西伯利亚鲟β-actin基因cDNA全长克隆、序列分析及其作为内参基因的应用研究

采用同源克隆和RACE技术获得西伯利亚鲟(Acipenser baerii)β-actin基因cDNA全长,序列分析表明西伯利亚鲟β-actin基因cDNA全长1322bp,其包括的137bp的5′端非翻译区,57bp的3′端非翻译区和编码375个氨基酸残基的1128bp开放阅读框。与其他物种比对,该基因具极高的保守性。同时也利用同源克隆技术获得了西伯利亚鲟Sox2基因的同源保守区,该序列长768bp,编码256个氨基酸,也具较高的保守性,与其他物种的相似性在70%以上。以β-actin作为内参基因,对Sox2基因在西伯利亚鲟成鱼各组织及胚胎发育各时期进行实时荧光定量PCR检测,发现Sox2基因在不同组织中均有表达。其中,在肝、胰、肾、脑4个组织中表达量差距不大,均处于相对较低的水平,在肌肉组织中表达量最高,达到了肝脏的10.4倍。同时Sox2基因虽在西伯利亚鲟胚胎发育各时期均有表达,但表达也具明显的时间差异性。在受精卵期、囊胚期Sox2基因的相对表达量较低,在原肠期、神经胚期、视泡形成期和心脏形成期Sox2基因相对表达量较高,且在心脏形成期达到最高点。本研究为量化西伯利亚鲟发育分化过程中相关基因提供了坚实的参照工具,增加了后续试验的可信度,同时可为今后深入研究西伯利亚鲟Sox2在侧线神经节分化发育、细胞迁移过程中的作用提供基础参考依据。     

泥鳅β-actin启动子介导的革胡子鲶GH重组基因的构建及启动活性研究

为获得快速生长的泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus),研究了泥鳅β-actin基因启动子介导的革胡子鲶(Clarias gariepinus)生长激素(growth hormone,GH)重组基因。采用PCR和RT-PCR技术克隆泥鳅β-actin基因近端启动子、3′-UTR及革胡子鲶GH基因编码区,构建一个长为2 418bp的GH重组基因DPRK。首先,构建了以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因作为报告基因的重组表达载体p AF(pβ-actin promoter-EGFP),然后转染DF1真核细胞,同时经酶切线性化后显微注射到斑马鱼(Danio rerio)和泥鳅的受精卵中,以评价泥鳅β-actin启动子的启动活性。其次,将重组基因DPRK显微注射到泥鳅受精卵中。结果显示:泥鳅β-actin启动子能在DF1细胞、斑马鱼和泥鳅的受精卵中启动绿色荧光蛋白的表达;泥鳅的荧光表达率(78.44%)显著高于斑马鱼(29.62%);泥鳅受精卵显微注射DPRK 20d后,在m RNA水平检测到GH基因的表达。这表明泥鳅β-actin基因近端启动子具有显著的启动活性,且重组基因DPRK能在泥鳅体内表达,为下一步泥鳅的基因工程育种奠定了理论基础。     

大菱鲆消化道蛋白酶的初步研究

以-龄大菱鲆为材料,研究养殖水温下不同pH条件胃、幽门盲囊、前肠、中肠、后肠中蛋白酶的活性,确定饵料中蛋白质的主要消化部位为胃和前肠,各部位主要蛋白酶的最适作用pH依次为2.0、8.0、8.0、8.5、8.0;蛋白酶单位酶活力从高到低依次为幽门盲囊＞胃＞前肠＞中肠＞后肠.以大菱鲆胃为材料,经Tris-HCl缓冲液抽提、硫酸铵分级分离,DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-100凝胶过滤层析分离纯化,获得大菱鲆胃蛋白酶的电泳纯制品,并对该酶的性质进行了研究.结果显示:纯酶的分子量为39900Dal,纯酶最适反应pH为2.0,最适反应温度40℃;pH稳定范围1.0-9.0,40℃以下酶活性稳定;Mn2+和Cu2+可激活大菱鲆胃蛋白酶,Fe3+对酶活性有抑制作用.     

