海岛棉GbMYB5基因的克隆及表达分析

为了挖掘鉴定棉纤维发育相关基因,本研究根据海岛棉RIL群体定位的纤维强度QTL位点,结合转录组数据及海岛棉全基因组数据库注释信息,筛选出1个R2R3类MYB转录因子基因Gbar_A11G032760.1,根据该基因的注释信息,克隆并命名该基因为GbMYB5,qRT-PCR分析发现,在纤维发育15、20、25 DPA (Days post anthesis),该基因在高FS (Fiber strength)材料中的表达量显著高于低FS材料,且在高FS材料中明显上调表达;氨基酸序列分析表明,GbMYB5基因的编码区长747 bp,编码248个氨基酸残基,氨基酸序列包含1个高度保守的HTH-myb DNA-binding domain;序列同源比较及系统发育进化表明,该基因与不同物种的MYB5相关蛋白氨基酸序列都存在1个高度保守的HTH结构域;GbMYB5和雷蒙德氏棉的MYB5聚集在同一分支上,该基因与雷蒙德氏棉的同类基因亲缘关系较近。利用qRT-PCR分析不同组织表达情况,发现GbMYB5基因在花瓣和花萼中极显著表达量,雌蕊和雄蕊中显著表达一般,茎组织中表达不显著。研究初步分析了该基因的氨基酸序列及表达模式,为今后棉花MYB转录因子在纤维发育阶段的功能及分子机制的研究提供依据。     

棉花转录因子基因GhMYBPA1的克隆及表达分析

MYB转录因子蛋白普遍存在于植物中,在生物和非生物胁迫中发挥着重要作用。为了探讨棉花MYB转录因子的功能,采用同源克隆技术,在棉花叶片组织中克隆GhMYBPA1基因,并对其进行生物信息学和不同逆境胁迫下的表达分析。结果表明,从中棉35中成功克隆得到1个新的MYB转录因子基因GhMYBPA1(基因登录位点为XM₀16869420),cDNA全长为825 bp,开放阅读框630 bp,编码210个氨基酸;生物信息学分析结果表明,GhMYBPA1蛋白分子质量为20.183 ku,N端含有2个MYB的DNA保守结合域,属于R2R3-MYB型转录因子;氨基酸同源分析发现,GhMYBPA1蛋白与来自亚洲棉GaMYB12-like同源性较高;qRT-PCR分析结果表明,GhMYBPA1在棉花根、茎、叶、花中均有表达,花中相对表达量最高,其次是叶;逆境胁迫分析表明,在受到高盐、低温和干旱处理诱导时,GhMYBPA1基因的表达量均发生了变化,推测GhMYBPA1可能在棉花非生物胁迫过程中起重要的调控作用。研究结果可为进一步开展GhMYBPA1基因功能研究奠定理论基础。     

黄瓜CsRAX2的克隆与表达分析及原核表达蛋白诱导

作为最大的转录因子家族,MYB转录因子广泛参与植物的生长发育以及对胁迫的响应与耐受。CsRAX2是黄瓜MYB转录因子家族成员之一,本研究通过同源克隆法克隆了CsRAX2全长,分析了该转录因子基因的生物信息和表达特征,在原核表达系统中诱导并纯化该蛋白。结果表明,CsRAX2全长939 bp,编码321个氨基酸,定位在3号染色体。CsRAX2蛋白定位在细胞核,与其他物种MYB的进化关系很近,是一个典型的R2R3-MYB转录因子。CsRAX2表达具有组织特异性,且低温处理显著诱导采后黄瓜CsRAX2表达,表明其可能在采后黄瓜低温反应调控中发挥作用。启动子元件分析显示,该基因启动子中含有多个环境和激素响应元件,表明非生物胁迫可能通过激素信号调控CsRAX2表达。原核表达研究表明,培养温度影响原核表达蛋白的诱导效果,降低细菌培养温度能提高上清液中融合表达蛋白产量。本研究结果为进一步研究黄瓜CsRAX2基因的生物学功能及黄瓜耐冷性机理提供了帮助。     

