百脉根Rboh基因家族在共生固氮中的功能研究

为探索植物呼吸爆发氧化酶（respiratory burst oxidase homologue,Rboh）基因家族在共生固氮中的功能和作用机制,利用分子生物学、细胞生物学和遗传学等方法,围绕百脉根Rboh基因家族中在根瘤中特异性表达的基因LjRbohA（Lj5g3v1497840）以及在根瘤中高表达的基因LjRbohB（Lj6g3v1549190）和LjRbohC（Lj5g3v1497820）,分别对其蛋白的亚细胞定位、基因的表达模式、基因的启动子活性及蛋白的功能进行了研究。结果显示：LjRbohA、LjRbohB和LjRbohC蛋白都定位在植物的细胞膜上;LjRbohA、LjRbohB和LjRbohC基因在接种根瘤菌后表达上调;LjRobhA和LjRobhB基因在根瘤、维管束和侧根原基表达;利用CRISPR Cas9技术对LjRbohA、LjRbohB和LjRbohC 3个基因分别进行敲除导致结瘤数目减少。这些研究结果表明,LjRbohA、LjRbohB和LjRbohC这 3个基因可能都参与调控百脉根与根瘤菌的共生结瘤过程。     

百脉根小GTPase激活蛋白的鉴定及突变体分离

以豆科植物百脉根为材料,利用蛋白质相互作用技术、基因表达分析和突变体表型观察研究了小GTPase激活蛋白RacGAP1和RacGAP3在侧根及根瘤发育中的功能。结果表明:百脉根小GTPase激活蛋白RacGAP1和RacGAP3能与ROP6~(CA)相互作用,RacGAP1和RacGAP3基因主要在根微管组织中表达,在接种根瘤菌后呈下调表达趋势。RacGAP1在侧根及根瘤原基中无表达;RacGAP3则能在侧根及根瘤基部表达。RacGAP1和RacGAP3的LORE1插入突变体表型观察显示,纯合突变体与Gifu野生型共生表型无明显差异,但RacGAP1突变体植株开花后,花朵枯萎掉落不结荚,而杂合体与野生型无差异,表明RacGAP1可能参与调控花粉发育过程,而RacGAP3在早期共生过程中可能起负调控作用。     

百脉根半胱氨酸蛋白酶基因在根瘤衰老过程中的表达分析

为明确半胱氨酸蛋白酶与定型根瘤衰老的相关性,通过与已鉴定的紫云英半胱氨酸蛋白酶AsNODf32进行序列比对分析,从百脉根中鉴定出2个与根瘤衰老相关的蛋白酶基因LjCyp1和LjCyp5。蛋白序列及结构分析表明,LjCyp1和LjCyp5同源性高达96.2%,均含有2个典型的半胱氨酸蛋白酶结构域和液泡定位信号肽,属于木瓜蛋白酶家族。体外酶活检测显示,2个蛋白都具有半胱氨酸蛋白酶活性。通过Realtime PCR和组织化学定位分析表明,2个蛋白酶基因主要在成熟和衰老的根瘤中表达。结果表明LjCyp1和LjCyp5可能在百脉根根瘤衰老过程中发挥重要作用。     

百脉根4个共生基因在水稻中的共表达及其对水稻转录组的影响

为建立水稻-根瘤菌共生固氮体系,将百脉根共生信号转导途径中的4个功能基因(LHK1、NSP1、NSP2和NIN)转入水稻,获得稳定转化的转基因水稻,并初步检测转基因水稻的表型和转录组水平上的差异。根瘤菌感染试验结果显示,根瘤菌侵染对照(转入空载体)和转基因水稻的根毛和表皮的比率没有显著变化,但接种根瘤菌14d后,对照与转基因水稻的侧根原基数有显著差异,转共生基因水稻的侧根原基明显增多。利用水稻cDNA芯片,检测转基因水稻组与对照组在接种根瘤菌7d和不接种根瘤菌条件下根的转录组变化,结果显示,转基因组与对照组水稻在植物防御反应、激素信号转导途径相关基因均有差异性表达,表明豆科共生基因影响了水稻对根瘤菌的反应。     

