抗菌肽PR- 39基因的表达量,提高量为378.2 6 % (P<0 .0 1) ,硫酸锌组(10 0 mg/kg Zn)使抗菌肽PR- 39基因的表达也分别提高了38.4 % ,但统计结果差异不显著。80日龄仔猪试验组与对照组相比,高Zn O组(30 0 0 mg/kg Zn)中PR- 39基因表达量比对照组分别提高4 .5 2 % ,统计结果无显著变化,Zn SO4 组(10 0 m g/kg Zn)中PR- 39基因表达量比对照组提高了5 1.97% ,统计结果差异显著     

不同锌源对断奶仔猪抗菌肽PR-39 mRNA表达的影响

96头36日龄杜长嘉(杜洛克×♀长嘉)断奶仔猪,按体质量相近原则随机分成4个处理组,每个组设3个重复,每个重复8头猪(公母各半)。对照组(处理1)饲喂不添加任何锌源的基础饲料(DE 13.25 M J/kg,CP 18.5%),处理2、处理3、处理4分别饲喂添加硫酸锌(Zn 100 m g/kg)、氧化锌(Zn 3 000 m g/kg)和纳米氧化锌(Zn 100 m g/kg)饲粮。根据已报道的猪抗菌肽PR-39和看家基因β-肌动蛋白(-βactin)基因序列,分别设计PR-39和-βactin的引物,探讨了PCR体系中适宜的M gC l2浓度、循环次数,以及2对引物间竞争情况。以此构建一优化的半定量RT-PCR法。以β-actin为内标,研究了不同锌源对仔猪抗菌肽PR-39基因表达的影响。结果显示,与对照组相比,高氧化锌组(Zn 3 000m g/kg)显著提高了抗菌肽PR-39基因的表达量,提高量为378.26%(P<0.01),硫酸锌组(Zn 100 m g/kg)和纳米氧化锌组(Zn 100 m g/kg)也分别使抗菌肽PR-39基因的表达提高了38.4%和23.91%,但统计结果差异不显著。     

黄芪杂多糖对仔猪IL-6和PR-39表达的影响

通过运用细胞的分离培养技术、MTT法、ELISA检测和实时荧光定量PCR技术,比较不同剂量黄芪杂多糖(AHPS)注射组与空白对照组的仔猪血液内的T淋巴细胞和单核细胞的增殖活性、IL-6含量;骨髓中抗菌肽PR-39基因的表达水平,研究AHPS对仔猪内源性抗菌肽PR-39的表达调控作用。试验结果表明,AHPS对仔猪血液中的单核细胞和T淋巴细胞有促进作用;IL-6含量在同一时间内呈剂量依赖性增加,随着注射时间的延长逐渐增多;AHPS对PR-39的表达呈显著地上调作用且呈剂量依赖性。根据相关文献和本试验结果推测,黄芪杂多糖可能通过调控IL-6和PR-39的表达提高仔猪的免疫力。     

谷氨酰胺对断奶仔猪抗菌肽PR-39 mRNA的表达调控

本文旨在探讨谷氨酰胺(Gln)对断奶仔猪抗菌肽PR-39 mRNA表达的影响.选取64头胎次相同、28日龄断奶、体重(7.50±0.67)kg的三元杂交仔猪(杜×长×大),随机分为2个组,即基础日粮对照组和1.0%Gln添加组,每组设4个重复,每个重复8头猪(公母各1/2).于试验第28天,进行细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α)含量的分析.于第30天,采用半定量RT-PCR研究日粮中添加Gln对PR-39 mRNA的影响.试验结果表明:Gln添加显著提高仔猪血清中IL-1β含量(P<0.05),但对血清IL-6和TNF-α及空肠黏膜TNF-α、IL-2无显著影响(P>0.05);显著促使骨髓,空肠黏膜中PR-39 mRNA的表达(P<0.05),与对照组相比,骨髓和空肠黏膜中PR-39 mRNA分别提高50.5%(P<0.05)和24.0%(P<0.05).由结果可知,断奶仔猪日粮中添加Gln能显著促使骨髓及空肠黏膜PR-39 mRNA表达上调.     

