小麦TaMKK2基因的克隆及功能分析

小麦在生育周期内会遭遇多种非生物胁迫，制约小麦的生长发育。为了提升小麦新品种的抗逆性，本研究基于MAPK抗逆性基因开展实验，以冬小麦新品种‘新冬43号’为实验材料，采用同源克隆方法，获得了MKK2基因，暂命名为TaMKK2，对其编码的基因序列进行了生物信息学分析，并对该基因进行了亚细胞定位和原核表达分析。结果表明，该基因的cDNA序列全长为531 bp，含有1个完整的开放阅读框，编码176个氨基酸，相对分子量约20.07 kD，等电点为8.37；与山羊草、二穗短柄草MKK2基因的亲缘性较近；理论定位于细胞核上，然而实验操作未能检测到荧光信号；各诱导条件下目的蛋白均以包涵体形式存在，纯化复性后得到大小为20.07 kD的目的蛋白。本研究结果为小麦应对非生物胁迫以及利用基因育种技术改良植物抗逆性提供理论依据。     

高粱中SbDREB2基因的克隆与表达分析

干旱应答元件结合蛋白(DREB)在植物非生物逆境胁迫中调节下游一系列抗逆基因的表达。本研究利用电子克隆和RT-PCR方法从高粱中克隆到1个DREB类基因SbDREB2,该基因ORF 789 bp,推测编码蛋白含262个氨基酸残基,相对分子质量28.6 kD,理论等电点为5.52,在DNA序列内包含1个740 bp的内含子,符合GT-AG剪接规则。氨基酸序列分析表明,该蛋白在82~145区含有DREB类转录因子家族特有的AP2保守结构域,与玉米DREB2A及水稻DREB1蛋白相似度分别为84%和69%。成功构建了原核表达载体pET28a-SbDREB2,经IPTG诱导获得32.5 kD左右蛋白,与理论值一致。Real-time PCR表达特性分析显示,该基因为组成型表达,在根、茎、叶中均表达,根中表达量约是茎中的2.5倍;受干旱、高盐和外源ABA的强烈诱导,但对低温几乎没有响应。     

CaM及各亚型基因参与小麦抗叶锈病反应的研究

采用实时荧光定量PCR法,对小麦抗叶锈病近等基因系TcLr15接种亲和或非亲和性叶锈菌后,CaM及其亚型的mRNA表达差异进行相对定量分析.结果表明,小麦接菌后12 h内CaM 的4个亚型基因表达量与不接菌对照相比相差不大.小麦接种非亲和叶锈菌,48,72,96 h后,CaM SF-1表达量分别比亲和组合高 24.6%,26.6%,38.8%;接种24,48 h后,CaM SF-4表达量分别高出亲和组合26.8%和28.0%;在接种后24~96 h这一过程中,CaM SF-2表达量均低于亲和组合中, 而CaM SF-3表达量与亲和组合表达量相差不大.接种非亲和叶锈菌后,在第24 h 、第 48 h小麦CaM表达量分别高于亲和组合18.1% 和 47.9% ,而在第72 h和第96 h CaM表达量又低于亲和组合.上述结果暗示,CaM可能参与了小麦抗叶锈病反应,并且具有亚型特异性.小麦中CaM SF-1和 CaM SF-4可能与小麦抗叶锈病相关,CaM SF-2可能与小麦感叶锈病相关,而CaM SF-3可能不参与小麦抗叶锈病反应.     

