欧美杨PdSIKI基因的克隆与功能分析

[目的]筛选抗旱节水欧美杨品种。[方法]以欧美杨为材料,通过RT-PCR方法从欧美杨叶片中克隆到抗旱PdSIKI基因,将其转入拟南芥中,研究转PdSIKI基因拟南芥的表型性状和生理指标。[结果]PdSIKI基因开放阅读框为2 442 bp,编码813个氨基酸。蛋白质分析表明PdSIKI蛋白含有典型的类受体蛋白激酶高度保守的丝氨酸/苏氨酸结构域和跨膜区域。荧光定量PCR分析表明该基因在顶端叶中表达量最高,功能叶、根和茎中则无表达。逆境胁迫分析表明该基因受Na Cl、ABA和干旱诱导表达明显。与野生型相比,干旱处理下转PdSIKI基因拟南芥表现出更强的生长状态,且叶绿素含量降低,丙二醛含量升高。[结论]超表达PdSIKI基因提高了拟南芥抗干旱能力。     

欧美杨脱水素PdDHN2b的克隆与表达分析

以欧美杨为材料,通过RT-PCR方法从欧美杨叶片中克隆到了抗旱脱水素DHN2b基因(命名为PdDHN2b),该基因开放阅读框为1 440 bp,编码379个氨基酸,绝大多数氨基酸组成属于亲水性氨基酸,无明显跨膜结构域。亚细胞定位表明PdDHN2b基因定位在细胞质或细胞膜上。荧光定量PCR分析表明:该基因在顶端中表达量最高,功能叶、根和茎中则无表达。同时该基因受NaCl、ABA和干旱等诱导表达。另外,构建了原核表达载体pET-PdDHN2b,并在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白,诱导纯化后免疫小白鼠,制备抗体。SDS-PAGE电泳结果表明,融合蛋白分子量为58 ku。最后利用Ni-NTA纯化的PdDHN2b-his重组蛋白用于Western blot分析。      

短柄草2C 型蛋白磷酸酶基因BdPP2C2 的克隆及表达分析

从短柄草中克隆获得一个2C 型蛋白磷酸酶基因,命名为BdPP2C2。序列分析结果表明,该基因ORF 的 长度为1 368 bp。进化分析结果表明,该基因所编码的蛋白与拟南芥AtPP2C56 的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR 分析结果表明,该基因的表达显著受ABA、乙烯、双氧水3 种信号分子诱导,并且受高盐和低温胁迫诱导。这些结果 表明,BdPP2C2 是非生物逆境胁迫中的一个应答因子,并且可能受相关信号分子调控。     

耐盐杜梨蛋白磷酸酶基因PbPP2C的克隆及表达分析

2C型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2C)是植物体内脱落酸ABA信号传导关键负调控酶,在植物耐非生物胁迫中发挥着重要的作用。本研究利用RT-PCR技术,克隆出编码杜梨PP2C蛋白的基因Pb PP2C,其核苷酸序列全长1 353 bp,开放阅读框长1 263 bp,编码422个氨基酸残基,这些残基中包括了与二价金属离子结合的MED、DGH、DG和D结构域。系统发生分析结果表明,该氨基酸与拟南芥AHG3亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析结果表明:盐胁迫条件下,Pb PP2C基因在根、茎、叶中的表达12 h达到峰值,同时在根中72 h达到第二个峰值;干旱胁迫条件下,Pb PP2C基因在根、茎、叶中表达72 h达到峰值。说明Pb PP2C与杜梨耐盐和耐干旱胁迫存在紧密关联。     

猪白细胞介素-2基因的克隆与表达

根据GenBank上发表的猪白细胞介素-2（Interleukin．2,IL-2）基因序列,设计1对引物。采用RT-PCR技术,以ConA刺激的猪外周血淋巴细胞为材料,从总RNA中扩增出484bp的特异性片段,将其克隆入pGEM-Teasy载体。序列测定表明;扩增片段为猪IL-2基因,该基因与GenBank上发表的猪IL-2基因的核苷酸序列同源性达99．8％。将其定向克隆至原核表达载体pET32a,构建了表达重组猪IL-2的基因工程菌株,经IPTG诱导表达和层析纯化,获得了纯化的重组猪IL-2蛋白。     

