奶山羊超长链脂肪酸延伸酶6基因(ELOVL6)的克隆及其对4个脂肪酸代谢基因表达水平的影响

超长链脂肪酸延伸酶6(elongase of very long chain fatty acids 6,ELOVL6)是长链脂肪酸延长反应的限速酶。本研究旨在通过对奶山羊(Capra hircus)ELOVL6基因的克隆、组织表达分析以及腺病毒(Adenovirus)介导的超表达技术,研究该基因超表达后对乳腺上皮细胞中脂肪酸代谢相关基因的影响。利用RT-PCR技术克隆了奶山羊ELOVL6基因的CDS区;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测该基因在泌乳期奶山羊10个组织中的相对表达量;构建该基因的重组腺病毒超表达载体,包装出高滴度的腺病毒并感染奶山羊原代乳腺上皮细胞,qRT-PCR检测ELOVL6超表达效果及其对脂肪酸代谢相关基因的影响。结果表明,ELOVL6基因CDS区序列长度为795 bp(GenBank登录号:KF667508),共编码264个氨基酸。同源分析发现,奶山羊ELOVL6基因CDS区核酸序列与牛(Bos taurus)、大鼠(Rattus norvegicus)和人(Homo sapiens)的同源性分别为97%、90%和93%,氨基酸序列同源性分别为99%、92%、95%。利用TMpred对ELOVL6蛋白跨膜结构预测分析,发现该蛋白有5个跨膜区,保守的组氨酸模体(HXXHH)位于ELOVL6蛋白的第二与第三跨膜螺旋间。ELOVL6蛋白质疏水性预测显示,该蛋白总体具有较强的疏水性。组织表达分析显示,ELOVL6基因在脂肪组织中表达量最高(P0.01),小肠次之(P0.01),心脏中表达量最低。超表达ELOVL6基因的重组腺病毒的滴度为108U/mL,病毒液感染原代乳腺上皮细胞48 h后,ELOVL6基因的表达量上升约200倍;脂肪酸代谢相关基因检测分析发现,固醇调节元件结合蛋白-1基因(SREBP-1)的表达量显著下降(P0.05),脂肪分化相关蛋白基因(ADRP)的表达量显著升高(P0.05),过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因(PPARγ)及脂肪酸转位酶基因(CD36)的表达量无明显变化。研究结果表明,ELOVL6基因可以影响奶山羊乳腺上皮细胞脂肪酸代谢相关基因的表达,对乳腺脂肪酸代谢具有一定的调控作用。本研究为ELOVL6基因在奶山羊乳腺脂肪酸代谢调控中的功能研究提供研究依据。     

绵羊APOA4基因的生物信息学分析

为进一步探索绵羊APOA4基因及其编码蛋白的生物学功能，给APOA4基因与绵羊健康和生长发育的关系提供依据，以绵羊载脂蛋白A-IV(Apolipoprotein A-IV，APOA4)基因为研究对象，采用生物信息学数据库及分析软件进行生物信息学分析，预测绵羊APOA4基因基本结构、理化特性和生物学特征。结果显示，绵羊APOA4基因ORF编码380个氨基酸残基，编码蛋白为不稳定亲水蛋白，存在信号肽，不存在跨膜结构，为分泌性蛋白，主要在细胞外发挥生物学作用，二级结构和三级结构均以α-螺旋为主。绵羊APOA4基因编码蛋白与山羊和牛的同源性最高。     

绵羊RPS20基因的生物信息学分析

核糖体蛋白20基因(ribosomal proteinS20，RPS20)是一类参与蛋白质生物合成及对细胞增殖、分裂、分化、凋亡具有调控作用的基因，广泛存在于多种动物体内。为探究RPS20基因在绵羊体内的功能，运用生物信息学数据库及其软件分析了该基因及其编码的产物。结果发现，绵羊RPS20基因总共编码了119个氨基酸残基，所编码的蛋白质分子式为C587H995N173O171S5，分子质量为13.372 71 KDa，等电点pI为9.95。通过基本理化性质的分析可知，绵羊RPS20蛋白是稳定性强、具亲水性的非分泌蛋白，不含信号肽序列且无跨膜结构。亚细胞定位结果表明，其编码产物主要存在于细胞质中(65.2%)。绵羊与牛、马、黑猩猩、野生双峰驼等哺乳动物的RPS20蛋白相似度均为100%。该蛋白的二级结构和三级结构主要以无规卷曲、α螺旋和β折叠组成。     