梅花PmCBF基因的克隆及表达

CBF转录因子在植物冷驯化中起着重要调控作用。以欧洲甜樱桃CBF基因为信息探针,从李属基因组数据库中得到一个候选序列,设计特异引物,通过PCR扩增和RT-PCR验证,发现与预测序列一致。该基因全长711bp,可编码225个氨基酸,序列分析发现其具有CBF基因的特征序列,包含保守的AP2/EREB DNA结合域以及CBF特征短多肽序列PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR。同源性分析显示,PmCBF和欧洲甜樱桃、矮扁桃CBF基因一致性较高,均在90%以上,与欧洲甜樱桃的氨基酸同源性达100%。实时荧光定量PCR分析发现:4℃低温胁迫下,PmCBF在转录水平的表达情况和其他植物CBF基因一致;4℃处理后PmCBF基因的表达开始上升,4 h时达最大,初步表明PmCBF在低温胁迫下上调表达。     

甘蓝型油菜MAPK7基因家族及其启动子的克隆与表达分析

从甘蓝型油菜中克隆了MAPK7基因家族3个成员BnMAPK7-1、BnMAPK7-2和BnMAPK7-3的全长cDNA序列,它们最长标准mRNA分别为1593、1434和1547 bp。系统进化分析表明,甘蓝型油菜MAPK7基因全部来自白菜,而且BnMAPK7-1/-2的是由白菜Bra03723祖先基因加倍产生的,而BnMAPK7-3则由白菜中Bra037234的祖先基因进化形成的。同时,克隆获得BnMAPK7-1/-2的启动子序列,该启动子里含有多个与光诱导相关的元件、激素响应元件和逆境胁迫响应元件。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)显示甘蓝型油菜MAPK7基因家族在所有的组织器官中均表达,并发现该基因家族的表达受植物激素(MeJA、ABA、SA)、信号分子(H₂O₂)、逆境(高温)以及伤害(损伤和核盘菌)的诱导,初步证明甘蓝型油菜MAPK7基因在植物逆境胁迫应答中起一定作用。实现了甘蓝型油菜MAPK7-1/-3基因的原核表达,并证明它们编码的蛋白主要以包涵体形式存在,为后续的研究提供了基础。     

小麦籽粒大小相关基因TaGS2克隆及功能分析

籽粒大小影响小麦粒重,进而影响产量。目前,对小麦籽粒大小相关基因的研究已有报道,但其潜在的分子机制尚不清楚。本研究通过同源克隆的方法从普通小麦中克隆了小麦籽粒大小相关基因TaGS2,并对其序列进行生物信息学分析。烟草亚细胞定位结果表明, TaGS2定位在细胞核和细胞质内。不同组织材料qRT-PCR分析表明, TaGS2基因在小麦籽粒不同发育时期的表达量最高。构建TaGS2-PLGY-02-RNAi表达载体,转化小麦。研究结果表明, TaGS2基因在RNAi转基因小麦中表达量显著降低。RNAi转基因小麦的籽粒长度变短,籽粒宽度变窄,千粒重也降低。因此推测TaGS2基因可能参与小麦籽粒大小或者千粒重的调控。本研究初步揭示了TaGS2基因功能,并为小麦高产育种中千粒重的提高提供重要的基因资源。     

小麦TaPLD-2基因的克隆及功能分析

为了寻找耐盐新基因,培育耐盐新品种。本研究以23个小麦品种为材料,对TaPLD-2基因进行克隆及序列多态性分析,并对TaPLD-2基因响应盐胁迫表达模式进行了研究。结果表明,TaPLD-2基因的全长编码框为1301 bp,位于2DS染色体上,编码的蛋白定位于细胞质,为亲水蛋白,无跨膜区域,属于可溶性NAD(P)(H)氧化还原酶家族;TaPLD-2基因受盐胁迫诱导上调表达,表达量在盐胁迫24 h为对照组的1.8倍,48 h达到最高,为对照组5倍。分析表明SNP位点与相对根长、相对株高及K⁺、Na⁺含量都存在一定程度的相关性。     

