梅花PmCBF基因的克隆及表达

CBF转录因子在植物冷驯化中起着重要调控作用。以欧洲甜樱桃CBF基因为信息探针,从李属基因组数据库中得到一个候选序列,设计特异引物,通过PCR扩增和RT-PCR验证,发现与预测序列一致。该基因全长711bp,可编码225个氨基酸,序列分析发现其具有CBF基因的特征序列,包含保守的AP2/EREB DNA结合域以及CBF特征短多肽序列PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR。同源性分析显示,PmCBF和欧洲甜樱桃、矮扁桃CBF基因一致性较高,均在90%以上,与欧洲甜樱桃的氨基酸同源性达100%。实时荧光定量PCR分析发现:4℃低温胁迫下,PmCBF在转录水平的表达情况和其他植物CBF基因一致;4℃处理后PmCBF基因的表达开始上升,4 h时达最大,初步表明PmCBF在低温胁迫下上调表达。     

甘蔗脂氧合酶基因ScLOX1的克隆与表达分析

LOX属于脂氧合酶超家族(lipoxygenase superfamily),是脂肪氧化途径的重要因子,广泛参与植物生长发育的调节和对外界刺激的抵御。本研究基于甘蔗(Saccharumspp.)转录组数据库,通过RT-PCR技术,首次从新台糖22号(ROC22)蔗芽中克隆获得ScLOX1基因(GenBank登录号为MK106188)的cDNA全长序列。生物信息学分析显示,ScLOX1基因cDNA序列长度为2813 bp,开放读码框全长2664 bp,编码887个氨基酸,其编码蛋白的理论等电点为6.23,不稳定系数为39.77,亲水性平均值为-0.437,无信号肽和跨膜结构,但含有PLATLH2和Lipoxygenase活性位点,与高粱(Sorghum bicolor) LOX (XP002466613.1)的氨基酸序列相似性高达95.96%。预测ScLOX1基因的编码蛋白为酸性稳定亲水性非分泌蛋白,属于type I类非传统9-LOX。qPT-PCR分析结果显示,ScLOX1基因在蔗芽组织中特异性表达。接种甘蔗黑穗病菌(Sporisorium scitamineum)后, ScLOX1基因的表达量在抗病品种崖城05-179中短暂上升,但在感病品种ROC22中显著下降。分别对瞬时表达ScLOX1基因的本氏烟(Nicotiana benthamiana)植株叶片接种烟草茄病镰刀菌蓝色变种(Fusarium solani var. coeruleum)和青枯菌(Ralstonia solanacearum),表型观察、3,3’-二氨基联苯胺(3,3’-diaminobenzidine,DAB)染色和烟草免疫相关基因的表达情况分析显示,ScLOX1基因的过表达能够增强本氏烟对烟草茄病镰刀菌蓝色变种的防御,但对烟草青枯菌的作用与对照相比无明显差异。研究还发现,ScLOX1基因的表达受茉莉酸甲酯和水杨酸抑制下调,但受脱落酸、氯化钠和聚乙二醇诱导上调。以上结果为深入研究甘蔗ScLOX1基因的功能提供参考资料。     

甘蔗ScWRKY4基因的克隆与表达特性分析

WRKY是植物中特有的转录因子家族之一, 在植物对生物和非生物逆境胁迫的应答反应中起重要调控作用。本研究基于课题组前期构建的甘蔗(Saccharum spp.)转录组数据库, 从新台糖22 (ROC22)中成功克隆到1个WRKY基因, 命名为ScWRKY4 (GenBank登录号为MG852087)。序列分析发现, ScWRKY4基因cDNA全长1265 bp, 包含1个741 bp的完整开放读码框, 编码246个氨基酸, 该蛋白具有1个WRKYGQK保守结构域和C₂H₂锌指结构域, 属于IIc类WRKY转录因子。生物信息学预测分析发现, ScWRKY4蛋白为碱性的不稳定亲水性蛋白, 不存在信号肽和跨膜结构域, 蛋白二级结构元件缺少β螺旋。在本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片瞬时表达中, ScWRKY4蛋白定位于细胞核。酵母杂交实验结果显示, ScWRKY4不具有转录激活活性。实时荧光定量PCR分析表明, ScWRKY4基因在甘蔗的根、叶、芽和皮中的表达量无明显差异, 在蔗肉中的表达量最高, 为对照蔗根的18.38倍; 黑穗病菌侵染0~72 h, ScWRKY4在抗病品种崖城05-179中下调表达, 在感病品种ROC22中表达较稳定; 受到外源激素脱落酸、水杨酸和茉莉酸甲酯以及非生物胁迫因子氯化钠和聚乙二醇胁迫后, ScWRKY4基因均被诱导上调表达。上述研究结果表明, ScWRKY4基因可能不参与甘蔗对黑穗病的抗性反应或在该防御方面起负调控作用, 但积极响应甘蔗对盐和干旱胁迫的应答。     

