FaGST基因过量表达获得拟南芥转基因植株

【目的】探明FaGST基因的功能和分子调控机制,为其后期的抗性利用与研究提供科学依据。【方法】利用前期构建的pCAMBIA1300-35S空载体和pCAMBIA1300-35S-FaGST过表达载体,将其转化感受态(DH5α)细胞后导入农杆菌GV3101,利用花序侵染法转化拟南芥,通过潮霉素(Hyp)进行筛选、PCR鉴定,并利用实时荧光定量PCR检测其表达量。【结果】FaGST基因成功导入拟南芥中,获得6株空载体转基因拟南芥植株和8株转FaGST基因拟南芥植株;8株转基因拟南芥植株的FaGST基因表达量为1.31～2.06,较野生型拟南芥植株表达量（1.00）显著或极显著提高。【结论】成功获得拟南芥转基因纯合植株,FaGST基因在拟南芥植株中已过量表达。     

百脉根半胱氨酸蛋白酶基因在根瘤衰老过程中的表达分析

为明确半胱氨酸蛋白酶与定型根瘤衰老的相关性,通过与已鉴定的紫云英半胱氨酸蛋白酶AsNODf32进行序列比对分析,从百脉根中鉴定出2个与根瘤衰老相关的蛋白酶基因LjCyp1和LjCyp5。蛋白序列及结构分析表明,LjCyp1和LjCyp5同源性高达96.2%,均含有2个典型的半胱氨酸蛋白酶结构域和液泡定位信号肽,属于木瓜蛋白酶家族。体外酶活检测显示,2个蛋白都具有半胱氨酸蛋白酶活性。通过Realtime PCR和组织化学定位分析表明,2个蛋白酶基因主要在成熟和衰老的根瘤中表达。结果表明LjCyp1和LjCyp5可能在百脉根根瘤衰老过程中发挥重要作用。     

百脉根LjSERKs基因家族在根瘤共生中的功能鉴定

为探索百脉根中的体细胞胚胎发生受体类蛋白激酶基因(somatic embryogenesis receptor-like kinases,SERKs)家族在根瘤共生过程中的功能和作用机制,根据拟南芥AtSERKs基因序列,从百脉根基因组中鉴定到8个同源基因(LjSERKs)。利用CRISPR-Cas9基因组编辑和毛根转化技术,分别敲除LjSERKs家族不同基因,观察并分析其对共生结瘤表型的影响。结果显示:敲除LjSERK2、LjSERK3、LjSERK6和LjSERK7后,其植株结瘤数与对照植株相比均无明显差异;敲除LjSERK8后,植株结瘤数显著减少。这些结果表明LjSERK8参与根瘤共生过程,而该家族其他基因间可能存在功能冗余现象。     

紫云英根瘤中共生固氮下调表达基因的分离与初步分析

对前期利用抑制消减杂交技术(Suppressive subtractive hybridization,SSH)构建的紫云英(Astragalus sinicus)根部组织的共生固氮差异表达cDNA文库进行了全文库测序和初步分析,并利用半定量RT-PCR方法验证了其中5个基因片段在根瘤中的下调表达。结果表明,从180个克隆中共获得94个有效序列,文库插入片段长度为200~1 300 bp。BLAST同源比对分析结果表明,有90个序列可以找到同源片段,有4个可能为新基因,按功能分为10个类群。     

GEF7基因过表达拟南芥植株幼苗表型分析

利用已构建的过表达拟南芥(Arabidopsis)GEF7基因植株,在光照培养箱中进行培养,并与野生型植株进行对比分析,对GEF7基因过表达植株的幼苗表型进行了观察分析。结果表明,GEF7基因过表达植株幼苗的根长比野生型对照明显增加;其子叶形态、数目和幼苗形态等方面均有异常表型,表明GEF7基因的功能与根的发育有关,并参与调控植物的发育过程。     

百脉根4个共生基因在水稻中的共表达及其对水稻转录组的影响

为建立水稻-根瘤菌共生固氮体系,将百脉根共生信号转导途径中的4个功能基因(LHK1、NSP1、NSP2和NIN)转入水稻,获得稳定转化的转基因水稻,并初步检测转基因水稻的表型和转录组水平上的差异。根瘤菌感染试验结果显示,根瘤菌侵染对照(转入空载体)和转基因水稻的根毛和表皮的比率没有显著变化,但接种根瘤菌14d后,对照与转基因水稻的侧根原基数有显著差异,转共生基因水稻的侧根原基明显增多。利用水稻cDNA芯片,检测转基因水稻组与对照组在接种根瘤菌7d和不接种根瘤菌条件下根的转录组变化,结果显示,转基因组与对照组水稻在植物防御反应、激素信号转导途径相关基因均有差异性表达,表明豆科共生基因影响了水稻对根瘤菌的反应。     

