花生Δ9-硬脂酰-ACP脱氢酶基因(SAD)的序列分析

利用同源克隆技术获得花生区组二倍体野生种A. duranensis和A. ipaensis Δ⁹-硬脂酰-ACP脱氢酶基因SAD (命名为gSAD-A和gSAD-B)及3个栽培品种的SAD,每个栽培品种有2个SAD (命名为gSAD-1和gSAD-2)。同时获得丰花2号SAD的两条全长cDNA (命名为FhrSAD-1和FhrSAD-2)。丰花2号的FhgSAD-1和FhgSAD-2均含有2个内含子,二者同源性97.5%,共有69个变异位点,其中62个是SNP位点、6个特异性酶切位点。FhrSAD-1和FhrSAD-2间核苷酸序列同源性98.6%,其中编码区序列同源性98.9%,共有12个变异位点,编码的Ah-SAD2氨基酸序列与Ah-SAD1相比在N端的¹⁷PSSSSSSSSSSFSL³⁰丝氨酸聚集区少一个丝氨酸。gSAD-1和gSAD-A同源性为99.9%,存在4个SNP位点; gSAD-2和gSAD-B同源性为100%。推测gSAD-1和gSAD-2分别来自花生栽培品种的A、B2个染色体组。研究明确了花生不同染色体组SAD的序列特征,为进一步探讨SAD的表达及其在控制花生籽仁脂肪酸组分中的作用提供了重要的参考。     

高粱硬脂酰-ACP脱氢酶基因（SbSAD）家族鉴定及不同发育阶段表达分析

硬脂酰-ACP脱氢酶是形成不饱和脂肪酸的关键酶。利用拟南芥蛋白序列作为比对序列在NCBI和Phytozome数据库进行Blastp同源比对,共鉴定11个SbSADs基因。对SbSAD基因家族进行蛋白特性、进化关系、不同发育阶段表达、基因结构、保守基序、染色体定位、基因二级和三级结构、启动子区的顺式元件及种子发育阶段表达分析,结果显示,SbSADs基因编码区为1 134~1 290bp,其编码蛋白的氨基酸数为377~449,分子量最大为48.0kDa,最小为39.8kDa,等电点为5.26~8.76;根据系统发育树,将SbSAD基因家族分为3个亚族,其中亚族I在不同组织发育阶段表达量较高;11个SbSADs基因不均等地定位在高粱1、2、3、4、6、7和10号染色体上;SbSADs蛋白二级结构均以α-螺旋和无规则卷曲为主,三级结构预测显示,除SbSAD8外,其余SbSADs的蛋白三级结构高度相似;11个SbSADs基因的启动子区与低温胁迫相关的元件数量高度富集。SbSAD5基因在种子发育5和10d均有较高的表达量。     

大豆二酰甘油酰基转移酶基因GmDGAT1A启动子的克隆与功能分析

二酰甘油酰基转移酶(DGAT)是催化三酰甘油生物合成的关键酶,在三酰甘油的合成和积累过程中具有重要调控作用。为了研究大豆DGAT基因表达调控的分子机制,以大豆品种科丰1号为材料,通过PCR方法对GmDGAT1A的启动子(promoter-GmDGAT1A,pGmDGATIA)进行克隆,并通过转化拟南芥和GUS组织定位研究其功能。结果表明:以大豆叶片DNA为模板,成功克隆到GmDGAT1A基因ATG上游2 192 bp启动子序列。序列分析表明,pGmDGAT1A除具有启动子所必需的TATA-box和CAAT-box等基本顺式作用元件外,还含有多个响应于光、赤霉素和脱落酸等顺式作用元件。以GUS为报告基因,成功构建了植物表达载体pCAMBIA1381Z-pGmDGAT1A,并转化野生型拟南芥获得转基因植株。对转基因拟南芥植株进行PCR检测,能扩增到2 192 bp目标条带,表明已获得含有pGmDGAT1A的转基因拟南芥阳性植株。GUS组织化学染色结果显示,转基因拟南芥幼苗的叶脉和根染色较深,但是主根和侧根的根尖部分未染色;成熟期转基因拟南芥植株的根、叶脉以及角果内的隔膜和珠柄染色较深,茎和...     