百脉根PIN基因家族的鉴定与分析

生长素输出载体蛋白PIN-formed(PIN)是一类调控植物生长素极性运输的重要载体元件,与植物生长发育密切相关。利用生物信息学方法对百脉根(Lotus corniculatus)PIN基因家族成员(LjPIN)进行筛选、鉴定,并对其结构特征、系统进化、编码蛋白质性质、顺式作用元件组成和表达特性等进行研究,为其功能鉴定及利用奠定基础。结果表明,百脉根基因组中含有27个LjPIN成员,主要分布在1—5号染色体上;27个LjPIN基因含8个可变剪切位点,编码35个蛋白质;除了LjPIN4、LjPIN13、LjPIN23基因外,其他LjPIN基因均含有内含子,内含子数和外显子数均为1～10个;LjPIN与拟南芥AtPIN、大豆GmPIN在进化关系上较接近,与水稻OsPIN较远;LjPIN蛋白大多为碱性的两性稳定蛋白质,一般含有5种保守基序,基序数量2～9个;LjPIN基因除了含有顺式作用基本元件CAAT-box和TATA-box外,还含有光响应、激素响应及生长发育相关的调控元件;11个LjPIN基因在根、茎、叶、花和不同形成时期种子中呈时空差异表达。     

百脉根起始结瘤相关转录因子间相互作用的鉴定

以模式豆科植物百脉根为材料,利用酵母双杂交和双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation ,BiFC）技术,研究调控起始结瘤基因表达的转录因子IPN2、NSP2、CYCLOPS、DELLA间的相互作用。结果显示,百脉根IPN2与DELLA、NSP2与DELLA、CYCLOPS与DELLA均有相互作用。表明IPN2、DELLA可能参与并形成一个大的蛋白复合物,网络调控豆科植物起始结瘤基因的时空表达。     

百脉根无效根瘤突变体的生物量及无效根瘤的电镜观察分析

百脉根是研究豆科植物根瘤形成和共生固氮分子机理的一种重要模式植物.为探索百脉根根瘤的形成机制,以EMS诱导野生MG-20突变并筛选的No.1006,No.486和No.2568等3种无效根瘤突变体为材料,测定其突变体植株生物量、根瘤数及固氮能,并对无效根瘤中根瘤菌感染的细胞进行电镜观察.结果表明:No.1006是根瘤原基突变体,No.486是白色无效根瘤突变体,No.2568是绿色无效根瘤突变体;这3种无效根瘤突变体植株生长至30d时,根瘤数和固氮能以及株高、地上部干质量、根干质量和根长等生物量与MG-20野生株差异无统计学意义(p0.05),但生长至40d开始均显著低于野生株(p0.05).No.486的白色无效根瘤和No.2568的绿色无效根瘤,经切片后在电镜下观察,无效根瘤细胞均存在不同程度的破坏;其中No.2568的绿色无效根瘤的细胞和由根瘤菌转化来的类菌体的破坏程度远大于No.486的白色根瘤.     

启动子Prd29A的克隆及在百脉根中的活性鉴定

利用PCR方法,从拟南芥中克隆了865bp的逆境诱导型启动子Prd29A.利用农杆菌介导的瞬时表达方法,结合GUS染色,在豆科植物百脉根的幼苗中进行活性鉴定.结果表明:启动子Prd29A在正常情况下不表现活性,而在逆境(高渗、高盐)和ABA诱导下活性很高,这为该启动子在百脉根等豆科植物中的应用提供了依据.     

拟南芥中根瘤共生基因线路的搭建及其表达分析

为研究共生信号途径相关基因在非宿主植物中的表达情况,通过生物技术及合成生物学方法,将10个能在拟南芥根中表达的启动子和10个百脉根共生信号传递的关键基因分别构建2个多基因表达载体,即pUNS6(含6个基因)和pDNS4(含4个基因)。结果表明:利用毛根转化互补相应豆科植物的突变体,都能恢复突变体的结瘤功能,说明克隆的目的基因都具有生物学功能;通过根癌农杆菌介导的花序侵染,将pUNS6和pDNS4分别转入拟南芥中,对阳性植株分离和鉴定,在转基因T_0、T_1、T_2代植株中都鉴定到目的基因,表明多个共生基因稳定存在于拟南芥基因组上;利用RT-PCR在阳性转基因植株根中都能检测到mRNA水平的基因表达。     

百脉根根瘤菌nod-lacZ转录融合子构建及表达分析

根据Mesorhizobium loti基因组信息,克隆nodA、nodB、nodD等基因的启动子序列,分别与报告基因构建相应的转录融合子(nod-lacZ),并分别导入中慢生型百脉根根瘤菌MAFF303099和广谱根瘤菌NGR234(Rhizobium sp.)中,利用百脉根根的抽提物作为诱导物,检测结瘤基因的表达。结果表明:在MAFF303099菌株中,百脉根根抽提物不能诱导nodA的表达;能诱导nodB和nodD1的表达;nodD2呈组成型表达;供试的5种不同的类黄酮化合物都不能诱导nodA基因表达;在NGR234菌株中,毛地黄酮(Luteolin)能诱导nodA表达。     

