基于SLAF-seq技术的树莓SNP位点开发

为分析树莓群体的遗传进化关系,开发特异性SNP标记。选用23 个栽培种树莓以用SLAF-seq技术测序,从树莓全基因组范围开发SNP位点,以黑树莓基因组为参考基因组,通过生物信息学分析进行电子酶切预测,筛选特异长度的DNA片断,构建SLAF-seq 文库。通过高通量测序的方式获得海量序列标签,利用软件分析比对,获得多态性SLAF标签,进而开发大量特异性SNP位点。对照水稻的测序数据与参考基因组比对结果,双端比对效率为95.60%,酶切效率为93.52%,说明SLAF建库正常。通过测序共产生59.93 Mb的读长数据,测序质量值Q30 平均为95.07%,所有样品GC含量均值为39.16%,GC含量普遍不高,说明达到测序要求。本研究共获得425402 个SLAF标签,其中多态性的SLAF标签共有121610 个。获得749811 个有效单核苷酸多态(SNP),利用这些SNP分析了23 个树莓种质的群体结构与系统发生树。利用简化基因组测序技术SLAF-seq 可以高效地、低成本地开发出大量的可用于群体遗传结构分析的SNP标记。     

四种天麻基于SLAF测序的SNP标记开发与分析

为了分析天麻种质资源的遗传多样性及其进化关系,开发特异性SNP(Singlenucleotidepolymorphism)标记位点。实验通过对4种不同种或不同产地的同种天麻共28个样品进行SLAF测序,首次在天麻种质资源中得到SLAF标签并开发SNP标记,通过De nove测序技术,构建SLAF文库,利用GATK和SAMTOOLS技术开发SNP标记。共获得75.95 M高质量的reads数据,471001个SLAF标签,其中多态性SLAF标签19675个,并开发出60238个群体SNP。对SNP标记的分析的结果表明,作为主要栽培种的天麻(W)由于长时间的人工培育,也许使得其遗传进化体系与其他的天麻种质资源存在较大差异。另外,所有样品中SNP标记的杂合率普遍高于20%,突出了天麻这一物种广泛的杂合性。而且,利用简化基因组测序技术SLAF-seq可以高效地、低成本地开发出大量的可用于群体遗传结构分析的SNP标记。     

基于SLAF-seq技术的向日葵SNP标记开发与利用

为解决向日葵基因组序列庞大及基因位点挖掘的问题,试验共收集了122份向日葵资源材料,利用SLAF-seq技术,以菊科小蓬草基因组作为参考基因组进行酶切预测,水稻日本晴测序数据为对照进行比对,获得多态性标签,并开发大量特异性SNP。本研究共获得477.76 M Reads数据,读长范围在1 329 754~5 770 666之间,对照数据的双端比对效率为92.96%,酶切效率为95.07%,平均Q30为92.32%,平均GC含量为43.04%,每个样本平均开发171 684个SLAF标签,样本SLAF标签的平均测序深度为20.07 x,通过生物信息学分析,共获得1 105 347个SLAF标签,其中多态性SLAF标签共有86 985个,共鉴定到414 692个群体SNP。这些SNP位点可为向日葵特异SNP标记的开发、资源鉴定分析以及农艺性状的关联分析等提供理论依据。     

基于SLAF-seq技术枇杷SNP位点开发

利用SLAF-seq测序技术,开发一批特异性强、稳定性高的单核苷酸多态性(SNP)位点,为枇杷遗传图谱构建、分子辅助育种和物种进化等研究提供理论依据。本研究共收集294份枇杷属资源,利用SLAF-seq测序技术进行测序。以梨基因组为参考基因组进行电子酶切预测,确定使用HaeⅢ+Hpy166Ⅱ进行酶切,构建SLAF-seq文库,而后筛选314～364 bp长度的DNA片段定义为SLAF标签,预测可得到116 171个SLAF标签。共获得526.63 M reads数据,各样品所获得的读长数目在119 893～9 305 152范围内,平均读长为1 787581;测序质量值Q30的范围在88.26%～95.67%,平均为93.61%;GC含量分布在38.79%～42.92%范围内,平均值为40.35%。本实验以水稻测序获得0.16 M reads的数据量为Control,双端比对效率在91.28%,说明SLAF建库基本正常。生物信息学分析结果显示本研究共获得623 356个SLAF标签,且有123 498个多态性的标签,多态性为19.81%。在多态性SLAF标签上开发得到1 604 434个群体SNP标记。根据完整度0.8,MAF0.05过滤,共得到95 960个高一致性的群体SNP。     