基因C型鸭肝炎病毒VP1基因的克隆表达及其多克隆抗体的制备(

采用RT-PCR方法,扩增基因C型DHV JFX08株的VP1基因,与pMD18-T载体进行连接,构建新型DHV VP1基因克隆重组质粒。然后将VP1基因定向插入到pET-32a(+)表达载体中,筛选原核表达载体pET-32a-VP1,进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳分析表明,基因C型DHV-VP1基因可在大肠杆菌中稳定高效的表达。Western-blot检测表明,表达产物可与基因C型DHV阳性血清发生特异性反应。将纯化的重组蛋白免疫4周龄SPF鸡,以纯化的VP1重组蛋白和基因C型DHV全病毒分别包板,制备的抗血清ELISA效价分别可达1∶25 600,1∶51 200,表明该重组蛋白具有良好的免疫原性。     

猪圆环病毒2型ORF2基因片段的克隆与原核表达

为在原核表达系统中表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因片段,提取感染PCV2的细胞基因组DNA,PCR扩增ORF2基因片段并克隆至pMD-18T载体上,经PCR、酶切及测序鉴定后,将该基因重组至pET-28a原核表达载体,构建了表达载体pET-28a-ORF2。该重组质粒在大肠杆菌BL21中经1mmol/LIPTG于37℃诱导5h得到最佳表达。表达重组蛋白的分子量为26.0kD,以包涵体形式存在。Western-Blot分析表明,该重组蛋白与PCV2阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性。     

水稻SIDP301基因的克隆与功能分析

水稻是一种非常重要农业粮食作物,属于单子叶植物,对其进行抗逆相关基因克隆功能分析有非常重要理论意义,水稻SIDP301基因编码蛋白质含有锌指结构域,数据表明基因在水稻各个组织中都有一定表达,根和叶水平比较高,基因受到高盐和高温诱导,对照相比可以发现基因耐盐性不是非常明显,抑制基因高盐具有高敏感检测相关标记基因,在抑制超量转基因表达中高于野生型植株,是一个抗逆相关基因,会降低水稻抗逆性。     

沙芥幼苗叶片小热激蛋白基因的克隆与表达

在对转录组和蛋白组数据联合分析的基础上,通过RT–PCR方法克隆得到沙芥幼苗叶片2个小分子热激蛋白基因PcHSP26.5和PcHSP17.8,运用生物信息学软件分析它们的核苷酸和编码蛋白,通过Real–time PCR分析其在高温、低温、NaCl、ABA和干旱复水胁迫下的表达模式。PcHSP26.5和PcHSP17.8开放阅读框分别为699 bp和462 bp,分别编码282和153个氨基酸,其中PcHSP26.5包含1个内含子。PcHSP26.5、PcHSP17.8的相对分子质量分别为26 480、17 490,理论等电点分别为6.36、5.99;均无跨膜结构与信号肽位点,属于亲水蛋白。亚细胞定位预测和进化树分析表明,PcHSP26.5主要定位于线粒体中,属于MⅡ亚族;PcHSP17.8主要定位于细胞质中,属于CⅠ亚族。实时荧光定量PCR结果表明：高温胁迫下,沙芥PcHSP26.5和PcHSP17.8基因的相对表达量均在1 h达到顶峰,之后下降;低温胁迫下,沙芥PcHSP26.5基因的相对表达量在0.5 h达到顶峰,之后下降,沙芥PcHSP17.8基因的相对表达量在0.5~12 h内低于对照,24 h时出现上升趋势;NaCl胁迫下,沙芥PcHSP26.5和PcHSP17.8基因的相对表达量分别在 1 h和3 h达到顶峰,之后下降;ABA胁迫下,沙芥PcHSP26.5和PcHSP17.8基因的相对表达量均在2 h达到顶峰,之后下降;干旱复水胁迫下,沙芥PcHSP26.5和PcHSP17.8基因的相对表达量均在干旱9 d达到顶峰,复水后下降。     