Porcine Antimicrobial Peptide PR-39 Is Modulated by Lactoferrin in Marrow Cells

PR-39 is a porcine antimicrobial peptide that plays an important role in the innate defense mechanism.We produced monoclonal antibodies(MAbs)against PR-39 by fusing mouse myeloma cells with lymph node cells from BALB/c mice immunized with the reactive site sequence PR-11 of PR-39.Furthermore,we investigated the effect of lactoferrin on PR-39 gene levels and peptide concentrations in cultural supernatants of bone marrow granulocytes by RT-PCR and the competitive inhibition ELISA method established in this study.Two hybridomas 3H5 and 5H7 were selected for developing ascites and contained MAbs against PR-11,which were used for screening the specificity to PR-39 by competitive inhibition ELISA.We found that MAbs were successfully produced against PR-11 and the MAbs had a strong reaction with PR-39 excreted by porcine marrow granulocytes.The ascites had a relatively high titer and the purified MAbs were determined as IgG1.Incubation with 10 or 100 μg/mL lactoferrin significantly increased(P0.05)PR-39 mRNA levels in bone marrow granulocytes after 3 h and 6 h,but 1000 μg/mL lactoferrin reduced(P0.05)PR-39 mRNA expression after 3 h and 6 h compared with control(no lactoferrin added).The relative concentrations of PR-39 in supernatant secreted by marrow granulocytes were significantly increased by 1000 μg/mL lactoferrin after both 3 h and 6 h.These findings suggest a regulatory role of lactoferrin for the antimicrobial peptide PR-39 in marrow cells in vitro.It is possible that the regulation of antimicrobial peptide PR-39 expression may be one of the protective mechanisms of lactoferrin in pigs.     

不同生长阶段猪抗菌肽PR-39基因的表达差异

根据已报道的猪抗菌肽PR-39基因和看家基因β-actin的序列,设计了针对这两种基因的引物,构建了以MgCl2浓度为1.5 mmol/L,循环次数为29的优化半定量RT-PCR法.以β-actin为内标,研究了不同生长阶段猪抗菌肽PR-39基因的表达差异.结果表明,从1日龄到7周龄,PR-39基因表达呈上升的趋势;在7周龄到14周龄,PR-39基因表达略有下降;14周龄到21周龄,PR-39基因表达又有上升的趋势;21周龄到28周龄基因表达再次下降.     

盘尾丝虫ASP1蛋白佐剂活性区不同标签融合表达与佐剂活性比较

为了探明纯化标签对盘尾丝虫活化相关分泌蛋白1(activation-associated secreted protein 1,ASP1)佐剂活性的影响,将其佐剂活性区PR-1编码序列分别与类弹性蛋白多肽(elastin-like polypeptide,ELP)、ELK16自聚肽或His标签进行融合表达,用相变循环、离心洗涤和镍亲和层析进行融合蛋白纯化;将ELP与传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)VP2基因片段进行融合表达,用蛋白酶切除ELP标签后与不同标签融合PR-1免疫小鼠,两次免疫后不同时间采血分离血清,采用ELISA检测VP2特异IgG、IgG1和IgG2c滴度,用试剂盒检测免疫小鼠血清的IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10浓度。结果显示,ELP-PR1、ELK-PR1、His-PR1和ELP-VP2融合蛋白在重组大肠杆菌中均获得正确表达,纯化蛋白纯度大于90%;3种标签融合PR-1均能增强免疫小鼠的抗原特异IgG、IgG1和IgG2应答,并能刺激小鼠产生IFN-γ、TNF-α、IL-6或IL-10细胞因子。在3种PR-1融合蛋白中,ELP-PR1的佐剂活性最强,ELK-PR1与不完全弗氏佐剂相当。本研究探索了不同纯化标签对PR-1免疫佐剂活性的影响,为传染性法氏囊病新型亚单位疫苗佐剂研制提供思路。     

猪源抗菌肽PR-39对畜禽常见病原菌的抑菌活性及与抗生素协同杀菌效应研究

实验旨在测定猪源抗菌肽PR-39对常见病原菌的抑菌活性,以及其与常用抗生素的协同杀菌效应。实验结果表明:PR-39对常见畜禽病原菌均有一定的抑菌活性,但对革兰氏阳性菌的敏感性较差;将PR-39与阿莫西林、土霉素、硫酸链霉素联合使用效果良好。研究结果为PR-39的实际应用提供理论数据,同时体现出PR-39替代抗生素开发成新型饲料添加剂的巨大潜力。今后可重点研究PR-39的杀菌机制以及联合不同抗生素协同杀菌的相关机理,为抗菌肽在新饲料配方中的使用奠定实验基础。     

抗菌肽PR-39研究进展

抗菌肽广泛存在于自然界,是动物先天免疫的重要组成成分。PR-39是其中一类由39个氨基酸残基构成的多肽。文章综述了PR-39在结构、基因表达及其调控、作用机理及生物学活性等方面的研究进展,并对其应用前景进行了展望。     

抗菌肽PR-39的研究进展

抗菌肽广泛存在于自然界中,是动物先天免疫的重要组成成分。PR-39是其中一种含有39个氨基酸残基的小分子抗菌肽。文章就PR-39在结构、基因表达和调控、生物学活性等方面的研究进展及其应用前景进行了综述。     