大菱鲆多聚免疫球蛋白受体基因的克隆及表达分析

鱼类多聚免疫球蛋白受体(polymeric immunoglobulin receptor, pIgR)是黏膜免疫系统的关键因子, 能够介导多聚免疫球蛋白向黏液中的转运和分泌。本研究利用同源克隆和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE), 首次得到了大菱鲆(Scophthalmus maximus) pIgR完整的cDNA序列, 全长1 584 bp, 该序列包含一个1 005 bp的开放阅读框及5’和3’UTR, 编码334个氨基酸。同源性比较发现, 大菱鲆pIgR氨基酸序列与牙鲆(Paralichthys olivaceus)、斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)、红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)的序列相似性分别是74%、74%和59%, 表现出较高的保守性。多序列比对显示, 硬骨鱼pIgR包含两个ILD (Ig-like domain), 分别对应哺乳类的ILD1和ILD5区域。系统进化树分析表明, 大菱鲆pIgR和牙鲆的聚为一支。半定量RT-PCR显示, pIgR在健康大菱鲆各组织中均有表达, 但表达水平不同, 其中在黏膜相关淋巴组织中表达最强。经灭活的鳗弧菌菌液浸泡处理后, 实时荧光定量PCR结果显示, 大菱鲆各组织中pIgR的相对表达量在72 h内均呈现先增加后减少的趋势, 在48 h内均有一个最高值出现, 且黏膜相关淋巴组织中峰值出现较早, 说明pIgR在硬骨鱼类黏膜免疫中发挥了重要作用。

     

大菱鲆促黄体激素受体基因的克隆及其生物信息学分析

通过兼并引物扩增及RACE技术,克隆大菱鲆促黄体激素受体(luteinizing hormone receptor,LHR)基因,分析其相应生物信息学特征和组织表达。结果显示:LHR基因序列全长3 184 bp,编码685个氨基酸,同大西洋庸鲽同源性最高。氨基酸序列分析发现,该基因编码蛋白为疏水性蛋白,相对分子量76.54 ku,理论等电点7.22,存在信号肽序列和跨膜区;亚细胞定位主要在内质网和细胞膜;预测该蛋白含有33个磷酸化位点、5个糖基化位点、6个富含亮氨酸重复序列、7个跨膜保守结构域,二级结构以无规则卷曲为主,三级结构其结构域呈α螺旋状构象;蛋白功能预测表明,LHR主要在辅助、运载、翻译和代谢调节过程中发挥关键作用。组织表达分析表明,LHR基因除在卵巢大量表达外,在其他非性腺组织也有表达,尤其是在肝脏表达较高。上述结果为深入探讨LHR基因在大菱鲆性腺发育过程中的生物学功能奠定了遗传信息基础,也为研究其他海水养殖鱼类生殖调控提供重要参考。     

大菱鲆Scophthalmus maximus L.引进养殖的初步研究

大菱鲆是欧洲的一种海产鲆鲽类。欧洲经数十年研究，已经形成一种养殖产业并达到事业化的生产水平。实践证明：这是一种潜力巨大的养殖良种，其主要特点是体形优美、风味独特、性格温驯、适应低水温生活、生长迅速、容易接受配合饵料、宜于集约化养殖，而且商业价值甚高，因而受到世界的注目。黄海水产研究所已于１９９２年将其引进我国，三年来试养情况良好，年增长速度接近１ｋｇ，初步证明大菱鲆适于在我国北方沿海开展养殖。     

养殖大菱鲆鳗弧菌疾病的初步研究

从某养殖场患病的大菱鲆病灶和肝肾等组织分离到一株病原菌YC-01,经人工感染健康大菱鲆后,其皮下、鳍基部、及口部皮下出血,皮肤溃烂、腹部膨胀等,与自然发病大菱鲆的症状相同.药敏实验结果表明,菌必治、氟哌酸、呋喃妥因、复达欣、红霉素、卡那霉素,对YC-01有较强的抑制作用,该菌株对四环素、磺胺类、青霉素等抗生素有耐药性.经过光镜和电镜的综合形态观察,生理生化特征测试,标准菌种比对等,可将病原菌CY-01鉴定为鳗弧菌.     