木薯MYB转录因子基因MeMYB60表达特征分析及其互作蛋白筛选

Myeloblastosis (MYB)类转录因子在植物对非生物胁迫的响应过程中起重要调控作用。本研究在分析栽培木薯MYB家族成员表达模式的基础上,筛选并克隆到了一个R2R3-MYB转录因子基因MeMYB60。基因表达特性分析表明,该基因在叶片特异表达,受干旱、低温负调控,同时对ABA处理也有响应。启动子活性分析发现,MeMYB60可以在保卫细胞表达,预示着该转录因子基因的表达可能与木薯气孔开闭调节有关。MeMYB60编码蛋白主要定位于细胞核中,具有转录激活活性,其转录激活结构域在蛋白C端第194～343氨基酸残基范围内。以MeMYB60蛋白N端第1～194氨基酸残基片段为诱饵,从干旱胁迫后木薯叶片的cDNA文库中筛选到18种可能与MeMYB60互作的蛋白,酵母双杂确定了MeCatlase1和MeCatalase2分别与MeMYB60存在互作关系。本研究为深入研究转录因子MeMYB60在木薯响应非生物胁迫过程中的功能并解析其调控网络奠定了基础。     

海岛棉GbCHI基因启动子的克隆及瞬时活性表达分析

查尔酮异构酶(chalcone isomerase, CHI)是类黄酮代谢途径中关键的限速酶之一,与植物的花色形成、抗虫、抗病等特性密切相关。本研究利用前期转录组测序及差异基因表达分析,筛选到与海岛棉抗枯萎病相关基因GbCHI,并从海岛棉抗病品种‘06-146’基因组中克隆了该基因的启动子,序列长度为2 062 bp。启动子分析软件Plant CARE预测GbCHI基因启动子序列除了含有启动子基本元件TATA-box和CAAT-box外,还包括与光照、激素、真菌诱导响应及参与黄酮类生物合成基因调控的MYB转录因子结合位点等顺式作用元件。通过瞬时转化烟草叶片的表达分析进一步表明:在MeJA、SA和枯萎病诱导下该启动子具有驱动GUS基因表达的特性。本研究结果可为后期开展GbCHI基因参与海岛棉抗枯萎病的调控机制研究奠定良好的理论基础。     

马铃薯R2R3-MYB转录因子的克隆及植物表达载体的构建

MYB转录因子家族是植物转录因子中最大的家族之一,广泛参与植物初生和次生代谢调控、细胞形态的建成、环境胁迫的应答等。前期转录组测序表明抗晚疫病的马铃薯材料加湘1号接种晚疫病菌后其MYB基因家族中的一个R2R3-MYB转录因子PGSC0003DMG400011243的表达量显著上调。为了探讨R2R3-MYB转录因子PGSC0003DMG400011243在马铃薯晚疫病抗病过程中发挥的作用。本研究通过PCR扩增了加湘1号中的该基因,并通过XcmⅠ酶切、连接将其装载到pCXSN载体上,构建了该基因的超表达载体pCXSN-JX-R2R3,并转化到农杆菌GV3101中。该研究为R2R3-MYB转录因子的基因转化及后续的功能分析提供了理论指导。     

