枣疯病植原体的分子检测与同源性鉴定

[目的]采用植原体16S通用引物建立枣疯病植原体PCR检测体系.[方法]采用植原体16S rDNA通用引物R16mF1/R16mR1,对陕西和山西具有枣疯病的枣树植株总DNA进行PCR扩增,获得了相关的枣疯病植原体序列.采用DNAMAN软件分析其同源性,绘制系统进化树.运用pDRAW32软件对17种具有16S rDNA分组的典型的限制性内切酶进行计算机模拟RFLP,确定枣疯病植原体同源性关系.[结果]从陕西和山西的枣疯病的植株中,分别得到1 433 bp和1 432 bp的条带,与已报道的枣疯病植原体比较,同源性达到99;以上,而与其他植物的植原体16S rDNA同源性多低于93;,并且与16S rDNA V-B组的遗传距离最近.pDRAW32软件模拟RFLP结果表明它们和已报道的JWB的RFLP图谱相似.[结论]枣疯病植原体归属于16SrDNA V-B,为枣疯病植原体PCR检测体系提供了理论基础.RFLP分析进一步验证了枣疯病植原体属于16SrDNA V-B,具有随地域变异性较小的特性,这将有利于不同地区枣疯病检测技术的建立.     

差速离心结合脉冲电泳分离枣疯病植原体DNA

为了解枣疯病植原体的分子特征,明确植原体的致病机理及其与寄主的互作关系,以枣疯病组培苗为材料,利用差速离心结合脉冲电泳分离枣疯病植原体DNA。结果表明:感病组培苗在1600²200 kb之间出现一条明亮的条带,而健康组培苗没有,回收后经PCR检测,证明该目的条带是植原体DNA,实时定量PCR的分离结果表明:该实验方法能有效地将植原体基因组和植物基因组分离。     

差速离心结合脉冲电泳分离枣疯病植原体DNA

为了解枣疯病植原体的分子特征,明确植原体的致病机理及其与寄主的互作关系,以枣疯病组培苗为材料,利用差速离心结合脉冲电泳分离枣疯病植原体DNA。结果表明:感病组培苗在1600~2200 kb之间出现一条明亮的条带,而健康组培苗没有,回收后经PCR检测,证明该目的条带是植原体DNA,实时定量PCR的分离结果表明:该实验方法能有效地将植原体基因组和植物基因组分离。     

北京地区枣疯病植原体16SrDNA基因序列分析

利用植原体16S rDNA基因保守序列通用引物R16F2n/R16R2对北京昌平区西峰山村小枣患病植株总DNA进行PCR扩增,结果得到约1.2 kb的特异性DNA片段.对克隆扩增获得DNA片段测序,结果表明,北京昌平地区枣疯病植原体16S rDNA基因片段长1248 bp,与韩国枣疯病植原体同源性最高,为99.51%.序列同源性比较的结果表明克隆到的植原体归属于榆树黄化组16SrV-C亚组.     

基于secY基因对山东临沂枣疯病植原体的分子鉴定

利用FD9f／r引物对采自山东临沂的枣疯病样品进行secY基因的PCR扩增,并进行了序列测定,结果表明,该特异片段大小为1421bp。对获得的序列与NCBI数据库中相关植原体序列进行同源性分析、构建系统进化树和模拟RFLP分析,结果显示山东临沂枣疯病植原体属于secYV—C亚组,与secYV—B亚组的樱桃致死黄化株系（CLY5）和secYV—N亚组的桃树致死黄化印度分离株系（PY—IN）的亲缘关系最近,在亚组水平上进一步明确了山东临沂枣疯病植原体的分类地位。     