Porcine Antimicrobial Peptide PR-39 Is Modulated by Lactoferrin in Marrow Cells

PR-39 is a porcine antimicrobial peptide that plays an important role in the innate defense mechanism. We produced monoclonal antibodies (MAbs) against PR-39 by fusing mouse myeloma cells with lymph node cells from BALB/c mice immunized with the reactive site sequence PR-11 of PR-39. Furthermore, we investigated the effect of lactoferrin on PR-39 gene levels and peptide concentrations in cultural supernatants of bone marrow granulocytes by RT-PCR and the competitive inhibition ELISA method established in this study. Two hybridomas 3H5 and 5H7 were selected for developing ascites and contained MAbs against PR-11, which were used for screening the specificity to PR-39 by competitive inhibition ELISA. We found that MAbs were successfully produced against PR-11 and the MAbs had a strong reaction with PR-39 excreted by porcine marrow granulocytes. The ascites had a relatively high titer and the purified MAbs were determined as IgG1. Incubation with 10 or 100 µg/mL lactoferrin significantly increased (P < 0.05) PR-39 mRNA levels in bone marrow granulocytes after 3 h and 6 h, but 1000 µg/mL lactoferrin reduced (P < 0.05) PR-39 mRNA expression after 3 h and 6 h compared with control (no lactoferrin added). The relative concentrations of PR-39 in supernatant secreted by marrow granulocytes were significantly increased by 1000 µg/mL lactoferrin after both 3 h and 6 h. These findings suggest a regulatory role of lactoferrin for the antimicrobial peptide PR-39 in marrow cells in vitro. It is possible that the regulation of antimicrobial peptide PR-39 expression may be one of the protective mechanisms of lactoferrin in pigs.     

布鲁氏菌P39基因的克隆、原核表达及其糖基化修饰

为探究糖基化修饰对布鲁氏菌P39蛋白免疫原性的影响,本试验对布鲁氏菌P39蛋白进行了表达和纯化,并对表达的蛋白进行了甘露六糖修饰。参照GenBank公布的布鲁氏菌P39基因序列设计引物,从布鲁氏菌16M基因组中克隆P39基因片段并连接至pMD19-T载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,提取阳性菌株质粒进行酶切等鉴定,鉴定正确后构建重组质粒pGEX-6P-1-P39,对重组蛋白进行诱异表达与条件优化。利用SDS-PAGE和Western blotting对诱导表达的目的蛋白进行分析,将鉴定正确的蛋白经GST亲和层析柱纯化。通过EDC/NHS法对纯化的P39蛋白进行甘露六糖修饰,研究甘露六糖修饰后目的蛋白对巨噬细胞吞噬的影响。结果显示,本试验成功克隆了片段大小为1 206 bp的目的基因,构建了pGEX-6P-1-P39原核表达载体,在大肠杆菌中成功表达了P39蛋白,该蛋白主要以可溶性形式存在。Western blotting结果显示,在约65 ku处有特异性条带。纯化后获得目的蛋白大小为43 ku,成功对目的蛋白P39进行了糖基化修饰,得到修饰产物与蛋白的摩尔比为2.3∶1。此外,糖基化修饰可显著提前蛋白激活小鼠巨噬细胞的吞噬作用时间。本试验结果可为研究甘露六糖修饰影响P39蛋白免疫原性的机制提供参考。     

猪卵泡抑素基因成熟肽序列的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据猪卵泡抑素(follistatin,FS)基因编码区序列(GenBank登录号:M36512.1)设计并合成1对引物,经PCR扩增获得了FS基因成熟肽序列,将其克隆入pMD18-T载体并转化E.coli DH5α感受态细胞,进行PCR、双酶切及测序验证。然后将其克隆到表达载体pRSET-A的BamHⅠ和HindⅢ酶切位点之间,构建重组质粒pR-FS并转化E.coli BL21(DE3) 感受态细胞,再经PCR、双酶切和测序验证。转化重组质粒pR-FS的重组菌经IPTG诱导后的表达产物进行SDS-PAGE分析,分子质量与预期相符,为26.1 ku左右,经0.2 mmol/L IPTG诱导3 h之后表达量达到最高,约占总菌体蛋白的30%。表达产物可经Ni-NTA凝胶纯化。以上结果表明正确完成了猪FS基因成熟肽序列的克隆及其在大肠杆菌中的表达及纯化。     