茉莉花香气相关基因JsGDS启动子的克隆及功能分析

大根香叶烯合成酶在植物萜类化合物合成中具有重要作用.前期从茉莉花cDNA文库中克隆获得香气相关基因JsGDS基因,但是其表达调控机制还不是很清楚,本研究拟采用染色体步移法从茉莉花基因组中克隆了JsGDS上游1 646 bp的启动子序列.生物信息学分析表明,该启动子片段中包含启动子的基本元件TATA-box和CAAT-b...     

花生蔗糖合成酶基因的克隆及序列分析

蔗糖合成酶(Sucrose Synthase,SuSy)是蔗糖代谢途径中的关键酶,在植物生长、发育和渗透调节过程中起着重要作用。为揭示蔗糖合成酶基因在花生中的抗逆机理,以花生基因组DNA为模板,利用染色体步移技术(GenomeWalking)中的TAIL-PCR技术扩增花生SuSy基因组序列和启动子区域,得到基因组序列6 189 bp,启动子预测分析表明,该序列包含约800 bp的启动子上游调控序列,13个外显子,12个内含子。启动子元件分析显示,该片段含有典型的TATA-box、CAAT-box,并存在低温响应元件LTR、GA响应元件、干旱响应MYB结合位点、厌氧诱导必要的顺式作用元件ARE等调控元件,及G-box、box4等光响应元件,说明花生SuSy基因的表达可能受低温、干旱、缺氧、光照等环境因素以及激素GA的调控。     

油用亚麻可溶性糖、脂肪含量与硬脂酰-酰基载体蛋白脱氢酶基因表达相关性分析

为研究油用亚麻叶片、果球4个发育阶段硬脂酰-酰基载体蛋白脱氢酶基因(sad)表达水平与可溶性糖含量、脂肪含量之间的关系,以3个已知亚麻酸含量相对不同的油用亚麻品种为试验对象,应用q RTPCR技术对不同发育时期组织中sad基因的相对表达量与可溶性糖含量以及脂肪含量之间的关系进行分析。结果表明,在油用亚麻叶片和果球的不同发育阶段sad基因的表达模式符合正态分布,在品种和时期之间表达量差异明显。可溶性糖的含量在果球和叶片中差异明显,相关性分析结果显示,在sad基因表达量增加时,可溶性糖含量相对减少;脂肪含量与sad基因的表达量呈极显著正相关。油用亚麻中sad基因表达直接影响油用亚麻可溶性糖和脂肪含量,进而影响亚麻油的品质。     

耐盐小麦中TaSC基因启动子的克隆及调控功能分析

高盐是小麦的主要非生物胁迫因子之一, 发掘小麦耐盐品种中的相关基因, 分析其调控机理, 有助于解析小麦耐盐性机制。本文利用TAIL-PCR和电子克隆的方法, 从耐盐小麦RH8706-49中克隆了耐盐基因TaSC的启动子序列, 命名为ProTaSC。该DNA序列中存在多个顺式作用元件, 包含与非生物胁迫响应有关的ABA响应元件(ABRE)和MYB蛋白结合位点(MBS)各1个。以GUS为报告基因, 对克隆的启动子序列及不同长度的5′端缺失片段的表达活性分析表明, 克隆的全长片段及2个5′端缺失的片段(681 bp和1096 bp)均能启动GUS表达, 而小于等于343 bp的片段不具备启动功能, 说明ProTaSC中从-681位到-343位核苷酸之间的区域为核心启动子区。在ProTaSC:GUS转基因拟南芥的根、叶片、花药、萼片及成熟角果的果荚壳中均检测到GUS蛋白, 而在主茎、花瓣、幼果和种子中没有检测到GUS, 表明ProTaSC是组织表达特异性启动子。对ProTaSC:GUS转基因拟南芥在NaCl (200 mmol L^-1)和ABA (10 μmol L^-1)胁迫处理后的GUS定量分析表明, ProTaSC是受NaCl和ABA显著诱导表达的功能序列。     

