禽网状内皮组织增生症病毒的分离鉴定、全基因序列分析及致病性试验

本试验采集广东某鸡场疑似禽网状内皮组织增生症患病鸡病料并进行处理,经接种DF1细胞、聚合酶链式反应（PCR）及特异性间接免疫荧光试验（IFA）,分离鉴定出1株禽网状内皮组织增生症病毒（REV）,命名为 GD1210。依据已发表的REV前病毒全基因组序列设计并合成6对引物,采用分段扩增的方法完成了分离株的全基因组序列测定。结果显示,该分离株基因组序列全长8443 bp。将该分离株的基因序列与国内外各参考株相应序列进行同源性比对分析,与SNV株亲缘关系最近,核苷酸同源性最高。将该分离株感染1日龄SPF鸡以鉴定其致病性,结果显示该分离株使SPF鸡产生严重的免疫抑制作用。     

野鸭源禽网状内皮组织增生症病毒的分离与鉴定

利用扩增禽网状内皮组织增生症病毒(REV)长末端重复序列(LTR)的特异性引物作为检测引物,对采集于吉林省某地健康野鸭的脏器样品进行PCR检测。阳性样品经DF1培养增殖,进行病毒的分离,经PCR和间接免疫荧光(IFA)方法鉴定,确定分离到2株REV,分别来自于针尾鸭和绿头鸭,将分离病毒分别命名为DBYR1101和DBYR1102。克隆2个病毒株的主要保护性抗原基因gp90,并进行序列分析。结果显示,2个分离株gp90基因氨基酸相似性为99.5%;DBYR1101 gp90基因与REV 3个型的代表株170A、SNV和CSV的氨基酸相似性分别为95.7%、94.2%和98.2%;DBYR1102 gp90基因与REV 3个型的代表株170A、SNV和CSV的氨基酸相似性分别为95.2%、93.7%和97.7%;与中国早期南方分离株HA9901的氨基酸序列相似性分别为94.7%和94.2%;与中国北方分离株氨基酸序列相似性为99.2%～100%。核苷酸遗传进化分析表明,2个野鸟源REV分离株与现有的东北分离株亲缘关系较近,趋于形成1个北方分离群;与SNV株亲缘关系最远;与170A株亲缘关系较远;与美国和中国台湾地区的某些分离株相似性较高。该研究首次自野鸭体内分离到REV,丰富了REV流行病学资料,同时提醒我们重视野生鸟类迁徙在疾病传播中所扮演的角色,为深入研究REV致病机制、免疫抑制机制等奠定基础。     

禽网状内皮组织增殖病病毒GD09株的分离与全基因组测序

从广东某鸡场送检的疑似禽网状内皮组织增殖病的病鸡中采集病料,处理后经接种DF-1细胞,经聚合酶链式反应(PCR)及特异性间接免疫荧光试验(IFA),分离并鉴定出1株禽网状内皮组织增殖病病毒(reticuloendotheliosis virus,REV),命名为GD09。依据已发表的REV前病毒全基因组序列设计并合成6对引物,采用分段扩增的方法完成了分离株的全基因组序列测定。结果显示,该分离株基因组序列全长8295 bp,符合典型的复制完全型反转录病毒的基因组结构,基因序列中不含已知致癌基因。将该分离株的亚群特异性gp90基因序列与国内外各参考株相应序列进行相似性比较分析,结果表明,GD09分离株与中国分离株HA9901亲缘关系最近,核苷酸相似性最高。     

寿光鸡中禽网状内皮组织增生病毒的分离鉴定及其env基因序列分析

某寿光鸡群发生肿瘤病例,从瘦小的鸡中随机抽取10只鸡接种鸡胚成纤维细胞进行针对禽白血病毒（ALV）、禽网状内皮组织增生病毒（REV）和鸡马立克氏病毒（MDV）等三种肿瘤病毒的分离和鉴定,结果显示ALV和REV均为阴性,但分离到3株REV（SD1301、SD1302和SD1303）。对3株REV的env基因进行了扩增、克隆和序列分析,结果显示3株REV之间的env基因核酸同源性为100％,与国内参考毒株比较显示,3株REV分离自中国黑龙江的HLJR0901缘关系最近。本研究显示了地方品系鸡中REV感染的存在,表明要加强对我国地方品系中REV的检测和净化。     