异源表达CmSAMDC基因拟南芥的耐盐性分析

利用含50 mg/L潮霉素(Hyg)的MS固体培养基成功筛选出转CmSAMDC基因的拟南芥株系TA1和TB1,并对T_3代转基因植株的耐盐性进行了分析。研究结果表明:转SAMDC基因的拟南芥在含不同浓度NaCl的培养基中发芽率、侧根数均显著高于野生型拟南芥的;转CmSAMDC基因拟南芥幼苗在200 mmol/L NaCl条件下能正常生长,且具有较低的丙二醛(MDA)含量,而野生型拟南芥在相同胁迫条件下明显萎蔫、失绿甚至死亡。说明过量表达SAMDC基因可以显著提高拟南芥的耐盐性。     

异源表达CmSAMDC基因拟南芥的耐盐性分析

利用含50 mg/L潮霉素(Hyg)的MS固体培养基成功筛选出转CmSAMDC基因的拟南芥株系TA1和TB1,并对T_3代转基因植株的耐盐性进行了分析。研究结果表明:转SAMDC基因的拟南芥在含不同浓度NaCl的培养基中发芽率、侧根数均显著高于野生型拟南芥的;转CmSAMDC基因拟南芥幼苗在200 mmol/L NaCl条件下能正常生长,且具有较低的丙二醛(MDA)含量,而野生型拟南芥在相同胁迫条件下明显萎蔫、失绿甚至死亡。说明过量表达SAMDC基因可以显著提高拟南芥的耐盐性。     

拟南芥黑芥子酶基因根特异性表达启动子的克隆

黑芥子酶是一类催化芥子油苷水解的同工酶, pyk10 是一个在拟南芥根和下胚轴中特异表达的黑芥子酶基因。本研究用PCR方法从拟南芥Columbia生态型基因组中克隆了pyk10 基因启动子片段。序列分析表明:该片段全长1 454 bp,与已发表的pyk10 启动子序列(GenBank accession no. AJ292756)同源性达98%。该启动子片段中含有多种其他植物基因启动子中发现的通用启动子元件,并含有器官和组织特异性转录因子的结合位点ACGT-、CANNTG-、GATA-以及I盒等顺式元件。     

采用农杆菌花序浸染法获得转crtB基因拟南芥

利用农杆菌花序浸染法将构建的植物表达载体pBI121-tp-crtB转入拟南芥(Arab idopsis thaliana)野生型Columbia中,共获得了14株转基因系,并进行了转基因拟南芥种子萌发实验.结果表明tp-crtB基因已经成功转入拟南芥中,其不影响拟南芥种子的正常萌发.     

百脉根Rboh基因家族在共生固氮中的功能研究

为探索植物呼吸爆发氧化酶（respiratory burst oxidase homologue,Rboh）基因家族在共生固氮中的功能和作用机制，利用分子生物学、细胞生物学和遗传学等方法，围绕百脉根Rboh基因家族中在根瘤中特异性表达的基因LjRbohA（Lj5g3v1497840）以及在根瘤中高表达的基因LjRbohB（Lj6g3v1549190）和LjRbohC（Lj5g3v1497820），分别对其蛋白的亚细胞定位、基因的表达模式、基因的启动子活性及蛋白的功能进行了研究。结果显示：LjRbohA、LjRbohB和LjRbohC蛋白都定位在植物的细胞膜上；LjRbohA、LjRbohB和LjRbohC基因在接种根瘤菌后表达上调；LjRobhA和LjRobhB基因在根瘤、维管束和侧根原基表达；利用CRISPR Cas9技术对LjRbohA、LjRbohB和LjRbohC 3个基因分别进行敲除导致结瘤数目减少。这些研究结果表明，LjRbohA、LjRbohB和LjRbohC这 3个基因可能都参与调控百脉根与根瘤菌的共生结瘤过程。     

不同生态型拟南芥FLC基因的序列分析

[目的]对拟南芥春化作用相关基因FLC的序列分析。[方法]先期经过对拟南芥自然群体的春化反应的QTL分析,发现拟南芥5号染色体上有一个与开花有关的QTL,本实验就是运用序列分析确定它与FLC基因是否具有同源性。[结果]意大利拟南芥与瑞典拟南芥在第27位、第461位、第501位、第638位、第738位、第884位碱基上不同。虽然这些碱基有所不同,但是密码子编码出来的第9个氨基酸、第167个氨基酸、第246个氨基酸,由于密码子的简并性,编码的蛋白质均相同。[结论]拟南芥具有丰富的遗传多样性,其FLC基因序列长度高度保守、碱基变异位点丰富密码子的简并性它们均编码同一种氨基酸对拟南芥生长没有影响。这表明拟南芥的基因序列会受到环境的影响。     