水稻3-磷脂酰肌醇激酶FAB1/PIKfyve基因家族的鉴定及功能分析

FAB1/PIKfyve是催化3-磷酸磷脂酰肌醇(PtdIns3P)形成3,5-二磷酸磷脂酰肌醇(PtdIns(3,5)P2)过程的关键酶,其产物PtdIns(3,5)P2在真核细胞发育中发挥重要功能.为探寻PtdIns(3,5)P2在水稻生殖发育过程中的功能,本研究结合生物信息学和遗传学方法,对水稻FAB1/PIKfyve基因进行鉴定,分析其理化性质、基因结构、保守结构域、系统进化、顺式作用元件和组织表达模式并利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得osfab1b突变体.生物信息学分析结果显示,水稻基因组中共鉴定到9个FAB1基因家族成员;基因结构分析显示FAB1家族基因结构存在差异,外显子数量为8～12个;保守结构域分析表明仅OsFAB1A和OsFAB1B含有N端FYVE结构域,其余成员具有Cpn60_TCP1结构域和PIPKc激酶结构域;系统进化分析提示FAB1家族功能在单双子叶植物中具有高度保守性;FAB1基因上游调控区域顺式元件预测发现多种生长发育相关、光响应以及激素和胁迫响应顺式元件;组织表达模式分析显示大多数FAB1基因为泛表达,其中FAB1C亚类基因在内外稃中的高表达提示其可能参与花器官发育.最后通过CRISPR/Cas9系统得到osfab1b突变体,经碘染观察花粉活力无明显异常,暗示FAB1家族在水稻生殖发育调控中存在功能冗余.本研究结果为单子叶模式植物水稻中磷脂酰肌醇调控网络及其生物学功能的研究提供了理论参考.     

花生质体型酰基载体蛋白基因5′侧翼调控序列的克隆与分析

采用染色体步移技术分别克隆3个花生质体型酰基载体蛋白(ACP)基因的5′侧翼调控区序列,AhACP1、AhACP4和AhACP5基因5′上游序列分别为535、1400和1180 bp;利用5′RACE方法确定了这3个基因的转录起始位点,分别位于起始密码ATG上游–71、–92和–71 bp处。利用生物信息学软件分析了花生ACPs启动子区包含的主要调控元件,发现尽管花生AhACP4和AhACP5基因在根、茎、叶、花和不同发育期种子中的基本表达模式相似,但它们的启动子中包含各自特有的顺式元件,AhACP4启动子区包含根或芽顶端分生组织表达调控元件WUS,而AhACP5启动子区则含有侧芽萌动和伸展所需的多个关键调控元件E2FB、TELO BOX和UP1,推测它们的表达具有组织和发育阶段特异性。在进化上,花生AhACP4与拟南芥AtACP4可能为直系同源基因,但它们的表达模式产生了分歧,AhACP4为组成型表达,AtACP4主要在叶中表达;与AtACP4启动子相比,花生AhACP4启动子区中参与光调控相关元件明显减少。     

花生mtACP3基因的克隆与表达分析

旨在探究酰基载体蛋白在植物脂肪酸合成途径中的作用机制,本研究采用传统PCR方法从花生中克隆得到了一个线粒体型基因,命名为AhmtACP3。并采用荧光定量PCR技术分析了基因的表达特性。该基因全长为859 bp,开放阅读框ORF为390 bp,开放阅读框对应的基因组序列为543 bp,由2个外显子和1个内含子组成,该基因编码129个氨基酸,理论分子量为14.5345 k D,理论等电点为5.22,可能定位于线粒体上。系统发育分析表明,花生线粒体型ACP蛋白分成2个分支:AhmtACP1和AhmtACP2有较近的亲缘关系,与AhmtACP3亲缘关系较远。荧光定量PCR结果显示,AhmtACP3基因在花中的表达量明显高于其他组织,其次是子叶和根。AhmtACP3基因在种子发育过程中的表达量呈现下降趋势。     

花生栽培种与野生种(Arachis oteroi)人工杂交双二倍体的创制和鉴定

花生野生种是改良花生栽培种的重要基因资源。为了利用野生花生的抗性基因,本研究利用花生栽培品种豫花9331与二倍体野生种A.oteroi人工杂交,借助胚拯救和染色体秋水仙素加倍,创制一个双二倍体杂种Am E-4,并利用荧光原位杂交和分子标记技术准确鉴定了该双二倍体。观察结果表明,Am E-4的叶片与豫花9331存在显著差异,而主茎高、侧枝长和总分枝数等性状与豫花9331差异不显著。Am E-4开花期较豫花9331推迟60 d,结实性与荚果发育状况较差,不利于Am E-4的育种利用。同时,开发了57个追踪Am E-4中A.oteroi染色体的显性或共显性SSR标记,为创制和鉴定花生栽培种A.oteroi易位系或渐渗系奠定分子基础。     