油棕中果皮MYB转录因子家族的鉴定与表达分析

油棕(Elaeis guineensis Jacq.)是世界上最重要的油料作物之一,其中果皮含有的棕榈油极其丰富。MYB蛋白是一类广泛存在于真核生物中的转录因子,在植物的生长发育中发挥重要调控作用。本研究基于油棕中果皮转录组的测序结果为基础,利用生物信息学对油棕MYB基因家族进行全面鉴定,并对这些基因的结构、保守域和果实发育不同时期动态表达进行研究,解析油棕MYB转录因子在油棕发育过程中的生物学功能。结果发现,本研究中的38个油棕MYB转录因子,包含26个R2R3-MYB型和8个MYB-related型,以及2个3R-MYB型,不包含4R-MYB类型;MYB蛋白编码约200～700个氨基酸,等电点在4.5～9.5之间;亚细胞定位预测结果显示,所有MYB基因均定位于细胞核中;油棕MYB蛋白具有相似的保守基序组成,38个基因主要分布在13条染色体上,含有1到10个外显子数目;油棕MYB转录因子与多个物种的MYB转录因子具有序列同源性和进化亲缘性;表达模式分析发现,MYB家族基因存在差异表达,且具有几种不同的表达趋势。该研究结果为今后油棕MYB转录因子的脂类代谢途径研究以及功能和调控机制提供重要的研究基础。     

植物MYB蛋白与相应靶DNA结合位点间的相互作用

MYB转录因子家族是功能多样、数量众多的转录因子之一,参与调控植物发育、代谢和对逆境胁迫响应等多种生理过程。近些年研究人员一直致力于研究MYB转录因子的特点和功能分析,目前对转录因子和其靶DNA相互作用已有了解,但对于植物R2R3-MYB蛋白与它们的同源靶DNA相互作用的分子机制的理解并不完整。本文结合最新研究进展,综述了植物MYB转录因子家族的进化、生物学功能以及表达调控,并着重阐述了植物MYB蛋白与相应靶DNA间相互作用特性,为进一步分析功能未知的植物MYB转录因子提供了参考。     

一个新的棉花MYB类基因(GhTF1)的克隆及染色体定位分析

MYB类转录因子是指含有MYB结构域的一类转录因子,广泛参与植物发育和代谢调节。含2个MYB结构域的R2R3类MYB转录因子在植物体内主要参与次生代谢的调节和控制细胞的形态发生。从优质材料7235不同发育时期的棉纤维混合cDNA文库中克隆了一个棉花MYB转录因子基因GhTF1（GenBank登录号：EF651783）。该cDNA序列长1115bp,其开放读码框长度为771bp,编码256个氨基酸。表达特征分析表明,该基因在陆地棉7235不同组织中均表达,但表达量不同,特别在开花前1d,开花后8d和11d的纤维细胞中优势表达。该基因在二倍体棉种非洲棉和雷蒙德氏棉中开放读码框区的序列较保守,但在非编码区差异较大,在内含子区存在大片段插失和碱基替换现象。Southern杂交结果表明该基因在陆地棉基因组中存在2个拷贝,推测A、D亚组中各有1个拷贝。利用海7124和TM-1两亲本配置的BC1作图群体,将GhTF1定位在染色体10上。     

陆地棉基因GhMYB52的克隆及特征分析

【目的】克隆了1个在棉纤维发育次生壁加厚期优势表达的R2R3类MYB (v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog, MYB)转录因子基因Gh MYB52(Gh_A12G2460)。本研究旨在分析该MYB转录因子在陆地棉纤维次生壁发育过程中的作用。【方法】通过一步克隆法,从陆地棉遗传标准系TM-1中克隆了1个在纤维次生壁加厚期优势表达的R2R3类MYB转录因子基因Gh_A12G2460,进化树分析结果表明Gh_A12G2460与拟南芥中AtMYB52基因的相似度最高,因此将其命名为Gh MYB52。通过进化树构建、氨基酸序列多重比对、定量聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)、烟草瞬时转化、酵母双杂交等对其基因结构、编码产物的结构、表达特征、亚细胞定位以及互作蛋白进行了分析。【结果】GhMYB52基因的开放阅读框长672 bp,编码223个氨基酸残基,预测蛋白的相对分子质量为26.06 kDa,等电点为9.83。qRT-PCR结果表明,Gh MYB52基因在开花后15～25 d的棉纤维中优势表达。亚细胞定位结果显示,GhMYB52蛋白定位于细胞核,符合转录因子的特征。酵母转化结果显示,GhMYB52蛋白具有强烈的转录激活活性,并且与1个NAC类转录因子GhFSN1有强烈互作。【结论】GhMYB52是1个在棉花纤维次生壁加厚时期优势表达的R2R3类MYB转录因子,它可能通过与NAC类转录因子互作,形成蛋白复合物参与棉花纤维次生壁加厚过程。本研究为进一步从分子水平上验证GhMYB52基因在棉花纤维发育过程中的生物学功能奠定了基础。     