大菱鲆鱼体生化组成及营养价值的初步探讨

分析了大菱鲆鱼体的生化组成，并根据鱼体的生化组成，对大菱鲆的营养需求及营养价值进行了初步探讨，这将对进一步研究大菱鲆的营养需求，提高大菱鲆配合饲料的配制水平以及提高大菱鲆的商品价值提供参考和理论依据。     

大菱鲆的摄食量与排空速率的初步研究

以常规实验生态方法,研究商品鱼养殖中大菱鲆的摄食量与排空率,得出个体体重约(420±65)g,在(18 6±0 5)℃日投喂1次的条件下,摄食量为15～30g/尾,平均摄饵量为(41 03±1 71)g/(kg·d),空胃率约11%,在同样条件下的排空周期约20h,初始排粪出现在投食后6h,排泄速率高峰出现于12～14h,排粪量为0 77～1 35g/(kg·h)。建议在适温期中,以鲜杂鱼为饵料的该鱼养成期的合理日投饵1次,投喂量以体重的4%为宜。     

大菱鲆肠道蛋白酶的分离纯化及性质的初步研究

以大菱鲆肠道为材料,对大菱鲆消化生理中起重要作用的肠蛋白酶的分离纯化条件和理化性质进行了研究。经Tris-HCl缓冲液抽提,硫酸铵分级分离,DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-100凝胶过滤层析分离纯化,获得大菱鲆肠蛋白酶Ⅰ的电泳纯制品,并对该酶的性质进行了研究。结果显示:纯酶的分子量约为58kD。纯酶最适反应pH为9.0,最适反应温度50℃;pH稳定范围6.0~11.0,30℃以下酶活性稳定;Mn2 可激活大菱鲆肠蛋白酶Ⅰ,Cu2 、Zn2 、Ag 、Fe3 则对酶活性有抑制作用;巯基蛋白酶抑制剂显著抑制大菱鲆肠蛋白酶Ⅰ的活性,金属蛋白酶抑制剂对大菱鲆肠蛋白酶Ⅰ无影响。50℃、pH9.0条件下以双倒数作图法得大菱鲆肠蛋白酶Ⅰ催化酪蛋白水解的Km值为2.92g.L-1。     

鲮β-肌动蛋白基因的分子克隆及其作为分子内标的可靠性分析

β-actin是actin家族的一员，在维持细胞结构、细胞内运动和细胞分裂等细胞生理活动方面发挥着重要的作用。克隆的鲮（Cirrhinus molitorella）β-aetin基因的cDNA全长1 804bp，开放阅读框长1 128bp，编码375个氨基酸，5’和3’末端非翻译区域（UTR）分别为94bp和582bp。RT-PCR结果表明，β-actin在未经LPS刺激的和经LPS刺激的鲮心脏、肾脏、肌肉、肝脏、脾脏、肠、脑和皮肤等8种组织中广谱表达，表达水平没有明显差异，可以作为基因表达调控研究的分子内标。鲮与其他鱼类β-actin基因编码区核苷酸序列同源性在85.9％～99.6％。分子系统进化树分析表明，可将鱼类分成鲤形目，鲈形目，鲑形目和合鳃目4大支，与传统分类一致，β-actin基因核苷酸序列是研究分子进化的一个很好的分子标记。     