赞皇大枣枣疯病植原体分子分类

 【目的】枣疯病是一种重要的植原体病害,本试验旨在明确惟一已知的天然三倍体品种--赞皇大枣枣疯病植原体的分类地位,为赞皇大枣枣疯病植原体分类研究提供参考。【方法】利用植原体16S rDNA通用引物对赞皇大枣枣疯病病株的DNA进行PCR扩增和克隆测序,通过BLAST比对进行序列分析,利用临位相连法构建16S rDNA系统演化树,并应用DNAstar软件进行虚拟RFLP分析。【结果】获得的赞皇大枣枣疯病植原体16S rDNA序列长度为1 850 bp（GenBank登录号GU184180）,包括1 529 bp的16S rDNA基因全序列、264 bp的邻近间隔区序列及57 bp的23S rDNA部分基因序列。同源分析表明,赞皇大枣枣疯病病原16S rDNA序列与其它植原体的相似性在87%—98%,其中与榆树黄化 Elm yellows（EY）(GenBank登录号l33763)最高相似性为98%;与大多数二倍体枣品种的植原体序列相似率达99%以上;其虚拟RFLP图谱与4个16SrⅤ亚组的代表序列图谱差异显著,赞皇大枣枣疯病植原体延伸因子tuf基因的序列(GenBank登录号JN001985) 比对结果表明,与其它亚组序列同源性为52.3%—76.7%。【结论】三倍体赞皇大枣枣疯病病原属于榆树黄化组(16Sr V),并与其中的B亚组亲缘关系最近;与二倍体品种的病原分类地位一致,说明枣疯病植原体在系统进化上比较保守。     

北京地区枣疯病植原体16S rDNA基因序列分析

利用植原体16S rDNA基因保守序列通用引物R16F2n/R16R2对北京昌平区西峰山村小枣患病植株总DNA进行PCR扩增,结果得到约1.2 kb的特异性DNA片段。对克隆扩增获得DNA片段测序,结果表明,北京昌平地区枣疯病植原体16S rDNA基因片段长1 248 bp,与韩国枣疯病植原体同源性最高,为99.51%。序列同源性比较的结果表明克隆到的植原体归属于榆树黄化组16SrV-C亚组。     

春季枣疯病植原体在树体内的分布及对叶片组织发育的影响

为明确枣疯病植原体早春在枣树植株体内的移动和分布,揭示枣疯病植原体的致病机制,利用nested-PCR法检测春季枣树新生枝叶中枣疯病植原体的积累情况,结果显示,发病丛枝春季可以部分萌发,初期即含有植原体。轻度发病植株植原体分布不均匀,主要分布在发病枝和相邻部位;重度发病植株各部位枝条均可带毒,植原体检出时间与距离发病枝条远近相关。用石蜡切片法比较分析叶片组织结构,结果显示,枣疯病植原体侵染导致叶片结构发育受到抑制,叶片厚度减小,角质层和表皮细胞变薄,薄壁细胞显著减少,叶脉组织结构排列紊乱,形成层和薄壁细胞明显变形和减少,厚角细胞和晶体分泌细胞明显减少。     

枣疯病植原体LAMP可视化检测方法的建立

根据枣疯病植原体16SrDNA基因保守序列,设计出4条特异性环介导等温扩增(LAMP)引物。通过对反应条件的优化,建立一种适用于枣疯病植原体的可视化LAMP检测技术,对优化后的方法进行特异性、灵敏度评价。结果显示,该方法能够特异性地检测出枣疯病植原体,且LAMP产物的特异性通过MaeⅡ酶切得到验证;灵敏度较常规PCR高出100倍;并可通过肉眼观察反应液颜色变化,直接判定结果。建立的枣疯病植原体LAMP可视化检测方法适用于基层及现场快速检测,为枣疯病的快速检测提供了新方法。     

超速离心结合Real-time PCR分离纯化枣疯病植原体DNA

分离纯化枣疯病植原体基因组DNA,有助于进一步开展对此病原全基因组测序的研究,CTAB法提取枣疯病叶片的总DNA后,采用氯化铯双苯酰亚胺密度梯度离心法从枣树总DNA中富集纯化枣疯病植原体DNA,并通过Real-time PCR方法对分离纯化效果进行定量检测。在此基础上,探索了不同CsCl初始密度对DNA分离效果的影响。在20℃,初始密度为1.650 0g/cm3,经206 000×g下离心23h后,感染枣疯病样品(IS)的离心管中出现2条DNA亮带,正常枣树样品(NS)离心管中只有1条。Real-time PCR检测结果表明NS管中的条带为枣树基因组DNA;IS管中与NS管中相同位置的条带为枣树基因组DNA,另1条带为枣疯病植原体基因组DNA。在保留其他试验条件下,不同CsCl初始密度,会影响DNA条带的位置,也会影响枣疯病植原体DNA与枣树DNA的分离效果,在1.562 2g/cm3的初始浓度下分离效果最好。采用超速离心法可以有效地从感染枣疯病的枣树中分离得到纯的枣疯病植原体DNA,同时利用Real-time PCR法可以实现分离效果的评价,利用此方法分离得到的DNA可用于枣疯病植原体的全基因组测序。     

