RT—PCR和核酸探针在IBV检测中的应用

用ＰＣＲ和核酸探针杂交检测了３种毒株在鸡胚中的繁殖动态及人工感染鸡和自然感鸡气管粘液及肾组织内的ＩＢＶ,结果表明：在胚鸡中繁殖３种毒株ＩＢＶ（Ｈ１２０,ＨＫ,Ｍ４１）及,ＰＣＲ最早检出时间２０－２４ｈ,克隆探针最早检出时间为２４－３０ｈ;用克隆核酸探针检测人工感染鸡,１２ｈ后能从肾脏中检出病毒。对７只就诊鸡的病变肾脏进行杂交检测和ＰＣＲ扩增,有５中均呈阳性反就     

鸡传染性支气管炎病毒地高辛标记探针检测方法的的建立和应用

根据GenBank中已经发表的IBV N基因的保守序列,设计合成一对引物,利用RT-PCR技术扩增IBVN基因的582 bp的核酸片段,并制备出地高辛标记的IBV核酸探针。特异性检测结果表明,该探针能与不同毒株的IBV核酸发生特异性杂交,而与对照的NDV、鹅副粘病毒的核酸杂交反应为阴性;敏感性检测结果表明,该探针对IBV的最低检出量为10 pg,显示所制备的核酸探针用于IBV的检测是可行的。     

RT-PCR和Digoxigenin标记的核酸探针检测鸡传染性支气管炎病毒试验研究

用２对已发表的引物和１对自行设计的引物对同一ＩＢＶＨ１２０株进行ＲＴ－ＰＣＲ，分别获得了Ｓ１基因上与引物设计相一致的１７２０ｂｐ，２２８ｂｐ，６０２ｂｐ，的扩增片段。用自行设计的引物对７个毒株（Ｈ１２０，Ｈ５２，Ｍ４１，Ｃｏｎｎ，Ｇｒａｙ，Ｔ，Ｈｏｌｔｅ）和５个分离株（宜毒，上毒，云毒，ＨＫ，１１８）的含毒尿囊液或纯化病毒进行ＲＴ－ＰＣＲ。结果除Ｈｏｌｔｅ株，２个分离株（宜毒，云毒）外，其余均被成功地扩增出６０２ｂｐ的片段。将ＩＢＶＨ１２０株０６ｋｂＰＣＲ产物用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记为探针，分别与上述各ＩＢＶ毒株的核酸及其扩增产物进行核酸杂交，均呈现阳性反应，而该探针不与ＩＢＤＶ和ＮＤＶ的ＤＮＡ，ＥＤＳ－７６病毒的ＤＮＡ及正常鸡胚尿囊液抽提物反应。ＲＴ－ＰＣＲ和核酸杂交技术提供了直接从尿囊液中快速检测出病毒，作为诊断ＩＢＶ的新方法。     

鸡传染性支气管炎病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank上发表的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)基因序列,针对IBVM基因全序列设计合成了一对引物,以IBV疫苗株为模板,建立了检测IBV的RT-PCR方法.应用该方法对IBV疫苗株RNA进行扩增,获得与预期大小相符,长度为1105 bp的特异性目的片段;敏感性测定该RT-PCR可扩增到18pg的IBV-M-cDNA.结果表明建立的RT-PCR方法对IBV的检测敏感性高、特异性强,可用于IBV感染的诊断和流行病学调查.     

用光敏生物素标记鸡传染性支气管炎病毒cDNA探针及其应用的研究

应用光敏生物素标记鸡传染性支气管炎病毒ｃＤＮＡ，制备核酸探针、经斑点杂交法和碱性磷酸酶显色后，探针同以ｃＤＮＡ为模板合成的ＰＣＲ产物及其重组子ｐＳＸＩＢＶＳ１均呈现强阳性的蓝色斑点，而与正常尿囊液、新城疫病毒和鸡败血霉形体无杂交。一个初诊为ＩＢ感染的田间病料与探针杂交阳性结果相符合。试验表明该ｃＤＮＡ探针是敏感和特异的检测方法。     