百脉根组织培养的研究

以UM和MS为基本培养基,通过调整激素种类与浓度等培养条件,按正交实验设计的原则,摸索出建立百脉根组织培养体系的最佳条件:愈伤诱导最佳培养基为UM+2,4-D 2 mg.L-1+KT3 mg.L-1;最佳分化培养基为MS+NAA0.1 mg.L-1+6-BA 1 mg.L-1;最佳生根培养基为MS+NAA0.05 mg.L-1。     

百脉根根瘤内根瘤菌与假单胞菌的多样性分析

为了探索百脉根根瘤内生菌多样性,揭示百脉根根瘤内根瘤菌与假单胞菌的多样性及其互作关系并寻找能结瘤的根瘤菌,本研究采用免培养和可培养相结合的方法对百脉根根瘤内生菌的多样性进行分析,采用平板对峙法对根瘤菌与假单胞菌的互作关系进行初步研究.结果表明:免培养法从百脉根根瘤内检测到内生菌分属于17门31纲69目103科140属,...     

百脉根结瘤信号通道蛋白NSP1和NSP2的相互作用

豆科植物百脉根是研究共生固氮体系的模式植物之一,对其根瘤菌共生信号转导途径和作用机制的研究,有助于揭示根瘤菌与豆科植物共生关系建立和共生体形成的奥秘.本研究利用酵母双杂交系统和体外蛋白质相互作用技术,证明百脉根GARS类家族转录因子结瘤信号通道蛋白NSPI和NSP2在体外体内均可以相互作用,并将相互作用的位点定位在NSPl的GRAS结构域的LHRⅡ区域和NSP2的LHRI区内.     

菌株对百脉根及百脉根促生效果测定的研究

以贵州黔南地区百脉根为研究材料,接种不同复合菌株处理(溶磷菌剂、固氮菌剂和溶磷+固氮混合)与对照相比,百脉根株高及地上生物量提高明显。无论第一茬还是第二茬,溶磷+固氮混合处理的株高均较对照显著提高超过20.00%,地上生物量较对照增加均超过100.00%。     

百脉根组氨酸蛋白激酶LHK1的表达及活性鉴定

为研究LHK1蛋白的功能,构建了pPub-LHK1∶AG-GFP和pFastBac-LHK1表达载体,分别在烟草叶肉细胞和昆虫细胞表达百脉根组氨酸蛋白激酶LHK1跨膜蛋白。结果表明:在烟草和昆虫细胞中LHK1蛋白都能表达,且表达的蛋白在体外都能磷酸化底物(组氨酸转移酶HP1蛋白),具有组氨酸蛋白激酶活性。     

优良豆科牧草百脉根一次性生根成苗组培快繁技术的研究

以百脉根品种—里奥为材料,通过不同组培配方培养基培养后,观察萌芽、生根和生长情况,确定用于百脉根一次性生根成苗的组织培养快繁方法和培养程序,其最佳培养基配方为:MS+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.05 mg/L+蔗糖30 g+琼脂8 g,pH 5.5～5.8。该配方和程序具有培养周期短、操作简便、成本较低、易于操作等特点。     

百脉根小GTPase ROPs 基因反转座子插入突变体的分离和鉴定

为研究ROP(Rho-related GTPase of plants,ROP)在豆科植物共生固氮过程中的功能和作用机制,从百脉根逆转录转座子LORE1插入突变体库(http://www.kazusa.or.jp/lotus)中搜索到6个ROP相关基因突变体,通过分离和鉴定,得到不同突变体的M1代和M2代纯合体种子,对M2代进行表型鉴定及统计分析。结果表明:在早期共生表型的鉴定中,突变体与野生型植株相比,rop-like1植株的根瘤原基数明显下降,rop-like4植株的侵入线数和侵入线密度也明显下降;但仅rop-like1植株在接种14d后的结瘤数明显减少。     

百脉根谷胱甘肽硫转移酶基因的载体构建与检测

[目的]探讨百脉根谷胱甘肽硫转移酶基因（LcGST）的作用。[方法]通过DNA重组技术将LcGST与中间表达载体pGN连接。[结果]成功构建了植物表达载体pGN-LcGST。[结论]pGN-LcGST载体的获得为进一步研究其在异源植物中的功能奠定了基础。     

百脉根泛素结合酶LjE2的表达及活性鉴定

为了研究泛素化作用在豆科植物共生固氮过程中的调控功能和作用机制,利用拟南芥泛素结合酶E2的序列,在百脉根基因组上鉴定得到14个编码E2(LjE2)的基因,从LjE2中克隆到11个基因并构建了融合表达载体pET-LjE2s:His。通过大肠杆菌表达系统,表达并纯化到10个LjE2:His融合蛋白。经体外泛素化及Western blot分析,在10个LjE2中有9个具有泛素结合酶活性,1个(LjE2-5)未检测到泛素结合酶活性。