棉花GhMYB0基因的克隆、表达分析及功能鉴定

MYB类转录因子是植物转录因子最大的家族之一, 参与控制植物腺毛细胞的模式和形态建成。本研究利用雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii) D₅基因组数据库以AtMYB0 (GL1, NM_113708)蛋白为参比序列获得同源基因GrMYB0, 从徐州142中克隆了陆地棉的GhMYB0, 其开放阅读框长度为843 bp, 编码280个氨基酸。经过保守结构域分析和亚细胞定位确定GhMYB0为R2R3-MYB转录因子。qRT-PCR的结果表明, GhMYB0在徐州142开花当天开始高调表达, 开花后20 d表达量达高峰; 在所有的组织器官中, 花中表达量最高, 其次为胚珠。转基因功能分析结果表明, 在野生型拟南芥(Columbia)中过表达GhMYB0, 使其叶片表皮毛与野生型相比明显减少; 该基因在拟南芥突变体gl-1中过表达, 能恢复表皮毛缺失型突变体的表型, 说明该基因可能对拟南芥表皮毛的形态建成发挥一定作用, 本试验为研究R2R3-MYB转录因子在棉纤维起始和伸长过程中的调控作用提供有力证据。     

大豆转录因子GmMYB52的克隆、表达及结合功能分析

MYB类转录因子在植物的生长发育和逆境响应中有重要的调控作用。依据课题组前期获得的盐胁迫相关的数字表达谱(DGEP)数据,获得盐胁迫响应显著上调基因GmMYB52,利用RT-PCR方法从栽培大豆(Williams 82)中克隆该基因片段,并与已公布的Williams 82基因组数据库序列比对,该基因与GmMYB52序列一致。生物信息学分析表明,GmMYB52编码区(CDS)全长1083 bp,编码360个氨基酸。其编码的氨基酸序列具有MYB类转录因子的共同特征,其距N端110~160氨基酸残基处有MYB结构域;系统进化树分析表明,该基因编码的蛋白与GmMYB62、拟南芥AtMYBSt1、苜蓿Mt MYB52、水稻Os MYBS3及木豆Cc MYB-like protein J的亲缘关系最近;实时荧光定量PCR结果表明,大豆根部GmMYB52的转录水平受外界非生物逆境的调控,用脱落酸(ABA)和低温(4℃)处理后12 h明显上调,用氯化钠和PEG处理0.5~24.0 h后检测到GmMYB52的转录水平在50%~600%区间内呈现出先上调后下调再上调的趋势。GmMYB52为组成型表达,在大豆的幼苗期和开花期表达较多,在成熟期表达相对较低。GmMYB52在茎叶与开花期的花中表达较强,在根的表达较弱,而在成熟期的豆荚中几乎不表达。亚细胞定位的结果表明,GmMYB52定位于细胞核,符合典型转录因子的定位特征。酵母杂交系统检测表明,GmMYB52具有转录激活特征,并且能够与MYB相关顺式作用元件基序相结合。本研究结果表明,GmMYB52编码典型的MYB转录因子,具有转录激活活性及DNA结合活性,在大豆中的表达可能与大豆的非生物胁迫和ABA信号转导途径有关,推测其可能参与了大豆对非生物胁迫的响应。     