紫苏SNP分子标记开发及遗传多样性分析

紫苏(Perilla frutescens(L.))是一种药食兼用型的植物,具有丰富的营养价值和药用价值,本研究利用特异性位点扩增片段测序技术(specific-locus amplified fragment sequencing,SLAF-seq)对30份紫苏种质资源进行了分子标记开发,以‘日本晴’(水稻)为对照,测序获得紫苏全基因组范围内的SNP分子标记。通过测序共获得106.92 Mb Reads数据,各样本Reads数据在1742153~9815872之间,样本平均测序质量值Q30为95.91%;平均GC含量为39.16%。通过生物信息学分析,本研究获得406599个SLAF标签,样本的平均测序深度为19.13倍,其中多态性的SLAF标签共有140387个,共得到419223个群体SNP标记。利用开发的SNP分子标记将30份紫苏种质资源分为2组,紫苏SNP分子标记的研究可为紫苏的遗传图谱构建、种质资源鉴定以及农艺性状的关联分析提供理论基础。     

基于SLAF-seq技术的闽楠SNP标记开发及遗传多样性分析

利用简化基因组测序技术SLAF-seq,对广泛分布在长江以南地区8个省份的33份闽楠种质进行SNP标记开发、指纹图谱构建和遗传多样性分析。本研究对各样品的测序数据进行统计,共获得107.52 Mb Clean Reads数据,每个样品的SNP标记数目介于309 012～540 030之间,样本平均测序质量值Q30为93.78%,平均GC含量为40.90%。共获得1 072 115个SLAF标签,其中多态性SLAF标签275 389个。通过序列分析,获得121 352个有效的单核苷酸多态性标记(SNP);经过指纹图谱严格的过滤条件,筛选出3 452个SNP位点作为指纹图谱SNP。利用开发的SNP分子标记,将33份闽楠种质资源分为3个亚群,这3个亚群分别包含材料为Q1:17个,Q2:11个,Q3:5个。通过进一步过滤,获得270个核心SNP标记作为指纹图谱的核心标记,可用于品种种质的鉴定。研究结果表明,简化基因组测序技术SLAF-seq能高效、低廉地开发出大量SNP标记,是一种适用于闽楠种质资源遗传分析的有效工具;利用筛选出的核心SNP分子标记构建闽楠DNA指纹图谱,为SNP分子标记应用于闽楠种质鉴定、闽楠品种改良与优质品种选育提供依据,也有利于闽楠种质的高效利用及杂种优势群的建立。     

高粱单核苷酸多态性(SNP)标记开发研究初报

高粱在粮食安全、人类健康和生物能源的开发上具有非常重要的作用,其被认为是二倍体模式化作物和多倍体能源作物甘蔗和芒草类的参考植物,开发高粱多态性分子标记对促进分子遗传学发展及高粱分子标记辅助育种意义重大。以甜高粱与粒用高粱杂交的F2遗传群体作为研究材料,对其全基因组DNA进行酶切,然后用高通量测序法开发SLAF(Specific-locus amplified fragment sequencing)标签,并经过分析筛选多态性SNP标记。试验过程中测序的reads数达到43 528 021个,母本2 598 472个,父本3 134 524个,子代的reads数为205 083~454 258个,平均为290 732.5个。通过原始数据的评估、聚类和纠错开发的SLAF标签数,父母本分别为44 895,42 100个。测序深度分别为19.78和16.22,F2群体每个个体的SLAF标签为26 737~39 291个,平均为33 445.06个,测序深度2.24~3.72,平均为2.79。通过对聚类群中高深度片段的潜在基因型分析,得到了6 353个多态性SNP标记,其中5 829个标记成功分型,占多态性SNP标记的91.75%,剔除不适宜作图的标记,剩余有效的SNP标记2 246个,占有效标记百分比100%,F2个体的各样品完整度平均为94.99%。所以,对基因组DNA进行酶切和高通量测序,从庞大的reads中获得SLAF标签是得到全基因组SNP标记的有效途径。为高粱高密度图谱构建和QTL定位研究,以及分子标记辅助育种奠定了基础。     