甘蔗CDK基因的cDNA全长克隆与表达分析

植物细胞周期依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,与周期蛋白(Cyclins)协同作用,是重要的细胞周期性调控因子。本研究从甘蔗受花叶病毒侵染的转录组数据库中获得一条与高粱(Sorghum bicolor)CDK基因(Gen Bank登录号为XP_002466536.1)高度同源的Unigene序列,通过RT-PCR扩增获得长度为1799 bp的甘蔗Sc CDK基因(Gen Bank登录号为KR258796)。序列分析显示Sc CDK基因含一个完整的开放阅读框(65~1603 bp),编码512个氨基酸,且具有CDK典型保守结构域,如ATP结合位点、磷酸结合位点及活化环A-loop。此外,生物信息学预测显示该基因编码的蛋白定位于细胞核,为可溶性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为无规则卷曲,主要参与蛋白翻译。实时荧光定量PCR分析表明,Sc CDK基因的表达具有组织特异性,其在蔗芽上的表达量最高,其次是在蔗肉、蔗根、叶鞘和蔗皮中;在PEG、Na Cl和ABA的胁迫诱导过程中,Sc CDK均表现上调作用,且受ABA胁迫后表达量最高,约为对照组的1.9倍。推测该基因的表达与甘蔗抗干旱和抗渗透胁迫有关,同时受ABA的诱导,参与细胞周期分裂。     

高粱中SbDREB2基因的克隆与表达分析

干旱应答元件结合蛋白(DREB)在植物非生物逆境胁迫中调节下游一系列抗逆基因的表达。本研究利用电子克隆和RT-PCR方法从高粱中克隆到1个DREB类基因SbDREB2,该基因ORF 789 bp,推测编码蛋白含262个氨基酸残基,相对分子质量28.6 kD,理论等电点为5.52,在DNA序列内包含1个740 bp的内含子,符合GT-AG剪接规则。氨基酸序列分析表明,该蛋白在82~145区含有DREB类转录因子家族特有的AP2保守结构域,与玉米DREB2A及水稻DREB1蛋白相似度分别为84%和69%。成功构建了原核表达载体pET28a-SbDREB2,经IPTG诱导获得32.5 kD左右蛋白,与理论值一致。Real-time PCR表达特性分析显示,该基因为组成型表达,在根、茎、叶中均表达,根中表达量约是茎中的2.5倍;受干旱、高盐和外源ABA的强烈诱导,但对低温几乎没有响应。     

甘蔗PIN-LIKES基因家族的鉴定与表达分析

PILS (PIN-LIKES)是一类新发现的生长素输出载体,协助生长素的极性运输。本研究立足甘蔗割手密基因组和栽培品种转录组数据,利用生物信息学分析技术,分别在割手密和栽培品种中鉴定到11个PILS(Saccharum spontaneum PIN-LIKES, SsPILS)基因和4个PILS (Saccharum spp. hybrid PIN-LIKES, ScPILS)基因。结果表明, 11个SsPILS基因家族成员分布于6条染色体上,基因内含子数量介于5～11个。系统进化树分析发现,割手密PILS与水稻PILS有较高同源性,归属于3个不同的系统发育分支。转录组数据分析显示, SsPILS1c的同源基因ScPILS1c在受高粱花叶病毒和黑穗病菌胁迫甘蔗栽培种中差异表达。通过RT-PCR扩增技术,克隆获得ScPILS1c基因序列(NCBI accession number:OM258732)。该基因全长cDNA为1332 bp,包含一个1233 bp的完整开放阅读框,编码410个氨基酸,理论等电点(pI)为6.17,不稳定系数为39.31,平均疏水性值为0.689,预测ScPI...     