枣疯病植原体新疆分离物16S rDNA基因克隆与序列分析

利用植原体16SrDNA基因保守序列通用引物对新疆阿克苏地区和喀什地区的疑似枣疯病植株总DNA进行常规PCR和巢式PCR检测,分别扩增出1.5kb和1.2kb的特异性片段。对片段进行克隆、序列测定分析及系统发育树构建,结果表明,新疆枣疯病阿克苏分离物和喀什分离物的16SrDNA基因序列同源性极高,达到100%,与16SrⅤ组植原体的同源性达到98.4%以上,并且与16SrⅤ-B亚组中的枣疯病山东莱芜株系、山东龙口株系同源性最高,达到99.5%,因此归属于榆树黄化组16SrⅤ-B亚组。首次报道新疆枣疯病植原体16SrDNA的序列,确定新疆枣疯病植原体的分类地位,为枣疯病的早期诊断和检测提供依据。     

枣疯病植原体胸苷激酶基因的克隆、序列分析与原核表达

枣疯病(jujube witches’-broom, JWB)俗称枣树的“癌症”,是由枣疯病植原体导致的侵染性病害,给我国的枣栽培与生产造成了严重危害,对枣疯病植原体增殖基因的研究有助于枣疯病的有效防治。为获得枣疯病植原体胸苷激酶基因(tdk),利用PCR方法扩增该基因并测序,结果表明,该基因的开放阅读框长度为576 bp,编码191个氨基酸,其蛋白质分子量为21.76 ku。序列分析和预测表明,该蛋白质为植原体细胞质中性质相对稳定的亲水蛋白质。遗传距离和进化树分析显示,植原体tdk基因比其16S rDNA基因的保守程度低,tdk基因和16S rDNA基因序列的进化树高度相似,表明tdk基因适于植原体分子分类。为获得枣疯病植原体TDK蛋白,成功构建了原核表达载体pET-28a-JWB-Heze-tdk;在诱导条件为0.1 mmol·L^-1 IPTG、20℃、140 r·min^-1时,该原核表达载体在Escherichia coli BL21(DE3)菌株中可表达出大量可溶性的N端融合了6×His标签的JWB-Heze TDK蛋白;利用Ni-I...     

植原体的侵染对不同抗性枣叶片内源IAA、ZT的影响

对不同抗性枣品种组培苗嫁接接种前后叶片内源激素含量进行的高效液相色谱分析结果表明,枣各抗病品种比敏感品种内源游离IAA含量水平高,不同抗性的枣品种接种病原后较健康对照含量低,且都存在极显著差异。枣敏感品种内源ZT含量水平高于抗病品种,且有至少5%差异水平。接种后较接种前内源ZT含量水平提高,且达到了极显著水平。     

安徽地方枣种质枣疯病植原体16S rDNA序列分析

为研究安徽地方枣种质枣疯病16S rDNA序列特性,以健康及表现枣疯病症状的繁昌长枣叶片DNA为模板,克隆枣疯病植原体16S rDNA序列,获得1条1 248 bp的片段,命名为JWB-FJP1。同源性分析结果表明,JWB-FJP1属于16Sr V-B组,与重庆地方枣枣疯病植原体JWB-Xch(JQ675716)同源性最高,达到99.92%;与河北枣枣疯病植原体JWB-Hebei(GU184186)同源性最低,为67.06%,说明不同地区枣疯病植原体存在一定的生物学特异性。本研究结果为安徽地方枣种质枣疯病病原分类及其快速鉴定提供了理论依据。     