大菱鲆趋化因子受体CCR3和CCR9基因的克隆及组织表达

本实验克隆了大菱鲆趋化因子受体基因CCR3和CCR9的全长cDNA, 并进行了鉴定。其中, 全长cDNA的克隆采用了5′和 3′-RACE。CCR3 cDNA全长1 451 bp, 包括92 bp的5′非编码区, 276 bp的3′非编码区以及编码360个氨基酸的1 083 bp的开放阅读框。CCR9 cDNA全长1 441 bp, 包括59 bp 的5′非编码区, 278 bp 的3′非编码区, 以及编码367个氨基酸的1 104 bp的开放阅读框。两种受体均具有7次跨膜结构, 符合G蛋白偶联受体的序列特征。系统进化分析表明, 大菱鲆CCR3与其他鱼类CCR3聚为一支, 大菱鲆CCR9也与其他鱼类的CCR9聚为一支; 系统进化树显示的亲缘关系符合各物种的进化地位。实时定量 PCR (qRT-PCR)表明这两个基因在大菱鲆正常组织中均有一定量的表达, 尤其是它们在头肾、脾及心脏中均有高水平的表达。在脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)诱导之后, CCR3在脾和肝中的表达水平与对照组有显著性差异(P<0.05), 而CCR9的表达水平仅在肝中与对照组有显著性差异(P<0.05)。两个基因在免疫相关组织中表达水平较高, 并且能够对LPS产生免疫应答, 说明它们在大菱鲆免疫系统中发挥了重要功能。

     

大菱鲆长距离运输条件的初步研究

大菱鲆（Scophanzus maxintus Linnaeus）,属鲆科（Bothidae）、菱鲆属（Scophamus）,是自然分布于大西洋东侧欧洲沿岸、北海和黑海西部沿岸以及地中海的冷水性底栖鱼类,是欧洲重要的水产养殖种类之一．在20世纪90年代初引进中国,现已成为我国北方工厂化养殖的主要品种。     

大菱鲆胚胎玻璃化方法研究

用大菱鲆(Scophthalmus maximus)神经期胚对6种抗冻剂的毒性进行检测,发现其毒性排列为1,2-丙二醇(PG)<甲醇(MeOH)<甘油(Gly)<二甲基甲酰胺(DMF)<乙二醇(EG)<二甲亚砜(DMSO).以DMF为主因子配制和筛选出11种玻璃化程度较好的玻璃化液,并用大菱鲆肌节期胚对其中5种玻璃化程度最好的玻璃化液进行检测,结果显示,A4(DMSO 20%+DMF 25%)、A7(DMSO 25%+DMF 20%)较适合于大菱鲆胚胎的平衡处理,利用A4和A7平衡处理神经期胚、肌节期胚、心跳期胚、出膜前期胚,结果显示大菱鲆神经胚和肌节胚对玻璃化液的适应能力较强.实验测试出不同时期胚胎在两种玻璃化液中的成活率,为大菱鲆各期胚胎在玻璃化液中的平衡处理提供了依据.利用大菱鲆肌节胚对不同的平衡步骤进行了筛选,发现五步法的平衡效果较好.     

养殖大菱鲆肠道中大菱鲆弧菌的分离鉴定及药敏试验

2014年11月,大连地区某大菱鲆养殖场发生病害并伴有死亡,主要症状为吻部下颌明显出血,腹腔积水,肝脏充血,肠道出血有白便。从患病大菱鲆肠道中分离出1株可在硫代硫酸盐—柠檬酸盐—胆盐—蔗糖琼脂培养基上生长的菌株HZ-C1,人工回接感染试验证明其对健康大菱鲆具有较强致病性。通过形态学观察、16SrDNA序列同源性分析及生理生化试验确定菌株HZ-C1为大菱鲆弧菌。药敏检测结果显示,大菱鲆弧菌HZ-C1对氯霉素、丁胺卡那及头孢曲松等11种抗生素敏感,但对青霉素、四环素及诺氟沙星等15种抗生素耐药。本研究为大连地区养殖大菱鲆细菌性病害防治提供了一定病原学依据。     