基于SLAF-seq技术红豆树基因组的SSR位点特征分析

简单重复序列(SSR)广泛存在于基因组中,是亲缘关系分析、DNA指纹图谱构建和遗传多样性研究领域中非常重要的遗传标记之一。红豆树群体已处于濒危状态,且属无参基因组,其近缘种开发的SSR引物亦很少,为满足红豆树遗传多样性研究及制定合理的保护策略,本研究基于SLAF-seq(specific-locus amplified fragment sequencing)技术对天然群体中典型红豆树进行简化测序,利用MISA软件对测序获得所有SLAF片段进行SSR位点搜索,并对SSR位点特征进行统计分析,最后利用Primer Premier 5.0软件进行引物批量设计。与日本晴水稻的测序数据相比,红豆树参考基因组的双端比对效率为90.14%,酶切效率为92.37%,说明SLAF建库正常;测序Q30为92.32%,GC含量为37.17%,说明达到测序要求。本研究共获得6 426 462 reads和592 221个SLAF标签,其中16 653个多态性SLAF标签,含有17 868个SSR位点,平均每6.98 kb就分布有1个SSR位点。不同核苷酸重复类型的基元类型数量及SSR位点数量间差异较大,除单核苷酸外,二、三核苷酸重复类型数量较多,分别占总SSR位点的17.15%和15.02%,其中AT/TA和GAA/TTC基元重复数量最多,分别为1 090个(43.1%)和349个(15.2%)。通过批量引物设计共得到2 817对引物,以二、三核苷酸类型较多,两者所占比例高达94.8%。结果表明:SLAF-seq技术可以很好的应用于红豆树(无参基因组)SSR位点的开发,基于简化基因组测序数据发掘的SSR位点能够为SSR分子标记开发提供信息,并有助于后续群体遗传多样性和交配系统分析等。     

利用SLAF-seq技术构建水稻籼粳交DH群体遗传图谱

我们利用特定位点扩增片段测序技术(specific-length amplified fragment sequencing,SLAF-seq)对籼稻窄叶青8(ZYQ8)和粳稻京系17(JX17)构建的双单倍体(doubled haploid,DH)群体进行了简化基因组测序。将DH群体测序数据与水稻参考基因组进行比较分析,获得了70 997个在两个亲本中存在多态性的SLAF标签。通过进一步的筛选,我们利用8 940个高质量的SLAF标签构建了该群体的遗传图谱。图谱覆盖12个连锁群,总图距为2 294 71 c M,标记间的平均图距为0.26 c M。遗传图谱的连锁群与水稻物理图的相关系数统计显示,除了9号连锁群的相关系数为0.87外,其余的11个连锁群的相关系数均在0.95以上,表明该图谱的12个连锁群与水稻物理图有很好共线性关系。该高密度图谱的构建为我们进一步研究籼、粳差异基因提供了帮助。     

控制高粱分蘖与主茎株高一致性的基因定位

用分蘖与主茎株高一致的高粱品系K35-Y5与分蘖明显高于主茎的高粱恢复系1383杂交, F1自交获得F2分离群体,构建两混池,采用BSA (bulked segregation analysis)和SLAF (specific length amplified fragment sequencing)技术将高粱分蘖与主茎株高一致基因定位。遗传分析表明,分蘖与主茎株高一致性状由1对隐性核基因控制。参考已公布高粱基因组设计酶切方案,构建SLAF文库并测序。对高粱参考基因组序列进行电子酶切预测,确定限制性内切酶为Rsa I+Hae III,酶切片段长度为364～414 bp;测序Q30为91.70%, GC含量为45.79%,达到测序要求;与水稻的测序数据相比,高粱的双端比对效率为93.35%,酶切效率为90.60%, SLAF建库正常。共获得30.80 M reads,开发出133,246个SLAF标签,再通过分析SLAF标签的多态性,检测到319,428个SNP位点。利用SNP-index法和Euclideandistance法及取两者交集进行关联分析,最后得到一个关联区域,位于第9染色体上的54,788,026～56,740,873区间内,关联区域长度1.95 Mb。分析关联区域内的基因在2个亲本之间SNP,对这些SNP进行变异的注释,发现4个非同义突变的SNP。经验证,这4个SNP位点和分蘖与主茎株高一致性状相关。对应到Sobic.009G197901.1、Sobic.009G213300.1和Sobic.009G221200.1三个基因上,这些基因可能是与性状直接相关的功能基因。     

特早熟甘蓝型春油菜恢复系核心种质构建

通过对特早熟甘蓝型春油菜恢复系种质资源进行评价和利用,降低育种工作中恢复系与不育系选配杂交组合的工作量,从而更好地为杂交种选育服务。通过对97份波里马雄性不育系的恢复系进行简化基因组（SLAF-seq）测序,开发SNP标记,进而分析群体遗传关系,构建核心种质群体。结果显示,共获得527 872个SLAF标签,842 248个有效SNP;利用有效SNP对97份种质资源进行聚类分析,可将其分为5类;利用Core Hunter构建核心种质,构建了C30核心种质29份,C40核心种质38份,C30和C40核心种质平均等位基因覆盖度分别为99.89%和99.96%,这些材料能够代表整个资源的变异程度,达到了构建核心种质的要求。     