地高辛标记探针检测鼻气管鸟杆菌的研究与应用

【目的】建立鼻气管鸟杆菌(Ornithobacteriumrhinotracheale,ORT)快速、准确的检测方法。【方法】利用PCR扩增鼻气管鸟杆菌16 S rRNA基因的671 bp特异性片段,经回收纯化后用地高辛标记,建立了地高辛标记探针诊断ORT的方法。【结果】特异性试验表明,地高辛标记探针可与ORT不同血清型参考菌株的核酸发生特异性杂交,而与鸡大肠杆菌、副鸡嗜血杆菌、鸡白痢沙门氏菌、禽多杀性巴氏杆菌的核酸杂交均为阴性;敏感性试验结果表明,地高辛标记探针对ORT的最低检出量为100 pg/μL;利用该探针对分离菌株和疑似病料进行检测,结果均与PCR检测结果一致。【结论】建立了地高辛标记探针检测ORT的方法,为ORT的诊断提供了一种敏感性高、特异性强、简便且易行的方法。     

IBV地方分离株致病原性和血清学分型的比较

将６株分离自国内不同地方的ＩＢＶ流行株分别感梁ＳＰＦ鸡，对气管和肾桩进行系统病理观察，发现６株ＩＢＶ在至于致病原性和组织嗜性上存在显著差异，其中ＱＤ可引起严重的呼吸道损伤，并伴有相对较轻的肾脏损伤，其余５株对肾脏损伤较为严重地呼吸道损伤相对温和。用气管环组织培养交叉中和实验（ＳＮ）和ＳＡＳ软件对６株分离毒进行血清学分型研究，结果显示ＱＤ株属于Ｍ型，ＺＺ、ＧＺ属于Ｔ型，而ＴＪ、ＤＬ和ＹＣ株是不同于Ｍ     

鸡ILV、IBV、NDV和AIV多重RT-PCR检测方法的初步建立

初步建立了鸡传染性喉气管炎(IL)、鸡传染性支气管炎(IB)、新城疫(ND)和禽流感(AI)的多重RT- PCR鉴别诊断方法,并对其特异性和敏感性进行了检测。结果表明,所设计的4对引物可对同一样品中的ILV、IBV、NDV和AIV进行特异性扩增,所扩增的目的片断的长度分别为620 bp(ILV)、445 bp(IBV)、344 bp(NDV)和240 bp (AIV);建立的RT-PCR检测方法能够检测出10 pg AIV、1 ng NDV和10 ng IBV的RNA及100 pg ILV的DNA,说明该检测方法特异性强,敏感性较高。本研究所建立的多重RT-PCR方法可用于上述鸡4种病毒性呼吸道疾病的快速鉴别诊断,在临床诊断和流行病学调查方面具有较好的应用前景。     

地高辛标记探针检测蓝舌病病毒方法的研究

采用３种不同的方法变性处理蓝舌病病毒ＢＴＶ１６ＲＮＡ，与ＤＩＧ标记的ＢＴＶ１６ＶＰ７基因制备的探针经斑点杂交和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交。试验表明，ＤＭＳＯ变性处理的核酸杂交后探针的灵敏度最高。其余两种方法次之     

鸡传染性支气管炎病毒荧光定量PCR标准曲线的建立

笔者针对传染性支气管炎病毒（IBV）M41株中编码核衣壳蛋白的N基因设计并合成一对引物,通过构建重组阳性标准质粒的方法,成功建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法检测IBV的标准曲线。该方法所建立的曲线可检测到初始模板中5×10^2copies／μL的病毒核酸,与常规PCR相比敏感性大大提高。笔者建立的荧光定量PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,可用于传染性支气管炎的临床诊断和健康带毒鸡群的检测。     

鸡传染性支气管炎病毒核衣壳蛋白基因的克隆、表达及应用

核衣壳蛋白(N)是鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的重要结构蛋白。根据已报道的IBV基因序列扩增IBVN基因,割胶回收扩增产物并将其克隆到pET-28a( )载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,目的蛋白得到高效表达。分离纯化重组N蛋白并用其作为抗原建立ELISA检测抗体方法,研究了IBVM41攻毒后雏鸡血清特异性抗体消涨规律。     