枣疯病和酸枣丛枝病植原体16S rDNA和tuf基因的序列同源性分析

 【目的】枣疯病是枣树上由植原体引起的一种毁灭性病害，遍布于中国华北、西北、华东、华南等25个省(市)的枣区，造成了巨大的经济损失。【方法】经PCR扩增，分别对中国陕西的彬县、阎良、武功、佳县、杨凌，河北沧州和山东德州7个枣区的枣疯病样品和杨凌4个酸枣丛枝病样品植原体16S rDNA基因保守序列和延伸因子tuf基因进行克隆和测序。【结果】获得枣疯病和酸枣丛枝病植原体的16S rDNA基因片段均为1 239 bp，tuf基因均为851 bp。通过序列同源性比较，结果表明中国陕西、河北、山东的枣疯病的病原一致，归属于植原体16S rⅤ-B组。由于枣疯病和酸枣丛枝病的植原体16S rDNA有5个碱基的差异，tuf基因的同源性为99.6%，推测为同一个种的不同寄主生物学型。【结论】首次报道了中国枣疯病和酸枣丛枝病植原体16S rDNA和延伸因子tuf基因的序列，确定了枣疯病和酸枣丛枝病植原体的分类地位，为研究枣疯病植原体的致病分子机理、遗传本质提供理论依据。     

枣疯植原体免疫优势膜蛋白基因imp-DZ的克隆与原核表达

[目的]为了解枣疯植原体免疫优势膜蛋白的特征,并进行初步表达.[方法]对北京农学院农业农村部华北都市农业重点实验室测得的枣疯植原体JWB-Dongzao免疫优势膜蛋白基因imp-DZ序列进行一致性、进化树和蛋白信号肽与跨膜区分析,分别设计引物扩增完整imp-DZ序列和去除跨膜区编码序列,克隆到蛋白表达载体pBM30上进行原核表达.[结果]imp-DZ基因序列大小为459 bp,编码152个氨基酸,除与枣疯植原体Jwb-nky中一个编码假定蛋白的基因一致性达到96％之外,与其他植原体imp基因核苷酸和氨基酸序列一致性均低60％.枣疯植原体JWB-Dongzao的imp-DZ与16SrV组其他成员imp基因聚在一个分支.携带Imp-DZ跨膜区的重组菌无法表达该蛋白,去掉跨膜区后蛋白得到大量表达.[结论]该研究成功表达了枣疯植原体的免疫优势膜蛋白Imp-DZ,证实了跨膜区影响其在大肠杆菌中的表达,为下一步制备该蛋白抗血清和探索植原体与寄主植物互作机制提供依据.     

泡桐丛枝病植原体研究综述

综述了泡桐丛枝病植原体的检测方法、传播途径、植原体防治以及植原体引起泡桐体内的物质变化。并对泡桐丛枝病植原体的研究进展作了进一步展望。     

骏枣不同株系间的枣疯病抗性多样性

【目的】揭示骏枣品种内枣疯病抗性多样性,筛选高抗枣疯病的骏枣株系。【方法】以骏枣的16个株系为试材,通过田间调查和PCR检测,研究不同株系在嫁接侵染枣疯病后的症状表现和病原侵染情况;利用“合成-合理满意度”和多维价值理论的合并原则,对不同株系果实的相对含水率、单果重、可食率、果形指数、Vc含量、可溶性糖和可滴定酸含量等性状指标进行综合评价;采用AFLP技术对不同株系进行基因组遗传多样性分析。【结果】不同株系对枣疯病抗性表现出显著差异,可分为感病型、延迟感病型、延迟抗病型和抗病型4种类型,T15、J2、J5、J8这4个骏枣株系高抗枣疯病,其中,T15、J5和J8的果实综合性状在骏枣株系中亦居于较高水平;进一步的AFLP分析发现,不同抗性类型间在基因组水平上存在一定差异。【结论】筛选出了4个抗枣疯病骏枣株系,其中3个株系果实综合品质良好。     

枣树脱除类菌原体(MLO)技术的研究

本文应用热处理与茎尖分生组织培养相结合等方法,成功地脱除了枣疯病类菌原体(MLO),并筛选出适合茎尖分生组织培养的培养基,在国内外未见报导.同时,首次应用了迪纳氏染色、苯胺蓝染色、DAPI染色等组织化学方法检测枣疯病类菌原体(MLO),试验证明DAPI染色法灵敏度高.特异性强,对枣树苗木的检疫、抗枣疯病品种的筛选具有重要意义.