拟南芥核酸酶基因AtCaN2克隆及功能分析

为了研究拟南芥核酸酶AtCaN2基因在植物生长发育过程中的作用与功能,从拟南芥中克隆了核酸酶AtCaN2基因,并对该基因进行生物信息学分析,亚细胞定位分析,蛋白质诱导、表达、纯化及功能研究。结果表明,AtCaN2蛋白等电点为8.45,化学式为C₁₁₁₆H₁₇₈₈N₃₁₀O₃₃₅S₃,共含有3 552个原子数,为亲水性蛋白;AtCaN2与十字花科亚麻荠的同源性较高,同源性为87.89%,与谷子、高粱和玉米的同源性较低,同源性分别是56.42%,57.35%,56.47%,且在氨基酸序列中间具有高度保守的D-X-D序列;同时进化树分析显示AtCaN2与十字花科亚麻荠的亲缘性最近,与谷子、玉米等禾本科植物的亲缘性比较远,这些结果同氨基酸序列比对的结果一致;亚细胞定位结果显示其定位于细胞质,与预测结果相符;蛋白质诱导和纯化得到大小约为35 ku的His-AtCaN2融合蛋白;Western Blot分析显示,诱导表达的融合蛋白正确翻译表达,且没有出现结构上的断裂或者降解的情况;小量诱导...     

黏类小麦细胞质雄性不育相关基因cMDH的克隆与表达分析

为深入研究黏类小麦雄性不育的分子遗传机制,利用抑制差减杂交技术构建了黏类小麦育性相关基因的二核期SSH文库.经文库筛选后,得到一个在可育文库中表达的与胞质苹果酸脱氢酶基因同源的EST序列.以该EST序列为信息探针,经电子克隆、RT-PCR、PCR克隆与序列分析,获得了小麦胞质苹果酸脱氢酶(cytosolic malate dehydrogenases,cMDH)基因的cDNA与DNA序列,利用荧光定量PCR技术对该基因在不育株和可育株花药中的表达进行了分析,并比较了MDH在小麦不育株和可育株中的活性变化.结果表明,该基因的cDNA序列长1213 bp,编码333个氨基酸;DNA序列长2 908 bp,含有7个外显子和6个内含子;该基因在不育株和可育株花药发育3个时期(单核、二核和三核)的表达均表现为先升后降的模式,而且该基因在不育株花药发育的二核期和三核期的表达相对于可育株被明显抑制;MDH在小麦不育株和可育株中的活性变化趋势与定量结果一致.推测该基因在花粉发育早期表达,它的下调表达可能影响了小麦雄蕊发育过程中的能量供应而导致雄性不育.     

小麦脂质转运蛋白基因TaLTP克隆及功能分析

脂质转运蛋白(lipid transfer protein,LTP)是广泛存在于植物中的一类小分子蛋白,因其能在植物细胞膜间运输脂类物质而得名,在植物角质层合成和适应多种环境胁迫中起重要作用。本研究利用同源克隆方法得到Ta LTP-s的c DNA全长序列510 bp,开放阅读框为339 bp,编码112个氨基酸。利用RIL群体将Ta LTP-s定位在染色体1A上,距离两侧标记WMC449和WMC93的遗传距离分别为2.1 c M和5.9 c M。通过原生质体亚细胞定位显示Ta LTP-s定位于细胞膜和细胞质中。小麦开花期Ta LTP-s在小花中表达量较高,尤其是在花药中的表达量远高于在根和叶中。在ABA、PEG、Na Cl及4℃低温胁迫诱导下,小麦Ta LTP-s均上调表达,可能与抗逆性调节相关。在高盐胁迫处理下,转基因拟南芥幼苗的细胞膜稳定性和存活率显著高于野生型。研究结果为利用小麦脂质转运蛋白基因改良作物抗逆性奠定了基础。     