银加强金标免疫技术在鸡传染性支气管炎病毒检测中的应用

采用胶体金标记纯化的羊抗鼠IgG,建立了一种对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)进行检测的银加强金标免疫技术(SECGA).先将抗原点样于硝酸纤维素膜(NCM)中央,封闭后浸于40×稀释的IBV单抗中作用10min,洗涤后再浸于体积比为1:4稀释的金标羊抗鼠IgG溶液中作用1h,银染10min后观察,在膜上出现灰黑斑点的为阳性结果,反之,不出现斑点为阴性结果.SECGA对IB抗原最低测量值为0.703ng·点-1(约2μL),对含毒尿囊液的最低检测为102..9EID50.结果表明,IB VM41毒株在鸡胚中繁殖时以36～54h检测含毒量最高;SPF鸡感染3d后可从气管粘液中检出病毒.SECGA检测抗原可用于IBV早期检测,具有群特异性,快速、敏感、简便,不需特殊设备,结果易判定等优点,尤适于基层实验室或现场应用.     

鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体的制备及鉴定

用纯化的鸡传染性支气管炎病毒免疫BALB／c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞Ag8．653融合。对杂交瘤细胞及时筛选,阳性孔经3次有限稀释法克隆,成功获得3株能稳定传代并分泌抗鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1F4F7D9、3E9G3D4、48883F8。通过间接ELISA、血凝抑制以及琼脂糖扩散等方法检测,3株单克隆抗体的腹水间接ELISA效价达10^6以上并且具有良好的特异性。     

E Protein Prokaryotic Expression of Avian Infectious Bronchitis Virus

The small envelope protein （E） gene of avian infectious bronchitis virus （IBV） M41 strain was cloned, and then it was subcloned into prokaryotic expressing vector pGEX-6P-1. The recombinant plasmid was transformed into E.coli. BL21 and induced by IPTG. SDS-PAGE result showed that when objective protein fused with GST （about 20 ku）, the relative molecular mass of fusion protein was 38 ku. It indicated that objective protein was about 12.4 ku. The result showed that E protein was expressed successfully, it was useful to the subsequent E protein research.     

斑点免疫金检测鸡传染性支气管炎病毒的研究

通过胶体金标记提纯后的兔抗ＩＢＶＩｇＧ，建立了一种以微孔滤膜为固相载体，以红色胶体金为标记物，检测鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）的斑点免疫金测定法（ＤＩＧＦＡ）。ＤＩＧＦＡ对ＩＢＶ的最小检出量为２０．３×１０￣（－８）ｇ，在１０份自然病例样品中检出８份。鸡胚培养法以育传３～５代，出现侏儒胚者为阳性，从上述样品中检出６份。对接种ＩＢＶ的鸡胚尿囊液，ＤＩＧＦＡ法检出率为１００％。实验结果表明，ＤＩＧＦＡ法对鸡传染性支气管炎的早期诊断具有简便、灵敏、快速、特异性强和重复性好等优点。     

抗鸡传染性支气管炎病毒单链抗体间接ELISA筛选方法的建立

建立一种筛选特异性单链抗体的间接ELISA优化方法.用鸡传染性支气管炎病毒IBV-M41株接种SPF鸡胚,纯化后作为抗原包被96孔板进行间接ELISA,从本实验室构建的原核表达质粒pOPE101-XPscFv/JM109(DE3)中筛选出针对IBV-M41株的scFv,并对各反应参数进行探索,优化筛选方法.通过敏感性实...     

RT- PCR检测鸡传染性支气管炎病毒方法的建立

根据Genbank中鸡传染性支气管炎病毒(IBV)核蛋白(NP)基因序列,设计了1对引物,通过鸡胚繁殖IBV,纯化鸡胚尿囊液中的IBV,提取病毒RNA,建立了检测传染性支气管炎病毒的RT-PCR方法。对IBV各毒株(M41,H52,H120,Aust-T以及野毒株等)检测,结果均为阳性,而对鸡的其他病毒性疾病病毒(IBDV,AIV,NDV)进行检测,结果均为阴性。初步结果表明所建立的RT-PCR技术可用于鸡传染性支气管炎病毒各血清型毒株的检测。