甘蔗CIPK基因的同源克隆与表达

CIPK(calcineurin B-like-interacting protein kinase)是植物特有一类的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,该蛋白在植物响应逆境胁迫中发挥着重要的作用,尤其与非生物逆境胁迫(干旱、高盐、ABA等)的信号传导密切相关。根据玉米CIPK15基因(EU957447.1,2247 bp)核酸序列保守区域设计1对同源克隆PCR引物,以甘蔗品种崖城05-179的c DNA为模板,通过RT-PCR扩增得到甘蔗CIPK基因的一条全长c DNA序列(Gen Bank登录号为KM114052)。序列分析结果表明,甘蔗Sc CIPK基因全长1782 bp,具有完整的开放阅读框(ORF,91~1631 bp),编码513个氨基酸,该基因具有CIPK基因的2个特征结构域(Kc-like superfamily和AMPKA-C-like superfamily)。生物信息学分析显示该基因编码的蛋白定位于内质网,为可溶性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为α-螺旋,含有多个保守功能域,主要参与中间代谢。实时定量PCR表达分析表明,该基因表达具有组织特异性,虽在甘蔗各组织中均有表达,但在芽中的表达量最高。该基因在PEG、Na Cl、ABA、SA和Me JA的胁迫诱导过程中,受ABA胁迫后表达量最高,约为对照的5.3倍,推测该基因的表达与甘蔗抗干旱和抗渗透胁迫有关。     

甘蔗中一个NBS-LRR类基因的全长克隆与表达分析

采用RACE技术, 从甘蔗高抗黑穗病品种NCo376中克隆了一个NBS-LRR类基因的cDNA全长序列, 命名为SNLR。生物信息学分析显示, 甘蔗SNLR基因的cDNA全长为2 985 bp (Accession No. EF155654), 包括一个2 661 bp的完整开放读码框以及一个典型的29 bp poly-A。同时, 还具有NBS-LRR类抗病基因的所有保守结构域, 包括4个NBS区域保守结构域和6个潜在LRR结构域;蛋白疏水性分析和二级、三级结构分析表明, 该基因编码的蛋白质为弱碱性蛋白, pI为7.76, 无明显的疏水结构域, 以卷曲结构和螺旋结构为骨架, 三级结构未见明显的跨膜信号蛋白区。定量PCR分析表明, 甘蔗SNLR基因的表达受到黑穗病菌、水杨酸和过氧化氢的影响, 分别表现出“抑-扬”、“全程抑制”和“扬-抑”的表达模式, 也具有抗病基因组成型和组织特异性表达的特点。推测甘蔗SNLR基因可能为抗病相关基因。     

甘蔗ABA信号转导关键酶SoSnRK2.1基因的克隆与表达分析

蔗糖非酵解型蛋白激酶(SnRK)是植物体内ABA信号转导途径的关键调控酶, 在植物的抗逆境生长过程中发挥着重要的作用。本研究通过RT-PCR和RACE-PCR技术克隆出编码甘蔗SnRK2蛋白的基因SoSnRK2.1。该基因cDNA序列全长为1385 bp, 包含一个1002 bp的开放阅读框(ORF)。根据氨基酸序列预测SoSnRK2.1基因编码333个氨基酸残基, 与其他高等植物中相关蛋白的氨基酸具有高度的相似性, 尤其是与禾本科的玉米和水稻。构建该基因的原核表达载体pET-SoSnRK2.1, 在IPTG诱导下可得到38 kD 左右的蛋白, 与理论值一致。实时荧光定量PCR分析表明, SoSnRK2.1基因在ABA、干旱(PEG)+ABA、干旱(PEG)、NaCl、低温(4℃)和H₂O₂外源胁迫下均呈诱导表达的趋势。推测该基因参与调控干旱、高盐和低温等胁迫过程, 在甘蔗抗逆境胁迫中起重要作用。     