花生野生近缘种生物素羧基载体蛋白基因的克隆与结构分析

根据栽培花生鲁花14生物素羧基载体蛋白基因accB1和accB2 cDNA序列设计基因特异引物,克隆了花生野生近缘种Arachis duranensis、A.rigonii、A.batizocoi和A.hoehnei的accB1和accB2 cDNA 序列.序列分析表明,accB1和accB2在栽培花生和野生近缘种中高度保守,氨基酸序列一致性分别高于98.6%和97.5%. A基因组A.duranensis、A.rigonii和B 基因组A.batizocoi、A.hoehnei 的accB1和accB2的氨基酸序列存在差异,但与基因组来源无关.花生野生近缘种A.duranensis、A.rigonii、A.batizocoi和A.hoehnei accB2基因组序列分析表明,栽培花生和野生近缘种的accB2的基因结构相同. A基因组的A.duranensis与B 基因组的A.batizocoi和A.hoehnei的accB2 基因组DNA核苷酸序列一致性分别为98.9%,98.8%,而A 基因组的A.rigonii与A.duranensis、A.batizocoi和A.hoehnei 的序列一致性分别为93.5%,93.6%,93.4%.研究表明,生物素羧基载体蛋白基因在栽培花生及野生近缘种中非常保守.     

中国北方主栽花生品种抗旱性鉴定与评价

人工控水条件下,通过盆栽试验,在花生植株的结荚期和饱果期, 测定29个品种(系)的株高、分枝数、生物累积量、叶片含水量和光合色素含量等与抗旱性有关的13个表型性状和生理生化指标,采用抗旱系数法和隶属函数值法,鉴定各性状指标水分胁迫下的抗旱性。结果表明,相同指标评价不同花生品种抗旱性时得出的结果不同,依此可将供试品种(系)划分为抗旱性强、中、弱和不抗旱4类,即供试品种中唐科8号、冀花2号、冀花4号、花育25、花育17、花育22、大唐油、花育21具有较强的抗旱能力;花育20、花育24、潍花6号、花育27、鲁花11、阜花11、阜花13、唐油4号、丰花1号和G2具有中等抗旱能力;具有较弱抗旱能力的品种(系)有16-8、阜花10号、M5、花育16和鲁花14;而花育19、花育23、丰花6号、潍花8号、M7和TE-2在结荚期和饱果期均无抗旱能力。水分胁迫至结荚期,除分枝数和类胡萝卜素外,其余各形态型状和生理生化指标及其综合D值均可作为鉴定品种(系)抗旱性的依据;水分胁迫至饱果期,只有叶面积与抗旱系数间的相关极显著。无论在结荚期或饱果期,综合D值可作为鉴定品种抗旱性的指标,单一指标均不能准确判定某品种(系)的抗旱性。     

利用RIL群体和自然群体检测与花生含油量相关的SSR标记

以远杂9102×中花5号杂交后代衍生的重组近交系F₈代家系为材料,在含油量测试的基础上,选用10份低油材料(平均含油量52.91%)、12份高油材料(平均含油量58.85%)以及亲本进行SSR引物筛选,通过631对SSR引物扩增,筛选出来源于7对引物的13个有显著差异的片段可以有效区分低油材料和高油材料。以这7对差异引物在F₈ RIL群体中扩增,对20份低油家系材料(含油量<55%)和45份高油家系材料(含油量>56%)进行统计分析,获得1个与花生含油量相关的分子标记2A5-250/240,其中,标记2A5-250为低油材料(含油量<55%)所拥有,相符率为95.0%,标记2A5-240为高油材料(含油量>56%)所拥有,相符率为88.9%。用SSR标记2A5-250/240检测11份高油(平均含油量为55.93%)栽培种花生和11份低油(平均含油量为48.41%)栽培种花生,结果表明,标记2A5-240与高油栽培种花生的符合率为63.6%,2A5-250与低油栽培种花生的符合率为90.9%。在19份高油(平均含油量为58.60%)野生花生中,10份野生花生能检测到标记2A5-240。综合分析RIL群体和自然群体的研究结果表明,标记2A5-250/240可用于花生含油量分子标记辅助选择。     