禽网状内皮组织增生症病毒研究进展

禽网状内皮组织增生症病毒(Avian reticuloendotheliosis virus, REV)属于反转录病毒科正反转录病毒亚科γ反转录病毒属的一种具有包膜的单股正链RNA病毒。禽感染REV后引发急性网状细胞肿瘤、慢性淋巴肿瘤、矮小综合征等症状,导致鸡群大量死亡或发育不良,严重威胁着我国养禽业的安全。笔者从REV的病原学、流行病学、致病机理与防控方面进行综述,为REV的基础研究及防控提供科学参考。     

双重PCR检测禽源生物制品中禽网状内皮组织增生症病毒和禽白血病病毒

为了快速、准确检测禽源生物制品中的禽网状内皮组织增生症病毒(REV)和禽白血病病毒(ALV),根据GenBank中登录的REV参考毒株LTR基因序列和ALV P27基因序列,设计合成2对特异性引物。在建立各病毒单项PCR检测技术的基础上,优化反应条件,建立2种病毒的双重PCR检测方法。结果:可同时扩增REV的467 bp和ALV的675 bp的特异性片段,而对其他5种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该双重PCR技术能检出10 pg的ALV和10 pg的REV模板。用双重PCR技术与REV的间接免疫荧光法及ALV ELISA对245份疫苗株检测,进行同步比较,结果总符合率为100%。表明建立的双重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,对这2种外源病毒的同时检测,显示出了较好的可行性。     

禽痘病毒活疫苗中网状内皮组织增生病病毒的分离鉴定及其序列比较

为了从怀疑污染禽网状内皮组织增生病病毒（Reficuloendotheliosisvirus,REV）的禽痘病毒（Fcwlpoxvirus,FPV）活疫苗中分离病毒,将市场上购买的某些厂家的禽痘弱毒疫苗接种7日龄SPF雏鸡。在5d后采其抗凝血浆接种鸡胚成纤维细胞（chickenembryofibroblast,CEF）,在连续传2代后,用REV特异性单抗做间接免疫荧光试验,确认REV感染,命名为JS0809。提取感染细胞的DNA,采用PCR扩增env基因。测序分析表明,该毒株的env基因开放阅读框同大部分REV-毒株一致,为176lbp。JS0809的囊膜蛋白基因（envelopeproteingene,env）与国内已发表株的同源性高达96．0％-99．％。相对而言,它与早年分离到的毒株的同源性只有96％-97．3％,但与近几年的分离珠的同源性则均高达99．5％-99．8％。它与整合进FPV野毒株中的全基因组REV的env基因同源性很高为99．8％,而与整合进FPV疫苗株中全基因组REV的env基因同源性较低仅为97．3％。本研究证实了在我国生产的某些FPV疫苗中存在REV污染,所污染的REV的env基因更接近最近的流行野毒,这是国内第一次报道从禽痘弱毒疫苗中分离~qREV活毒。     

禽网状内皮组织增生症病毒检测方法研究进展

禽网状内皮组织增生症(RE)是危害养禽业的一种重要病毒性肿瘤病。本文概述了禽网状内皮组织增生症病毒(REV)实验室检测方法的研究进展。在细胞生物学方面,主要依靠病毒分离培养、病毒电镜形态检查、病毒特异性抗原及其抗体的检查等。在分子生物学方面,主要依靠国内外相继建立起的PCR、荧光定量PCR、LAMP技术及斑点分子杂交等。介绍和比较了各种方法的优缺点和实用性,为临床兽医科技工作者建立快速、简便、准确、实用的检测方法提供参考。     

禽网状内皮组织增生症病毒检测方法研究进展

禽网状内皮组织增生症（Reticuloendotheliosis,RE）是危害养禽业的一种重要病毒性肿瘤病。本文概述了禽网状内皮组织增生症病毒（REV）实验室检测方法的研究进展。在细胞生物学方面,主要依靠病毒分离培养、病毒电镜形态检查、病毒特异性抗原及其抗体的检查等。在分子生物学方面,主要依靠国内外相继建立起的PCR、荧光定量PCR、LAMP技术及斑点分子杂交等。介绍和比较了各种方法的优缺点和实用性,为临床兽医科技工作者建立快速、简便、准确、实用的检测方法提供参考。     