一个新的棉花MYB类基因(GhTF1)的克隆及染色体定位分析

MYB类转录因子是指含有MYB结构域的一类转录因子, 广泛参与植物发育和代谢调节。含2个MYB结构域的R2R3类MYB转录因子在植物体内主要参与次生代谢的调节和控制细胞的形态发生。从优质材料7235不同发育时期的棉纤维混合cDNA文库中克隆了一个棉花MYB转录因子基因GhTF1(GenBank登录号: EF651783)。该cDNA序列长1 115 bp, 其开放读码框长度为771 bp, 编码256个氨基酸。表达特征分析表明, 该基因在陆地棉7235不同组织中均表达, 但表达量不同, 特别在开花前1 d, 开花后8 d和11 d的纤维细胞中优势表达。该基因在二倍体棉种非洲棉和雷蒙德氏棉中开放读码框区的序列较保守, 但在非编码区差异较大, 在内含子区存在大片段插失和碱基替换现象。Southern杂交结果表明该基因在陆地棉基因组中存在2个拷贝, 推测A、D亚组中各有1个拷贝。利用海7124和TM-1两亲本配置的BC₁作图群体, 将GhTF1定位在染色体10上。     

玉米非生物逆境响应基因ZmASK1的克隆及表达特性分析

类Shaggy/GSK-3蛋白激酶基因在植物发育和逆境应答中起着十分重要的作用。通过RT-PCR方法从玉米中克隆了一个与Shaggy/GSK-3蛋白激酶基因同源的全长cDNA, 命名为ZmASK1(abiotic stress-induced kinase)(GenBank accession No., AY722707)。推测ZmASK1蛋白含有426个氨基酸, 分子量为48.5 kD, 等电点为8.7。半定量RT-PCR分析表明, ZmASK1可以被甘露醇、高盐和脱落酸(ABA)诱导。另外, 在不同的组织中, ZmASK1的表达模式也不一样, 在子房中的表达量最高。这些结果表明, ZmASK1可能在植物逆境反应及生殖生育过程中起多重作用。本文是玉米类Shaggy/GSK-3蛋白激酶基因参与胁迫和发育过程的首次报道。     

棉花中GhTFL1a和GhTFL1c基因的表达及启动子分析

从陆地棉中克隆了磷脂酰乙醇胺结合蛋白GhTFL1a和GhTFL1c基因,并对该基因进行表达分析、启动子预测和启动子活性研究。利用启动子分析软件PlantCARE预测得出,GhTFL1a启动子区域有脱落酸响应元件、干旱诱导的MYB结合位点和顶芽特异表达响应元件等;GhTFL1c启动子区域有乙烯响应元件、干旱诱导的MYB结合位点和水杨酸响应元件。因此,将pGhTFL1a和pGhTFL1c分别构建到启动子检测载体pBI121-GUS上形成融合表达载体,通过烟草瞬时转化检测得出这2个基因的启动子都具有活性。实时荧光定量PCR分析表明, GhTFL1a和GhTFL1c在光周期处理和不同材料的陆地棉(栽培种和半野生种)中表达模式呈相反趋势。GhTFL1a基因受脱落酸(abscisic acid, ABA)、水杨酸(salicylic acid, SA)和盐胁迫诱导,而GhTFL1c可以响应赤霉素(gibberellin, GA)、SA和ABA胁迫。研究结果初步表明,GhTFL1a和GhTFL1c可能参与了植物逆境胁迫脱落酸和水杨酸响应的调控,为在棉花中进一步阐明其功能奠定了基础。     