小麦胁迫相关基因TaLEAL3的克隆及分子特性分析

第3组LEA蛋白(late embryogenesis abundant protein)介导干旱、高温、高盐等非生物胁迫响应, 关于普通小麦LEA基因的研究鲜有报道。利用噬菌体原位杂交技术, 从小麦苗期干旱胁迫条件构建的cDNA文库中筛选出LEA蛋白基因TaLEAL3, 其全长750 bp, 编码区长501 bp, 编码166个氨基酸, 含有一个明显的核定位信号区。氨基酸同源性分析发现, TaLEAL3属于第3组LEA蛋白, 序列中含有由11个氨基酸组成的3个不完全重复的基序和α-螺旋的LEA结构。电子定位结果显示, TaLEAL3基因位于4BL、4DL和5AL染色体上, 主要在茎中表达, 而在根中几乎无表达。实时荧光定量PCR分析表明, 在干旱、低温和ABA诱导下, TaLEAL3基因表达量明显增加。在该基因上游1.7 kb序列处, 预测具有启动子的核心序列和增强子序列, 及与干旱和低温等多种逆境胁迫相关的调控序列。本研究为深入分析小麦LEA蛋白基因的功能, 初步解析LEA蛋白的作用机制提供了数据。     

小麦TaWRKY44基因的克隆、表达分析及功能鉴定

WRKY是植物特有的转录因子基因, 在植物对外界胁迫响应及生长发育的过程中发挥重要作用。本研究克隆了一个新的小麦WRKY转录因子基因TaWRKY44, 获得其全长cDNA, 其中开放阅读框长度为897 bp, 编码298个氨基酸。半定量RT-PCR的结果表明, TaWRKY44在叶片中表达水平较高, 并且受干旱和低温胁迫诱导表达。转基因功能分析结果表明, TaWRKY44的拟南芥超表达株系叶片变小, 叶柄缩短, 并且叶片细胞也明显小于野生型。另外, 转基因系对ABA、干旱和盐等胁迫处理的敏感性也高于野生型, 说明该基因可能作为一个转录抑制子参与逆境胁迫信号转导过程。     

花生膜联蛋白基因AhAnn1的克隆与表达分析

为挖掘花生抗逆境胁迫相关基因,克隆抗逆相关膜联蛋白Annexin基因,以花生品种花育25号为试验材料,从已知抑制消减杂交文库中获得花生膜联蛋白Annexin类似基因片段,通过RACE技术获得Annexin基因5'-RACE片段。对5'-RACE序列和抑制消减杂交文库中已知基因片段进行拼接,设计特异引物通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增得到该基因,命名为AhAnn1。结果表明,AhAnn1全长为1 277 bp,开放阅读框为951 bp。根据编码区预测AhAnn1编码一条316个氨基酸组成的多肽,预测分子量为36.10 k Da,等电点为7.07。预测该基因编码的蛋白含有膜联蛋白Annexin保守结构域,定位于细胞质中。蛋白序列多重比对和系统发育分析表明,花生与大豆、苜蓿、鹰嘴豆等豆科植物中的膜联蛋白相似性最高,亲缘关系最近。荧光实时定量PCR结果显示,AhAnn1在根系和叶片中的表达量随干旱胁迫程度的增加而增加。由此推测AhAnn1是一种干旱胁迫应答基因,在花生逆境调控中发挥作用。结果为进一步研究花生AhAnn1基因的功能和花生抗逆境胁迫相关分子机理提供了理论基础。     

小麦TaVIP1家族基因克隆、分子特性及功能分析

植物VIP1蛋白(Vir E2 interacting protein 1)与农杆菌侵染植物后T-DNA在细胞内的转运有关,影响植物转化效率,但还未见有关小麦中VIP1基因研究的报道。本研究利用in silico技术从普通小麦中克隆了TaVIP1家族基因,该家族基因全部由4个外显子构成,编码产物相似性高,与拟南芥AtVIP1蛋白质序列相似性仅为50.7%~51.4%。Southern杂交结果表明,TaVIP1基因在小麦基因组中存在3个拷贝。根据小麦3个TaVIP1基因的差异序列设计特异引物,以四倍体小麦Langdon与中国春D组染色体代换系为材料进行PCR检测,结合生物信息学分析,将小麦3个TaVIP1基因分别定位在4AL、4BS和4DS染色体上。亚细胞定位分析表明,TaVIP1蛋白分布于细胞膜、细胞质和细胞核中。农杆菌转化烟草,过表达TaVIP1基因降低了烟草转化效率。小麦TaVIP1基因编码的氨基酸序列与拟南芥AtVIP1基因及烟草NtVIP1基因编码的氨基酸序列相似性很低,这可能是小麦农杆菌转化效率低的原因之一。     