甘蔗Ca~(2+)/H~+反向运转体基因的克隆与表达分析

CAX(Ca~(2+)/H~+antiporter)是植物细胞膜Ca~(2+)主动运输体系的一个大类。本研究以高粱的CAX1基因(GenBank登录号为XM_002441593)为探针,利用电子克隆并结合RT-PCR技术,获得甘蔗CAX1基因的1条cDNA序列,命名为Sc CAX1(GenBank登录号为KT799799)。生物信息学分析显示,ScCAX1基因全长784 bp,包含1个645 bp的开放阅读框,编码1个214个氨基酸的蛋白质。ScCAX1蛋白被定位于叶绿体类囊体膜,为稳定的疏水性蛋白,不存在信号肽。蛋白二级结构元件多为α-螺旋,具有1个Na_Ca_ex superfamily。实时荧光定量PCR分析表明,甘蔗ScCAX1基因的表达具有组织特异性,在各组织中均表达,但在茎中表达量最低,叶中的表达量最高。在PEG、NaCl、SA、ABA和Me JA胁迫过程中,ScCAX1基因的表达均受到调控。其中ABA、SA和PEG胁迫下表达量上调,均在胁迫24 h达到最大值。SA胁迫24 h的表达量为对照的5.47倍,而ABA胁迫24 h的表达量为对照的3.5倍。NaCl胁迫6 h的表达量达最大值,为对照的2.14倍。推测ScCAX1基因能够响应逆境胁迫,其表达可能与甘蔗的抗盐、抗渗透胁迫性状有关。     

甘蔗中性/碱性转化酶基因(SoNIN1)的克隆和表达分析

中性/碱性转化酶(Alkaline/Neutral Invertase)能不可逆地催化蔗糖分解为葡萄糖和果糖, 在植物生长发育中起重要作用。本研究采用RT-PCR和RACE技术从甘蔗品种GT28心叶中克隆到甘蔗中性/碱性转化酶基因全长cDNA序列, 基因命名为SoNIN1。该基因全长2289 bp (GenBank登录号为JX109944), 开放阅读框为1812 bp, 编码603个氨基酸, 相对分子量为67.79 kD, 等电点为6.41。具有中性/碱性转化酶保守结构域, N-端不含跨膜结构和信号肽。其编码氨基酸序列与玉米、水稻和黑麦草的亲缘关系较近, 属于同一进化分支。利用染色体步移技术克隆到SoNIN1基因5¢侧翼启动子序列, 长度为1174 bp (GenBank登录号为KC854419)。启动子序列含有多个CAAT-box和TATA-box等基本作用元件, 参与分生组织特异性激活, 参与干旱诱导的MYB结合位点, 脱落酸、茉莉酸甲酯和赤霉素响应等作用元件。利用实时荧光定量PCR技术, 在生理成熟期甘蔗茎、叶、花序和芽中均能检测到SoNIN1的表达, 其表达量在叶中最高, 芽中次之, 而在+1节间最低。苗期根和叶中SoNIN1基因都受PEG和NaCl诱导表达。     

甘蔗过氧化物酶基因ScPOD02的克隆与功能鉴定

过氧化物酶(POD)广泛存在于植物各种器官及其不同发育阶段,在植物生长发育及应对逆境胁迫中起重要作用。本研究基于前期转录组数据,从黑穗病菌侵染2 d的甘蔗抗黑穗病品种崖城05-179中分离到ScPOD02基因的cDNA(GenBank登录号为KU593507)及基因组DNA(GenBank登录号为KU593508)序列。其cDNA全长为1434 bp,ORF区为1047 bp,编码348个氨基酸,而基因组DNA全长为1558 bp,含2个外显子和1个内含子。系统发育树显示,ScPOD02与水稻Os Prx11(GenBank登录号为gi|55700889)属于同一个进化分支,推测ScPOD02属于酸性胞外分泌/细胞壁类型的I.1型过氧化物酶家族。将该基因克隆到原核表达载体p ET 32a上,转化大肠杆菌BL21,经异丙基-β-d-硫代半乳糖苷诱导成功获得了大小约60 k D的融合蛋白,且该重组菌在聚乙二醇胁迫下的长势较对照快,表明其耐受干旱胁迫的能力更强。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析表明,除ROC22和YZ03-103外,ScPOD02基因在甘蔗抗病品种(YZ03-258、YZ01-1413、YT96-86和LC05-136)中受黑穗病菌诱导上调表达,但在中感(GT02-467和FN39)和感病(FN40)品种中的基因表达量基本维持不变或略有降低;此外,ScPOD02积极应答水杨酸、脱落酸、聚乙二醇及氯化钠的胁迫。通过农杆菌介导法在本氏烟叶片上瞬时表达ScPOD02,结果显示出较深的DAB染色,且过表达后本氏烟中的目标基因(ScPOD02)及过敏性反应(HR)标记基因(Nt HSR201和Nt HSR203)和乙烯合成依赖基因(Nt EFE26和Nt Accdeaminase)均上调表达。以上研究结果显示,ScPOD02具有参与甘蔗免疫应答及抗旱和抗盐害的潜在功能。     