应用PCR法检测禽源生物制品中禽网状内皮组织增生症病毒

为了快速、准确检测禽源生物制品中的禽网状内皮组织增生症病毒,根据GenBank中登录的REV参考毒株LTR基因序列,利用Primer Premier5.0软件设计合成了1对特异性引物,其扩增产物长度为314bp,建立了PCR法。经与间接免疫荧光法进行同步比较试验,发现结果吻合性较高,而且PCR法的结果更为直观,易于判断,样品保存方便,重检也方便,当日即可完成,显示出了较好的可行性。     

1株库蠓源版纳病毒的分离与全基因组序列分析

为分析云南省虫媒病毒的种类与遗传特征,在云南省师宗县采集库蠓进行病毒的分离与鉴定;通过全长cDNA扩增与高通量测序技术获取病毒全基因组序列,进行序列比对与系统发生树构建。结果显示,从采集的库蠓样本中分离出1株可在C6/36细胞上引起细胞病变的毒株（YNSZ043）,病毒基因组为分节段双链RNA,琼脂糖凝胶电泳呈"2-4-3"的带型特征;电镜观察可见直径为70~80 nm,呈"指环状",表面具有纤维突起的病毒粒子。全基因组测序结果显示,YNSZ043毒株为版纳病毒（Banna virus,BAV）,基因组大小为20 683 bp,由Seg-1（3 762 bp）至Seg-12（861 bp）12个基因节段组成,与中国BAV毒株各基因节段的核苷酸序列相似性在64.8%~99.6%之间,氨基酸序列相似性在58.8%~100%之间,在系统发生树上YNSZ043毒株与中国分离的BAV聚为一簇,形成独立的中国进化支系。对决定BAV基因型的Seg-12分析结果显示,YNSZ043毒株属于A2基因型,该毒株的Seg-5/VP5与越南分离BAV毒株的核苷酸和氨基酸序列相似性高达97.1%和97.6%,表明该毒株的Seg-5基因节段很可能与越南毒株之间发生了基因重配。研究结果丰富了中国BAV的基因组序列,为开展云南省BAV的流行病学研究提供了参考。     

猪德尔塔冠状病毒CH7328株的致病性及全基因组序列分析

为了解猪德尔塔冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV） CH7328株的致病性,并分析其基因变异和遗传演变规律,试验通过病毒培养、间接免疫荧光试验（IFA）、病毒生长曲线及仔猪致病性试验鉴定病毒的生长特性和致病性,并分析该毒株的全基因组序列。结果显示,感染PDCoV CH7328株的ST细胞出现肿大变圆、细胞呈碎玻璃状且拉丝、细胞集聚成簇和脱落等病变。IFA结果显示,PDCoV CH7328株主要分布在细胞质中。生长曲线结果显示,PDCoV CH7328株在6 h就已开始增殖,在36 h时达到峰值,对应的TCID₅₀为10^-8.0/mL,随后逐渐下降。仔猪致病性结果显示,攻毒组仔猪出现腹泻、脱水和厌食等临床症状,仔猪小肠明显变薄、透明而充盈,小肠绒毛严重脱落、萎缩或减少、肠绒毛细胞坏死等。粪便病原检测结果显示,在攻毒第2天便能检测到病毒,之后排毒持续增加,而正常对照仔猪无任何临床现象。全基因组测序及序列分析显示,PDCoV CH7328株的基因组全长为25 420 bp,与国内GD株的相似性最高,达到99.9%;遗传演化结果显示,PDCoV CH7328株与国内HKU15-155、CHN-HN-2014和GD株处在同一进化分支,亲缘关系最近。本研究结果为中国PDCoV疫苗候选株的筛选及猪场疫病防控提供了参考数据和理论依据。     

云南省蓝舌病病毒血清7型毒株的分离与基因组序列分析

2014年,我国广东省的哨兵牛上分离出蓝舌病病毒血清7型(B T V-7)毒株,但该血清型病毒在我国的流行情况尚不清楚,本研究旨在分离我国流行的BT V-7型毒株并掌握其遗传特征.作者在云南省景洪市勐罕镇设立哨兵牛,每周定时采血,并接种C6/36、B H K-21细胞分离虫媒病毒,通过病毒蚀斑试验与增殖曲线分析病毒在细...     