棉花酰基辅酶A结合蛋白(ACBP)家族基因的发掘及在非生物胁迫抗性中的功能鉴定

酰基辅酶A结合蛋白(ACBP)家族基因在植物正常生长发育、响应逆境胁迫及生物膜修复等方面具有重要作用。本研究基于陆地棉(Gossypium hirsutum)遗传标准系TM-1基因组序列信息,鉴定并获得21个棉花ACBP家族基因成员的全序列和染色体定位等信息。聚类分析表明这21个基因分属于I~IV类。依据与拟南芥的同源性,将棉花ACBP家族基因命名为GhACBP1~GhACBP6等6大亚类。转录组分析表明,该家族基因在不同组织、不同发育时期表达差异较大。不同逆境诱导分析表明,GhACBP1、GhACBP3和GhACBP6显著受盐、旱、低温、高温逆境胁迫诱导,而GhACBP4和GhACBP5对逆境胁迫响应不强烈。进一步分析表明,GhACBP3和GhACBP6的表达受过氧化氢(H2O2)、水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)、脱落酸(ABA)和乙烯(ET)的诱导。病毒诱导的基因沉默(VIGS)试验表明,沉默GhACBP3和GhACBP6亚类基因会降低棉花植株对干旱和盐的耐性。目标基因沉默后,植株干物质积累下降,株高变矮,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性降低,丙二醛(MDA)含量升高,表明GhACBP3和GhACBP6在棉花抗旱、耐盐中发挥作用。研究为利用ACBP家族基因进行棉花抗逆性研究及应用提供参考。     

小麦盐胁迫相关基因TaMYB32的克隆与分析

在对小麦全长cDNA克隆进行大规模测序及转录因子功能研究中,筛选到一个盐胁迫相关的MYB转录因子基因,将其命名为TaMYB32。TaMYB32的全长cDNA序列为1250 bp,开放阅读框为732 bp,编码一个具有244个氨基酸的R2R3-MYB转录因子。根据该基因的cDNA序列设计引物,分别在小麦二倍体祖先种乌拉尔图小麦UR206、拟斯卑尔脱山羊草Y2006和粗山羊草Y2282以及六倍体普通小麦中国春和茶淀红中克隆了TaMYB32的基因组和cDNA序列。序列分析表明TaMYB32在小麦二倍体祖先种中存在2种序列,在六倍体小麦中存在4种序列,其中1种序列在进化上非常保守,在二倍体和六倍体中完全相同。对TaMYB32的基因组和cDNA序列比较分析表明它是一个没有内含子的基因。电子定位发现TaMYB32在小麦第六同源群上,每个基因组中有2个拷贝,这与测序结果相吻合。同源序列分析发现,TaMYB32与来自水稻和玉米中的MYB蛋白的相似性分别为72.4 %和73.7%。组织表达特性分析表明该基因在小麦根、茎、叶、雌蕊和花药中均有较强的表达。半定量与实时定量RT-PCR结果表明TaMYB32是一个受盐胁迫诱导表达的基因。     

转Bt基因抗虫棉和有色棉苗期耐盐性差异研究

盐胁迫可致棉叶萎焉 ,叶温升高 ,气孔导度、蒸腾强度和光合速率降低 ,促进膜脂过氧化、丙二醛 (MDA)积累。但棉株体通过保护酶活性的提高和协同作用 ,以及盐离子的区域化分布 ,表现出较强耐盐胁迫的能力。耐盐性因基因型而异 ,在供试材料中 ,棕色棉和绿色棉的耐盐性最强 ,转 Bt基因抗虫棉 3 3 B和 S6 1 77的耐盐性最差。基因型间耐盐性差异与保护酶活性和盐离子在叶片中积累量的差异有关。长期人为选择可致棉花抗逆性的部分丢失 ,Bt基因的导入也可能影响棉花耐盐性的表达。     

玉米非生物逆境响应基因ZmASK1的克隆及表达特性分析

类Shaggy/GSK-3蛋白激酶基因在植物发育和逆境应答中起着十分重要的作用。通过RT-PCR方法从玉米中克隆了一个与Shaggy/GSK-3蛋白激酶基因同源的全长cDNA, 命名为ZmASK1(abiotic stress-induced kinase)(GenBank accession No., AY722707)。推测ZmASK1蛋白含有426个氨基酸, 分子量为48.5 kD, 等电点为8.7。半定量RT-PCR分析表明, ZmASK1可以被甘露醇、高盐和脱落酸(ABA)诱导。另外, 在不同的组织中, ZmASK1的表达模式也不一样, 在子房中的表达量最高。这些结果表明, ZmASK1可能在植物逆境反应及生殖生育过程中起多重作用。本文是玉米类Shaggy/GSK-3蛋白激酶基因参与胁迫和发育过程的首次报道。