甘蔗CIPK基因的同源克隆与表达

CIPK(calcineurin B-like-interacting protein kinase)是植物特有一类的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,该蛋白在植物响应逆境胁迫中发挥着重要的作用,尤其与非生物逆境胁迫(干旱、高盐、ABA等)的信号传导密切相关。根据玉米CIPK15基因(EU957447.1,2247 bp)核酸序列保守区域设计1对同源克隆PCR引物,以甘蔗品种崖城05-179的c DNA为模板,通过RT-PCR扩增得到甘蔗CIPK基因的一条全长c DNA序列(Gen Bank登录号为KM114052)。序列分析结果表明,甘蔗Sc CIPK基因全长1782 bp,具有完整的开放阅读框(ORF,91~1631 bp),编码513个氨基酸,该基因具有CIPK基因的2个特征结构域(Kc-like superfamily和AMPKA-C-like superfamily)。生物信息学分析显示该基因编码的蛋白定位于内质网,为可溶性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为α-螺旋,含有多个保守功能域,主要参与中间代谢。实时定量PCR表达分析表明,该基因表达具有组织特异性,虽在甘蔗各组织中均有表达,但在芽中的表达量最高。该基因在PEG、Na Cl、ABA、SA和Me JA的胁迫诱导过程中,受ABA胁迫后表达量最高,约为对照的5.3倍,推测该基因的表达与甘蔗抗干旱和抗渗透胁迫有关。     

甘蔗CDK基因的cDNA全长克隆与表达分析

植物细胞周期依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,与周期蛋白(Cyclins)协同作用,是重要的细胞周期性调控因子。本研究从甘蔗受花叶病毒侵染的转录组数据库中获得一条与高粱(Sorghum bicolor)CDK基因(Gen Bank登录号为XP_002466536.1)高度同源的Unigene序列,通过RT-PCR扩增获得长度为1799 bp的甘蔗Sc CDK基因(Gen Bank登录号为KR258796)。序列分析显示Sc CDK基因含一个完整的开放阅读框(65~1603 bp),编码512个氨基酸,且具有CDK典型保守结构域,如ATP结合位点、磷酸结合位点及活化环A-loop。此外,生物信息学预测显示该基因编码的蛋白定位于细胞核,为可溶性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为无规则卷曲,主要参与蛋白翻译。实时荧光定量PCR分析表明,Sc CDK基因的表达具有组织特异性,其在蔗芽上的表达量最高,其次是在蔗肉、蔗根、叶鞘和蔗皮中;在PEG、Na Cl和ABA的胁迫诱导过程中,Sc CDK均表现上调作用,且受ABA胁迫后表达量最高,约为对照组的1.9倍。推测该基因的表达与甘蔗抗干旱和抗渗透胁迫有关,同时受ABA的诱导,参与细胞周期分裂。     

小麦Kr基因片段的克隆及序列分析

小麦远缘杂交不亲和性受Kr基因控制.为研究不同基因型小麦Kr基因的序列特征,从中国小麦微核心种质中选择蚂蚱麦、小白芒、托克逊1号、中国春、洋麦、郑麦9023等6种基因型小麦为试验材料,采用同源克隆方法,分离小麦Kr基因并分析其序列特征.结果表明,6种基因型小麦中有3种扩增出Kr基因片段,3条DNA序列长度均为414 b...