猪流行性腹泻病毒SD201604株的分离鉴定及致病性研究

本研究旨在获得猪流行性腹泻病毒（PEDV）分离株,并对其致病性进行研究。应用Vero细胞从山东某猪场腹泻病料中进行病毒分离,通过细胞病变、免疫荧光试验、电镜观察和RT-RCR进行鉴定,并对分离株的S基因序列进行分析;应用10^3.5 TCID₅₀/mL分离株口服接种3日龄仔猪并观察临床症状和病理变化;用不同滴度的分离株分别口服接种3日龄仔猪（3 mL/只）,统计各组仔猪的死亡率,确定最小致死量。结果显示,成功分离到1株PEDV,命名为PEDV SD201604株。该分离毒株能在Vero细胞上增殖,产生细胞病变,传代至F6代时病毒滴度可达10^3.5 TCID₅₀/mL,免疫荧光试验和RT-RCR检测均为PEDV阳性。电镜观察可见直径大小约为100 nm的病毒粒子,有明显的囊膜和纤突,具有PEDV病毒粒子典型的形态特征,确定分离株为PEDV。S基因序列分析显示,分离株为国内流行的PEDV变异株。动物回归试验结果显示,口服感染该分离株的5头3日龄仔猪全部出现典型的PED临床症状和病理变化,其中3头死亡。最小致死量试验结果表明,口服感染3 mL病毒含量为10^4.5 TCID₅₀/mL的分离株可使仔猪全部死亡。本试验结果可为PEDV的分离鉴定及生物学研究提供参考与借鉴。     

从J亚群禽白血病肿瘤中检测出禽网状内皮组织增生症病毒

将表现为典型 J亚群禽白血病肿瘤的病料分别接种于鸡胚成纤维细胞和 DF1细胞 ,采用间接荧光抗体试验(IFA)和 PCR方法 ,从这些肿瘤病料中分离和鉴定出 8株 J亚群禽白血病病毒 (AL V- J)。对证明感染了 AL V- J的细胞继续培养 ,并用禽网状内皮组织增生症病毒 (REV)的特异性单抗及引物做 IFA和 PCR,在 8株 AL V- J中 ,有 3株AL V- J的感染细胞中同时有 REV感染。由此表明 ,发生肿瘤的肉鸡中 ,AL V- J和 REV的共感染已相当普遍。将这 3株 REV- SD0 0 0 3、SD0 0 0 4和 SD0 10 2的 3′- L TR用 PCR扩增、克隆和序列比较 ,发现分离的 SD0 0 0 3、SD0 0 0 4和SD0 10 2与国内的另外 2株 REV- SD990 1和 HA990 1的同源性为 96 .7%和 96 .1% ;而与另 1株 REV参考株鸭脾坏死性病毒 (SNV)的同源性高达 99%。     

1株林麝源绿脓杆菌的分离鉴定及全基因组序列分析

旨在确定甘肃省天水市某林麝养殖场致死林麝的病原菌,并开展其致病性和耐药性研究及全基因组序列分析。采集病死林麝肺,通过细菌的分离纯化、生化鉴定和16S rRNA基因序列分析,对分离菌进行鉴定;随后对其致病性和药物敏感性进行分析,并在分离菌全基因组测序的基础上,对分离菌全基因组序列进行组装和注释,对毒力基因toxA和exoT进行遗传进化分析。结果表明,从病死林麝肺中分离到一株绿脓杆菌,命名为TS2019。致病性试验测得分离菌对小鼠的LD₅₀为2.82×10⁷CFU·mL^-1;药敏试验结果表明,TS2019具有多重耐药性,但对环丙沙星、洛美沙星等药物敏感。基因组测序表明,TS2019基因组全长为6 308 327 bp,编码5 929个基因,其中有1 035个编码产物参与新陈代谢途径;全基因组中有毒力因子编码基因875个,产物有黏附蛋白、调控因子、毒性蛋白等;有四环素类、氨基糖苷类等抗生素耐药相关基因5 288个。遗传进化分析表明,TS2019毒力基因toxA、exoT与GenBank中绿脓杆菌众多菌株相应基因序列相似性均高于99%,其中eoxT基因与中国杭州人源分离株P33的遗传关系最近,但处于独立分支。本研究从病死林麝肺分离鉴定到一株绿脓杆菌,并证实该菌有较强致病性和多重耐药性,其毒力基因toxA和exoT与GenBank中绿脓杆菌相应基因序列具有高度相似性。研究结果为林麝绿脓杆菌感染相关疾病的防治提供了理论支持,也为绿脓杆菌致病机制和耐药机制的深入研究奠定了基础。     