猪圆环病毒2型Cap基因的克隆与原核表达

利用PCV2鄂州株的基因序列设计特异性引物,分别在上、下游引物中加入Sac I和Hind III酶切位点,扩增出PCV2鄂州株的ORF2基因;将该片段克隆至p ET-28a原核表达载体,经PCR、酶切鉴定,成功构建了阳性重组表达质粒p ET-ORF2。将其转入大肠杆菌Rosetta中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析确定重组蛋白大小为34.5 k D,主要以包涵体的形式表达。优化后确定最佳诱导条件为:37℃,至OD值0.4⁰.6时加入终浓度为1 mmol/L的IPTG,诱导5 h。表达产物经His-tag镍柱纯化后进行Western-blot分析,结果表明表达的重组蛋白能够与PCV2标准阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。     

11种美洲黑杨无性系抗旱性评价

为探究杨树抗旱性的机理,采用石蜡切片法对11个美洲黑杨无性系进行叶片解剖结构观测。通过隶属函数法和灰色关联度法对其叶片厚度、中脉厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、上层栅栏组织厚度、下层栅栏组织厚度、CTR等7项指标进行抗旱性综合评价及其相关性分析。结果表明,11个美洲黑杨无性系抗旱性大小依次为:南抗杨>美洲黑杨2号>美洲黑杨3号>08H4-5>08H2-16>03S4-1>69杨>08H11-11>美洲黑杨1号>陕林3号>08H1-6。此外,上下层栅栏组织厚度、叶片厚度等指标与美洲黑杨无性系的抗旱性关联度最高。该研究可为美洲黑杨无性系的遗传育种和高效培育提供科学依据。     

美洲黑杨物候性状变异研究

[目的]分析美洲黑杨物候性状之间的相关性。[方法]采用完全随机区组设计，通过将物候观测记录量化并绘图研究了美洲黑杨物候性状的变异及其相关性。[结果]对于所有植株，开花、萌芽和落叶的极差分别为18、18和31d，平均日期分别为12、16和22d。萌芽最早的14个A类无性系有12个属于开花早的第一类无性系。开花早的60个第一类无性系中有39个是雄性无性系，占总数的65％；落叶早的12个无性系中有7个已知其性别，有4个是雄性无性系，占总数的57．14％。生长期较长的是78、63等家系，生长期较短的是93．94等家系。萌芽与生长期的相关系数为0．87027，开花与生长期及萌芽的相关系数分别为0．79251和0．69486。开花与落叶的相关系数为-0．05107。[结论]该研究为芙洲黑杨的杂交育种及引种推广提供了可靠的理论依据。     

美洲黑杨在昆明地区引种栽培的适应性分析

以1年生美洲黑杨大苗为研究材料,通过在昆明市盘龙区阿子营、宜良、禄劝、寻甸种植美洲黑杨,分析其在昆明地区的适应性及耐水湿性。结果表明：在阿子营、宜良、禄劝3个区域土壤厚度为85~100cm,土壤肥力较好的农田林网附近的平地栽植美洲黑杨,种植3年后苗木的存活率均达到95%以上,3a内苗木树高、胸径、冠幅年平均增长量依次为42m、4cm、936cm,3a后美洲黑杨在阿子营、宜良、禄劝地区内树高均达到14m以上,胸径达13cm,冠幅达310cm以上,其生长情况已经达到速生杨树在其适生地的正常生长水平;地下水位分别是50、100、150cm的3个不同地块种植美洲黑杨,其种植3年后保存率均达到85%左右,其中地下水位为100cm的地块种植的美洲黑杨生长情况最佳;栽植山体中上部的美洲黑杨保存率较山体下部（水岸旁）较低,生长情况较差,感虫率高,枯枝率高,因此,山体中上部不适宜美洲黑杨的栽植。     