布鲁氏菌外膜蛋白16基因的克隆及原核表达

为了成功克隆外膜蛋白16(outer membrane proteins 16, Omp16)基因并对其进行原核表达,试验根据GenBank中羊布鲁氏菌M5-90株外膜蛋白Omp16基因序列(登录号:JF918760.1)设计1对引物,从布鲁氏菌基因组中扩增出大小约为507 bp的目的基因片段,凝胶回收纯化目的片段,连接入pMD20-T质粒,转化E.coli DH5α并测序,测序正确后再亚克隆入pET-28a(+)表达载体,构建重组质粒pET-Omp16,转化入E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导其表达,最后用Western blotting分析方法鉴定诱导得到的蛋白。结果表明,成功构建了pET-Omp16原核表达载体,并在E.coli BL21中表达了Omp16基因,诱导得到的蛋白经鉴定与目的蛋白大小一致,证明成功表达了目的基因。     

猪附红细胞体ORF2的全基因合成、表达与鉴定

通过重叠区扩增法（PCR-based accurate synthesis,PAS）人工合成猪附红细胞体ORF2基因,并使其在大肠杆菌（DE3）中高效表达。根据GenBank注册的AJ504999的ORF2基因序列,选择大肠杆菌偏爱的密码子,设计并合成11对寡核苷酸片段,用PAS方法,人工合成ORF2基因。基因克隆入pMD18-T载体,经测序证实正确后,连接到表达载体PET-28a,获得重组表达质粒PET-28a/ORF2,导入大肠杆菌BL21（DE3）,在37℃,IPTG终浓度1mmol/L的条件下诱导表达,经SDS-PAGE分析,Western-blot鉴定,在35 000附近出现目的片段。同时通过生物信息学软件对其蛋白二级结构及抗原表位等方面进行预测。     

产肠毒素性大肠杆菌K99菌毛蛋白抗原基因的克隆与表达

应用PCR从产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）中扩增出不含信号肽序列的K99菌毛蛋白基因片段，克隆测序后，将该片段连接到E.coli表达载体pET28a( )中，转化E.coli表达菌株BL21（DE3），筛选得到可诱导表达K99抗原的工程菌株。经IPTG诱导，分离纯化K99重组蛋白，以其免疫新西兰大白兔，获得重组蛋白的兔抗血清；免疫印迹分析表明，此重组蛋白制备的抗血清能与标准的K99强毒株姓明显的抗原抗体反应。     

新城疫病毒F基因在大肠埃希菌中的表达及其抗原性分析

构建新城疫病毒融合蛋白F基因的原核表达载体,并将其在宿主菌BL21(DE3)感受细胞中表达.以含有融合蛋白F基因的重组质粒pMD19T-F为模板,设计特异性引物,应用PCR技术扩增获得F基因的F1片段,定向插入原核表达载体pET-28a,构建重组质粒pET-F1,将构建成功的重组质粒pET-F1转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞经IPTG诱导,将其在宿主菌细胞中表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot方法检测.结果显示,成功克隆出了新城疫病毒F1基因片段序列852 bp.构建的pET-F1载体经PCR、双酶切、测序鉴定均无误,转化表达宿主菌后经SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,目的基因被成功表达,并具有良好的反应原性.成功构建了新城疫病毒的融合蛋白F基因原核表达载体,转化宿主细胞后成功表达了融合蛋白F1重组蛋白片段.     

瘦蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用 RT- PCR方法从猪脂肪组织扩增出瘦蛋白基因 ,将其插入 p MD1 8- T克隆载体 ,经序列分析证明 ,所获得的目的基因为 4 4 1 bp,与预期大小一致。提取质粒后用 Eco R 和 Xho 双酶切 ,克隆入 p ET- 2 8a表达载体 ,将阳性重组质粒转化表达受体菌 E.coli BL 2 1 ( DE3) ,经 IPTG诱导 ,SDS- PAGE检测 ,证明在 E.coli BL 2 1中正确表达了重组猪瘦蛋白     

新城疫病毒核衣壳蛋白基因在大肠埃希菌中的表达、纯化及其活性分析

构建新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)核衣壳蛋白(nucleocapsid protein, NP)基因的原核表达载体,并将其在宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中表达。以NDV La Sota株NP基因序列为模板,设计特异性引物,通过PCR扩增获得NP蛋白全长基因片段,定向插入原核表达载体pET-30a,构建重组质粒pET-NDV NP;将构建的重组质粒转化宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导,表达出目的蛋白,并采用亲和层析的方法纯化表达蛋白;表达蛋白采用Western blotting方法检测其反应原性。结果显示,成功克隆了新城疫病毒NP基因全长,片段序列1470 bp;构建的pET-NDV NP载体经PCR、双酶切、测序鉴定均无误;转化表达宿主菌后经SDS-PAGE检测结果显示目的基因得到成功表达,且表达蛋白经Ni-NTA镍离子亲和层析法被成功纯化,蛋白质浓度为3 mg/mL;Western blotting检测结果显示表达蛋白具有良好的反应原性。试验结果表明,成功构建了含有新城疫病毒核衣壳蛋白基因的原核表达载体,成功表达、纯化得到了NDV NP蛋白。