一株禽多瘤病毒的分离鉴定及其VP1基因序列分析

从陕西某养鸟场发病鹦鹉幼雏体内分离到1株禽多瘤病毒(201808SX株),该病毒能在7日龄SPF鸡胚上繁殖,并呈现明显的胚体病变。通过克隆测序,获得了禽多瘤病毒(201808SX株)VP1基因全基因序列。同源性分析表明,201808SX分离株与不同地区不同时间APV分离株的VP1基因核苷酸同源性均较高,不低于99.4%,与2006年日本分离株、2009年中国潍坊分离株、2018年中国山东分离株和2018年中国C4-15分离株等同源性最高,均为100%。遗传进化分析表明,201808SX分离株在遗传进化上与2006年日本分离株、2009年中国潍坊分离株、2018年中国山东分离株、2018年中国C4-15株、2010年波兰分离株和2016年葡萄牙分离株处于同一小分支,均属于CladeⅡ分支。这是国内首次报道,将临床病料组织上清经卵黄囊接种7日龄SPF鸡胚成功地分离到APV,这为BFD的研究和防控奠定基础。试验结果也首次证实陕西地区虎皮鹦鹉中存在APV感染,丰富了国内APV流行的基础数据。     

禽传染性喉气管炎病毒分离鉴定及gD基因序列分析

河北省沧州市某养鸡场饲养的510日龄蛋鸡发生急性上呼吸道疫病。为确定病因,采集发病鸡气管组织样品处理后接种鸡胚,利用特异性引物进行禽传染性喉气管炎病毒（ILTV）、禽传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、J型禽白血病病毒等有关病原的PCR扩增,结果从接种病毒的鸡胚绒毛尿囊液中只扩增出ILTV gD基因片段（1 133 bp）,将分离的毒株命名为Hebei2021株;将分离株扩增产物连接载体构建质粒,测序后进行核苷酸序列同源性分析、氨基酸序列比对,并对分离株及参考株gD基因序列进行遗传进化分析,利用在线预测服务器预测gD蛋白二级结构及糖基化位点。结果显示：分离株与国内外参考株及疫苗株gD基因的核苷酸同源性均在99.0%以上,与参考毒株相比仅极个别氨基酸序列位点发生突变;分离株与江苏省分离株之外的国内其他分离株均在同一进化分支上,与疫苗株相比其糖基化位点并未发生突变。结果表明,此次河北省分离株gD基因较为保守,变异程度较低,当前疫苗对ILTV依然有较好的免疫保护力。本研究为禽传染性喉气管炎的流行病学调查和疫苗选择提供了参考。     

1株鸡滑液囊支原体的分离鉴定与全基因组分析

鸡滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae,MS）能引起家禽呼吸道疾病、传染性滑膜炎、蛋壳顶端异常及生长迟缓等,给全球养禽业带来巨大的经济损失。然而不同国家和地区MS的耐药性和致病性存在差异,因此本研究旨在挖掘福建MS菌株的特征。作者采集福建省疑似患MS的病鸡关节腔内容物,对菌株进行分离鉴定,并利用三代联合二代测序技术对其进行全基因组测序。结果显示,该分离株病原特性稳定,已保藏至中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC No.：M 2021210,并将其命名为MS-FJ01。MS-FJ01基因组全长为795 381 bp,GC含量为28.39%;预测编码基因数为704个,占整个基因组的90.48%;并在COG、GO和KEGG数据库分别注释到476、382、425个基因。通过各数据库的分析,注释了40个耐药相关基因,4个碳水化合物相关酶基因,136个病原与宿主互作相关基因,47个毒力因子相关基因,106个膜转运蛋白相关基因,25个限制修饰相关基因。通过与MS HN01和MS 5-9基因组进一步比较发现,MS-FJ01与这两个中国菌株均存在良好的共线性关系,且与MS 5-9的亲缘关系更近。本研究阐明了福建MS菌株的基因组结构、通过相关数据库的分析,预测和注释了其基因的功能,为深入研究MS提供参考依据。