南方型美洲黑杨种质资源物候期特征

以湖北石首南方型美洲黑杨种质资源库中的443个黑杨种质为对象,对其进行物候观测分析。结果表明:不同美洲黑杨无性系物候之间存在较大差异,不同的物候期表现出不同的时序特征,变异最大的物候是叶变色始期,变异系数达到52.74%,其次是叶全部变色期和芽膨大始期。与变色落叶相关的各物候期之间相关性极显著,与萌芽相关的各物候间也显著相关;同时,第一主成分是与叶黄叶落有关的因子,第二主成分是与萌芽展叶有关的因子,第三主成分载荷较高的是落叶末期和全部落叶期,其中第一、第二、第三主成分累计贡献率达到87.29%。不同种源地的纬度与萌芽展叶物候期呈正相关,与叶变色落叶物候期呈明显的负相关。     

不同立地类型对引种美洲黑杨生长的影响

分别选取农地、河岸、半山坡、山坡中上部、箐沟以及不同地下水位平地等立地类型,开展引种美洲黑杨的生长状况观测.结果表明,在不同立地类型下美洲黑杨的保存率存在明显差异,其中,在农地栽种的美洲黑杨保存率最高,在98.0％以上;其次为河岸、地下水位在100 cm的平地,保存率在97.0％左右;山坡中上部地区栽种的美洲黑杨保存率最低,仅为52.8％.不同立地类型对3年生美洲黑杨的树高、胸径和冠幅具有极显著的影响,在农地、地下水位约100 cm的平地、河岸栽种的美洲黑杨生长量较大,而在地下水位高于50cm的平地、半山坡及山坡中上部地区的生长势较差,表明美洲黑杨耐涝和耐旱能力较弱,也不宜上山栽种.     

美洲黑杨次生木质部导管分化进程的超微结构分析

利用常规电镜技术,观察研究了美洲黑杨Populus deltoides次生木质部导管分化过程的超微结构变化。结果表明：美洲黑杨导管形态的建成可划分为初生壁的延展、次生壁的构建与穿孔板的形成等3个时期。初生壁的延展是导管分化的初始阶段,导管细胞高度液泡化,细胞质及其细胞器贴壁分布。次生壁的构建是导管分化的关键阶段,次生壁物质的沉积在导管液泡膜破裂之前即已开始,此时导管分子内细胞器结构清晰,其中高尔基体及其分泌小泡最为丰富,说明高尔基体与次生壁物质的合成及运输密切相关;导管分子液泡膜裂解后,次生壁物质沉积极为迅速,伴随次生壁物质的合成,导管分子细胞质解体,细胞核染色质凝聚并边缘化,表现出程序化细胞死亡（PCD）的典型特征。穿孔板的形成是导管分化的终极阶段,在导管次生壁形成时,相邻导管分子的端壁上不发生壁物质的积累,而且在次生壁构建后期,端壁上的壁物质降解,最后残余的端壁断裂形成穿孔板。美洲黑杨次生木质部导管的分化阶段彼此相继有序地进行,其中次生壁构建的启动是导管分子不可逆分化的临界期,随后的分化阶段是一种典型的PCD过程。     

毛果杨中链酰基辅酶A合成酶的克隆及酶学分析

中链酰基辅酶A合成酶(MACS)属于腺苷酸合成酶超基因家族,催化中链脂肪酸与辅酶A结合形成相应的中链酰基辅酶A。本研究通过同源检索毛果杨基因组数据库中的4CL基因,克隆得到毛果杨PtMACS1的基因序列(基因编号:estExt_fgenesh4_pg.c_640066)。通过序列分析可知,Box I和Box II两个在4CL中保守的结构域在该蛋白中并不保守。将PtMACS1与原核表达载体 pET-30a(+) 构建融合表达载体PtMACS1- pET-30a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导重组蛋白进行表达。镍柱纯化重组蛋白后进行酶学活性分析,研究结果表明该蛋白对中链脂肪酸己酸、壬酸、癸酸显示出明显活性:Kcat分别为(1302.65)、(1933.46)、(2015.51) mol/(minmg),以该蛋白的最适底物癸酸测得该蛋白的最适反应温度为37 ℃,最适反应pH为7.0。该结果表明,PtMACS1属于毛果杨中链酰基辅酶A合成酶家族一员,为后续毛果杨腺苷酸合成酶超基因家族的鉴定及分类分析提供资料。      