甘薯近缘野生种Ipomoea trifida(4x) GISH分析

以甘薯近缘野生种I. trifida (2x)为探针, 与I. trifida (4x) 2个株系“695104”和“697288”的体细胞染色体进行基因组荧光原位杂交, 结果显示, 2株系都与I. trifida (2x)有很近的亲缘关系, 但2株系的信号存在差异。“695104”几乎所有染色体整条都有均匀明亮的信号, 应为I. trifida (2x)基因组直接加倍而来;而 “697288”与“695104”不同, 虽然各条染色体也均有杂交信号, 但信号的区域与亮度有差异, 较为复杂, 可分为三种情况。第1种是整条染色体有均匀明亮的信号, 亮度与分布区域同“695104” , 有41条;第2种是几乎整条染色体有信号, 但亮度较第一种暗, 有14条;第3种为染色体部分区域有信号, 亮度较前二者更暗, 有5条。推测 “697288”是在加倍同时或之后又发生了基因组重组与部分变异。     

Evolutionary autoploidy in the sweet potato (Ipomoea batatas (L.) Lam.) and its progenitors

Summary The role of polyploidy in the evolution of the sweet potato. I. batatas (2n=6x=90), became more clear in 1971 when wild species with 30, 60, and 90 chromosomes were discovered. These species, I. leucantha (2x), I. littoralis (4x) and I. trifida (6x), are the progenitors of the sweet potato (6x), in an autopolyploid series with doubling of the I. leucantha B genome.In the present study the hypothesis of the origin of the sweet potato was confirmed by comparative studies on some plant characters, sexual compatibility, and the behavior of artificial hexaploids produced from I. leucantha (2x) and I. littoralis (4x).Since induced hexaploid I. leucantha exhibits weak growth, a few multivalents are formed at meiosis in the sweet potato, and there are differences in morphological and physiological characteristics between the artificial hexaploids and I. batatas, raw autoploidy seems unlikely, but a balanced or diploidised autoploidy could have been achieved by genic and chromosomal changes in the course of evolution. However, there is still sufficient homology so that meiotic pairing occurs usually between regular partners but also between homoeologous chromosomes in a certain situation.     

甘薯近缘野生种三浅裂野牵牛WRKY基因家族的生物信息学分析

WRKY基因家族是一类含有WRKY保守结构域的转录因子大家族,是植物中最大的转录调控因子家族之一。目前已有多种植物WRKY家族的分析鉴定报告,但关于甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)中WRKY家族的报告却很少。本研究利用生物信息学方法对甘薯近缘野生种三浅裂野牵牛Ipomoea trifida(Kunth)G.Don的基因组数据进行了详细的分析,结果显示:在三浅裂野牵牛基因组中共鉴定得到82个WRKY转录因子,其中81个不均匀分布在基因组的15条染色体上,第5号染色体上分布最多(10个基因),第8和15号染色体上分布最少(2个基因);蛋白分子大小在116~710个氨基酸之间,等电点为4.85~10.33不等;按照保守结构域分类可以分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三组,Ⅱ组包含Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd和Ⅱe五个亚组,其中Ⅰ组有15个ItWRKY基因、Ⅱa组4个、Ⅱb组11个、Ⅱc组23个、Ⅱd组7个Ⅱe组10个、Ⅲ组12个;82个ItWRKY基因中有8个基因的核心结构域WRKYGQK发生了单个氨基酸变化(WRKYGKK)。ItWRKY基因以组织特异性的方式表达且在不同胁迫下基因的表达量存在差异,表明ItWRKY基因参与了三浅裂野牵牛对胁迫的响应。本研究为甘薯WRKY基因的功能鉴定提供了参考作用,进一步为甘薯的分子育种提供了帮助。     

甘薯近缘植物三浅裂野牵牛(I.trifida)杂交不亲和性的研究

甘薯近缘野生植物三浅裂野牵牛(I.trifida)与甘薯一样存在着杂交不亲和群。通过1979、1980两年的分群鉴定,初步在32个株系中找出 T₃、T₄、T₅、T₈、T₍₂₂₎及 T₍₂₃₎等六个杂交不亲和群,并且首次发现其中的 T₂₃株系属“多群性”材料;另外,测出三浅     

甘薯与低倍体种间杂种杂交低结实性的克服

通过观察花粉萌发、 花粉管生长、 受精、 胚发育等过程, 发现甘薯与低倍体(3 x, 5 x)种间杂种杂交低结实性的原因： 一是花粉附着量少、 花粉萌发量少、 花粉管生长缓慢导致子房受精不足, 使子房出现第一次大量脱落; 二是胚发育异常导致子房出现第二次大量脱落。 这种胚发育异常对甘薯×5 x杂种来说是受精卵发育缓慢; 对