ahFAD2A等位基因在中国花生小核心种质中的分布及其与种子油酸含量的相关性分析

在中国小核心花生种质中发掘出油酰PC脱氢酶的2个等位基因(ahFAD2A-wt和ahFAD2A-m)。研究结果表明:(1)突变型等位基因(ahFAD2A-m)与野生型等位基因(ahFAD2A-wt)在编码区442bp的SNP(448bpGA)可导致编码氨基酸的替换(D150N);(2)突变型基因ahFAD2A-m在中国花生小核心种质中广泛存在,出现的频率为53.1%,野生型基因ahFAD2A-wt出现的频率为46.9%;(3)突变型基因ahFAD2A-m在密枝亚种(普通型和龙生型变种)中出现的频率(82.8%)显著高于其在疏枝亚种(珍珠豆型和多粒型变种)材料中出现的频率(15.4%),卡方测验结果表明,核心种质的油酸含量与其携带的等位基因类型密切相关(χ2=98.71,χ20.01,3=11.34,P0.01),携带突变型基因(ahFAD2A-m)材料的油酸平均值显著高于野生型基因的材料(t=18.48t0.01=2.62,P0.01);(4)ahFAD2A等位基因的存在与种子油酸含量密切相关。     

钙影响花生胚胎发育/败育特异蛋白质的筛选与鉴定

缺钙花生（Arachis hypogaea L.）严重空荚（胚胎败育）导致减产降质长期困扰南方花生生产。以大田足（施足钙）、缺（缺钙地大田本底）钙条件下花生的种植与观察为基础 ,利用改良的传统双向电泳、MALDI-TOF质谱和蛋白质数据库等手段,得到了7个与受钙影响花生早期胚胎败育/发育有关的差异表达蛋白。4^#差异蛋白是与菠菜（Spinacia oleracea）的70 kD的叶绿体被膜休克相关蛋白高度相似的缺钙组表达上调的特异蛋白; 6^#差异蛋白与三叶胶（Hevea brasiliensis）的线粒体前体中的ATP合酶的β链高度相似,该蛋白在缺钙幼胚缺失; 7^#差异蛋白在低钙组缺失,其与马铃薯（Solanum tuberosum）的肌动蛋白97或100类似,等等。研究结果提示,受钙胁迫花生幼胚败育可能与早期幼胚内能量转化、氧化还原系统、细胞内膜以及细胞骨架功能维持相关的功能基因的表达异常有关。初步揭示了受钙影响花生胚胎败育的分子机理。     

花生AhSOS2基因的克隆及功能初探

SOS2 (Salt Overly Sensitive 2)作为植物中一类重要的耐盐相关基因, 在调控细胞内离子平衡及参与植物对盐害的响应及适应过程中具有重要作用。本研究通过RACE的方法, 从花生叶片中分离到一长1462 bp、包含1341 bp开放阅读框(ORF)的cDNA片段, 生物信息学分析显示, 该基因属SOS2类基因, 被命名为AhSOS2(GenBank登录号为HG797656), 编码446个氨基酸, 为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。对基因表达特性的荧光定量PCR分析显示, AhSOS2在花生中为组成型表达; 且受盐胁迫及干旱诱导。经250 mmol L^-1 NaCl处理后, 该基因在花生幼苗茎中被诱导表达, 表达量约是对照茎中的30倍; 而在30% PEG-6000模拟干旱处理下, 该基因在花生幼苗叶中表达量也明显升高。综合以上结果, 显示AhSOS2可能参与并调控花生对逆境的抗性及耐受性。目前, 已成功构建了AhSOS2的植物双元表达载体pCAMBIA1301P-AhSOS2并获得转基因植株, 初步功能分析显示, 过表达AhSOS2基因的转基因水稻对盐胁迫的耐受性提高。预期这方面的工作对于解析花生对盐害、干旱等逆境的适应及防御机制, 进而指导花生抗性育种及品质改良具有重要意义。