不同生态型拟南芥FLC基因的序列分析

[目的]研究拟南芥春化作用相关基因FLC的序列。[方法]对拟南芥自然群体的春化反应进行QTL分析,发现拟南芥5号染色体上有一个与开花有关的QTL,再运用序列分析确定它与FLC基因的同源性。[结果]意大利拟南芥与瑞典拟南芥在第27、461、501、638、738、884位碱基上不同。但密码子编码的第9、167、246个氨基酸由于密码子的简并性,编码的蛋白质均相同。[结论]拟南芥具有丰富的遗传多样性,由于FLC基因序列长度高度保守、碱基变异位点丰富密码子的简并性,它们均编码同一种氨基酸,对拟南芥生长没有影响。     

拟南芥DWF4基因的内含子影响自身表达

为了进一步确定DWF4 基因的内含子是否影响自身表达,构建了35S启动子驱动的带内含子和不带内含子的DWF4基因表达载体,分别转入拟南芥DWF4基因的弱突变体psc1。对T2代幼苗进行表型分析发现,转入带内含子的DWF4基因的转基因株系TgD4能完全恢复突变体的表型,而转入不带内含子的DWF4基因的转基因株系TcD4只能部分恢复突变体的表型。RT–PCR分析显示,TgD4 的DWF4表达水平明显增加,说明内含子对DWF4基因的表达有增强作用。     

GmSARK启动子驱动IPT基因在拟南芥中的表达研究

[目的]对GmSARK启动子驱动IPT基因在拟南芥中的表达进行研究。[方法]分别克隆IPT基因及GmSARK基因启动子,构建它们的植物表达载体并进行拟南芥的转化,利用PPT(phosphinothricin)除草剂筛选,检测T1代转基因植株;对T1代转基因植株进行黑暗避光和干旱处理后进行半定量RT-PCR分析。[结果]成功克隆得到了IPT基因及GmSARK基因,并构建了它们的p3301-GmSARK-IPT植物表达载体;对T1代转基因植株的RT-PCR表明,目的基因mRNA水平上有所表达。[结论]为进一步研究GmSARK启动子驱动的IPT基因在抗逆中的作用奠定了基础。     

拟南芥AKIN11基因的过表达及其功能分析

将蔗糖非发酵基因相关蛋白激酶AKIN11克隆到植物表达载体pEGAD的35S启动子下游与GFP融合,基因枪法导入洋葱表皮细胞进行瞬时表达,发现集中在细胞核内表达.农杆菌介导花序浸泡法转化拟南芥,Basta筛选和RT-PCR鉴定得到两个遗传稳定的T3代转基因株系.突变体和野生型的表型没有明显差异,但突变体叶片中淀粉含量较野生型增加.RT-PCR分析淀粉合成途径关键酶的mRNA水平,发现突变体中腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶表达量增加,而α-淀粉酶却没有变化.表明AKIN11基因可能在拟南芥淀粉积累途径中起着重要的调节作用.     

拟南芥LHY基因超表达与成花转变

高等植物的成花转变受到多个基因网络的调控,植物从营养生长转变为生殖生长,与植物自身发育的生物节律相关,然而生物钟(circadian clock)相关基因在其中的调控作用仍不清楚.本研究通过构建超表达载体pCAMBIA-3301-35S::LHY,遗传转化后获得超表达植株,分析超表达生物节律基因LHY对成花转变的影响....     

拟南芥AGL15基因的克隆及其植物超表达载体的构建

为了研究AGL15基因在种子发育过程中的作用,应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增了拟南芥AGL15基因,并将其克隆到pMD20-T vector载体上,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并测定了该基因全序列。结果表明,该基因全长为807bp。将拟南芥AGL15基因定向克隆到植物表达载体pCambia1301的35S启动子下游,双酶切鉴定结果表明,AGL15基因在双元表达载体中的插入位置和方向都正确,即成功构建了该基因的植物超表达载体。     

拟南芥COI 1互作基因的分离

为进一步阐明茉莉素调控植物生长发育的分子机理，为作物抗性和雄性不育基因工程提供新思路，以COI1为诱饵，利用酵母双杂交分析体系筛选拟南芥cDNA文库，得到300多个阳性克隆，经PCR，RsaⅠ酶切PCR产物以后归为12群，从代表菌落提取pB42AD cDNA重组质粒进行了测序，完成了序列分析，得到ASK1，COAP2，COAP3，COAP4等12个基因，其中ASK1，COAP2，COAP3等基因与Skp1等重要基因有较高的同源性。     

拟南芥花药早期发育的调节基因及其研究进展

介绍了与拟南芥花药早期发育相关基因的功能,它们之间的相互关系,以及它们在控制早期花药细胞分化上的作用模式。