美洲黑杨与大青杨杂种无性系苗期光合特性研究

对杨树光合特性的研究一直是杨树遗传改良的一个重要方面。为探讨美洲黑杨与大青杨杂种无性系苗期的光合特性和规律,以美洲黑杨与大青杨杂交所得3个生长及抗性等表现优良的杂种无性系1年生盆栽扦插苗为材料,采用Li-6400光合测定系统对3个无性系的光合作用指标进行测定。结果表明:在7月中旬,天气晴朗条件下,3个无性系的净光合速率和蒸腾速率日变化均呈不对称的双峰曲线,气孔导度和胞间CO2 浓度日变化分别呈单峰和倒双峰变化趋势;编号为191的无性系净光合速率日变化曲线两次峰值均高于165和177,191和177的低值高于165;3个无性系的净光合速率-光响应曲线相近,净光合速率均随着光合有效辐射的增加而增大,接近光饱和点时上升趋势平缓;191的光饱和点高于165和177,而光补偿点低于165和177,表明191适应光强的能力强于165和177。      

秦黑杨1号等美洲黑杨指纹图谱构建及遗传关系分析

以西北农林科技大学渭河试验站的12个美洲黑杨无性系为材料,从国际杨树基因组委员会官方网站中提供的引物中选取25对引物对美洲黑杨进行指纹图谱构建,最终筛选出5对多态性丰富、扩增效率高、条带清晰的引物。5对引物共扩增条带24条,其中多态性条带23条,占95.8%,SSR引物多态性条带数4~8条,平均4.8条。对12份种质进行UPGMA聚类分析,品种遗传相似性系数在0.4583~0.9583,平均相似系数为0.6660。研究利用5对引物(PMGC_2217、PMGC_2675、PMGC_2866、WPMS_14、WPMS_17)可将12份美洲黑杨种质完全区分开。研究结果可为美洲黑杨品种鉴定和知识产权保护提供理论依据。     

毛白杨PtYABBY基因家族3个成员的克隆与表达分析

  目的  YABBY是高等植物中特有的转录因子家族,在侧生器官发育和开花过程中发挥重要作用。本研究对毛白杨PtYABBY基因进行克隆和生物信息学分析,并对雌雄花芽8个关键发育时期和根茎叶等组织中PtYABBY基因表达模式进行探究,以期为阐明PtYABBY基因在毛白杨侧生器官发育过程中的功能奠定前期基础。  方法  以毛白杨为试材,采用同源基因克隆法从毛白杨中分离FILAMENTOUS FLOWER (FIL)/YABBY3 (YAB3)同源基因PtYABBY3、PtYABBY4和PtYABBY11的编码区序列,并开展生物信息学分析。通过qRT-PCR研究这3个基因在雌雄花芽8个发育时期及根、茎、幼叶、成熟叶片中的表达规律。  结果  PtYABBY3、PtYABBY4和PtYABBY11编码区长度分别为633、642、639 bp,分别编码210、213、212个氨基酸。所推测的氨基酸序列包含C₂C₂锌指结构域和YABBY结构域。系统进化分析进一步表明这3个基因属于FIL/YAB3亚家族成员。qRT-PCR结果显示这3个基因在根、茎、叶及8个时期雌雄花芽组织中均有表达,但PtYABBY基因间的表达水平存在明显差异。PtYABBY3表达水平在雌雄花芽发育初期下调,发育后期上调;花原基形成到休眠期内PtYABBY3在雌雄花芽中呈现相反的表达变化趋势。PtYABBY4和PtYABBY11基因在雌雄株成花诱导期表达水平最高,成花诱导到伸长期内呈现下降趋势,在雄花芽休眠期和小孢子发生期基因表达水平无明显变化。营养组织表达量测定结果显示这3个基因在幼叶和成熟叶片中表达水平相对较高,根系中表达量最低。  结论  YABBY基因家族成员PtYABBY3、PtYABBY4和PtYABBY11同属FIL/YAB3亚类,在毛白杨雌雄花芽发育的8个时期中表达水平存在较大差异,且在叶片和花芽中表达量较高,表明其可能与叶片和花芽发育相关。本研究为今后深入研究YABBY家族成员在杨树器官生长发育过程中的作用奠定基础。