甘蓝型油菜MAPK7基因家族及其启动子的克隆与表达分析

从甘蓝型油菜中克隆了MAPK7基因家族3个成员BnMAPK7-1、BnMAPK7-2和BnMAPK7-3的全长cDNA序列,它们最长标准mRNA分别为1593、1434和1547 bp。系统进化分析表明,甘蓝型油菜MAPK7基因全部来自白菜,而且BnMAPK7-1/-2的是由白菜Bra03723祖先基因加倍产生的,而BnMAPK7-3则由白菜中Bra037234的祖先基因进化形成的。同时,克隆获得BnMAPK7-1/-2的启动子序列,该启动子里含有多个与光诱导相关的元件、激素响应元件和逆境胁迫响应元件。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)显示甘蓝型油菜MAPK7基因家族在所有的组织器官中均表达,并发现该基因家族的表达受植物激素(MeJA、ABA、SA)、信号分子(H₂O₂)、逆境(高温)以及伤害(损伤和核盘菌)的诱导,初步证明甘蓝型油菜MAPK7基因在植物逆境胁迫应答中起一定作用。实现了甘蓝型油菜MAPK7-1/-3基因的原核表达,并证明它们编码的蛋白主要以包涵体形式存在,为后续的研究提供了基础。     

甘蔗ScHAK10基因克隆及表达分析

为探究甘蔗HAK基因家族中ScHAK10基因的功能及干旱环境下的响应机制,利用同源克隆技术（homologous cloning）从新台糖22号中克隆得到ScHAK10基因的完整编码序列,并对其进行生物信息学分析,同时采用q-PCR技术分析基因在不同组织以及在不同干旱阶段的表达情况。结果表明,ScHAK10基因编码区全长为2 433bp,编码810个氨基酸,相对分子量89.83kD,等电点（pI）为8.46,预测其为疏水碱性蛋白;核苷酸同源性分析表明ScHAK10基因与玉米（Zea mays L.）、高粱[Sorghum bicolor （L.） Moench]等其他作物中HAK基因具有高度的同源性;该蛋白具有跨膜结构域,定位在细胞质膜上。蛋白质二级结构分析发现其主要由α螺旋（38.15%）、扩展长链（19.26%）和无规则卷曲（37.16%）组成;蛋白功能预测显示其与阳离子运输通道相关,有较大的概率显示其介入转录、信号传导、免疫应答等生物活动。qPCR表达分析显示,ScHAK10基因在不同部位都有表达,叶片中的表达量最高,其次为茎,根系中的表达量最低。干旱胁迫下ScHAK10基因受到诱导表达,表达水平根据胁迫程度的加深而呈现出先上调后下降的表达趋势,复水后,基因表达量降低。本研究为进一步阐明甘蔗ScHAK10基因的功能及甘蔗耐旱调控相关分子机制奠定了基础。     

桂花OfF3'H基因的克隆与表达分析

类黄酮3'-羟化酶(F3'H)属于细胞色素P450单加氧酶家族,是苯丙烷类代谢途径关键成员,在植物色泽形成及类黄酮成分调控方面起重要作用。本研究以四季桂‘金玉台阁’为实验材料,采用cDNA末端快速扩增法(RACE)从盛花末期小花cDNA中克隆了桂花OfF3'H基因(GenBank编号:MH509392)。序列分析结果显示该基因全长为1 856 bp,其中5'端非翻译区长度为102 bp,3'端非翻译区长度为191 bp,开放阅读框长度为1 563 bp,编码由520个氨基酸残基组成的蛋白质。系统进化分析表明Of F3'H含有植物F3'H蛋白典型的保守结构域,且与猕猴桃的AcF3'H蛋白亲缘关系最近。桂花花期不同阶段生理与分子研究发现初花期OfF3'H基因表达量和总黄酮含量均为最低,而花谢期OfF3'H基因表达量和总黄酮含量达到最高。此外,Of F3'H存在10个潜在的磷酸化位点,其中第83位点的丝氨酸和第304位点的苏氨酸在不同植物间高度保守。本研究为深入研究桂花花色形成及植物类黄酮合成调控的分子机制提供一定的理论依据。