中国大菱鲆虹彩病毒主要衣壳蛋白基因的PCR扩增及序列分析

应用同源PCR技术，从被一种球状病毒感染的患病大菱鲆（Scophthalmus maximus）脾脏和肾脏组织中扩增出了一段长度为620bp的DNA片断。序列测定和Blast分析表明，该DNA片断与鱼类虹彩病毒主要衣壳蛋白（MCP）C末端编码区的DNA序列高度相似，由此证实感染养殖大菱鲆的这种球状病毒为一种鱼类虹彩病毒，暂命名为大菱鲆红体病虹彩病毒（TRBIV）。多序列比对和分析发现，TRBIV MCP C末端的205个氨基酸序列与GenBank中20种虹彩病毒相应序列的相似性分别为99．47％（韩国大菱鲆虹彩病毒）、97％～98％（待指定病毒属的7种病毒），以及50％以下（蛙病毒属、淋巴囊肿病毒属、虹彩病毒属的12种病毒），由此绘制出了包含TRBIV在内的21种虹彩病毒的系统发育树。研究结果表明，感染中国养殖大菱鲆的TRBIV属于虹彩病毒科待指定病毒属，位于该属ISKNV亚群和RSIV亚群之间，是该病毒属的一个新成员。     

大菱鲆红体病毒的提纯和初步SDS-PAGE分析

通过实验在大菱鲆中发现一种被怀疑为由虹彩病毒引起的疾病。采用蔗糖密度梯度离心的方法,从患病大菱鲆的脾、肾、肝脏和鳃等不同组织中提纯到了100 nm左右的病毒粒子;对提纯的病毒粒子进行SDS-PAGE分析。     

大菱鲆消化系统的组织学和组织化学研究

为探讨大菱鲆的消化生理,用组织学和组织化学方法对其消化系统进行了研究。胃黏膜上皮由柱状细胞组成,胃腺上皮由Ⅰ型细胞和Ⅱ型细胞构成,幽门盲囊与肠黏膜上皮由柱状细胞和数量不等的黏液细胞组成。胃黏膜柱状细胞呈现酸性磷酸酶和一定的脂酶活性;胃腺Ⅰ型细胞分泌黏液,Ⅱ型细胞呈现蛋白酶活性。幽门盲囊与肠黏膜柱状细胞呈现蛋白酶、脂酶和非特异性酯酶活性,其游离端胞质和质膜还分别具有酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性。肝细胞呈现蛋白酶活性,另有贮存糖原和脂肪等功能。胰腺仅显示较弱的脂酶及非特异性酯酶活性。     

大菱鲆营养成分与食用价值研究概述

根据国内外研究成果,对大菱鲆Scophthalmus maximus L.(多宝鱼)的主要营养成分、食用价值以及养殖管理方式进行综述.结果表明,大菱鲆不仅因含有丰富的鲜味氨基酸而味道鲜美,而且含有丰富的人体所必须的营养物质,如必须氨基酸和高度不饱和脂肪酸(DHA和EPA)等,是一种有益于人类心脏保健、能延缓衰老和促进儿童生长发育的优质海水鱼类.大菱鲆在我国主要采用"温室大棚 深井海水"工厂化养殖模式流水养殖,养殖水源洁净无污染,严格遵循现有的养殖和管理技术规范,保证养殖产品安全和无公害,可以放心食用.     

养殖大菱鲆使用甲醛残留状况研究

试验针对工厂化养殖大菱鲆大量使用甲醛的现状,研究使用甲醛后对大菱鲆食用安全性的影响。主要通过测定用药后不同时间大菱鲆体内的甲醛残留量,探索甲醛在大菱鲆可食部分中的残留状况。研究发现,用药初期甲醛在大菱鲆体内会有一定量残留,但随时间延长残留量不断下降,在一定时间后大菱鲆可食部分甲醛残留量可以达到未检出水平。试验结果提示,大菱鲆工厂化养殖规范化使用甲醛,在第8天可以达到未检出水平,不会影响产品可食部分。