绵羊ANO5基因的生物信息学分析

作为Anoctamin蛋白家族的第五个成员,ANO5基因主要在绵羊肌肉再生、肌母细胞融合和肌细胞膜修复中发挥作用。为探究ANO5基因在绵羊体内的功能,本研究利用生物信息学软件分析了绵羊ANO5基因及其编码产物的结构与功能。结果显示:绵羊ANO5基因含有一个最大长度为3 351 bp的开放阅读框,推测其编码1116个氨基酸残基。该基因编码蛋白的分子式为C5897H9014N1546O1668S42,分子质量为129 602.32 Da,理论等电点为7.24,估计半衰期为30 h,不稳定指数为49.71,脂肪族氨基酸指数为79.43。绵羊ANO5蛋白位于质膜的可能性最大(56.5%),不含信号肽,具有8段跨膜区,属于不稳定亲水性跨膜蛋白。二级结构以无规卷曲(68.43%)为主,三级结构主要由无规卷曲缠绕折叠形成。     

绵羊MXD3基因的生物信息学分析

MAX二聚化蛋白3(MAX dimerization protein 3, MXD3)在肿瘤的增殖、凋亡、侵袭和转移过程中起重要作用,广泛存在于多种动物体内。为探究MXD3基因在绵羊体内的功能,运用生物信息学数据库及其软件,分析了该基因及其编码的产物。结果发现,绵羊MXD3基因总共编码了206个氨基酸残基,所编码的蛋白质分子式为C1000H1650N332O315S6,分子质量为23 556.50 KDa,理论等电点pI为9.32,半衰期为30 h,不稳定指数为88.30。通过基本理化性质分析可知,绵羊MXD3主要在细胞核发挥作用,不属于分泌蛋白,不存在信号肽序列,不存在跨膜结构,是亲水性蛋白。该蛋白的二级结构主要是以无规卷曲、α螺旋组成,而三级结构预测结果与二级结构相符。     

绵羊HSPA1L基因的生物信息学分析

为了解绵羊热休克蛋白1L (heat shock protein family A member 1 like，HSPA1L) 基因及其编码产物的基本结构和生物学特征，给绵羊的抗热应激和免疫等方面的研究提供依据，利用生物信息学数据库及软件对绵羊HSPA1L基因进行生物信息学分析。结果表明，该基因最大长度的ORF有1 926 bp，编码641个氨基酸序列。其编码的蛋白质分子式为C3094H4985N859O969S20，理论等电点为5.89，不稳定指数为32.56。该蛋白无信号肽和跨膜结构，为非分泌性蛋白，主要在细胞质中发挥生物学作用。无规则卷曲是构成该蛋白二级结构和三级结构的主要方式。     

甜高粱SUT1基因克隆、表达及生物信息学分析

为获知甜高粱蔗糖转运蛋白基因SUT1及其功能,采用同源克隆方法结合RACE技术克隆甜高粱SUT1基因,并对其进行生物信息学分析。克隆得到甜高粱蔗糖转运蛋白基因SUT1 c DNA全长为2 472bp,包括1 560bp编码区序列,编码含有519个氨基酸的蛋白。该蛋白是1个疏水性膜蛋白,分子量约为55k Da,理论等电点p I为8.86;无信号肽剪切位点,含有12个明显的跨膜螺旋拓扑结构,预测含有6个丝氨酸激酶磷酸化位点、4个苏氨酸激酶磷酸化位点和2个酪氨酸激酶磷酸化位点;包含1段低复杂度序列和12个保守的跨膜螺旋结构域。在亚细胞水平,SUT1主要定位于叶绿体类囊体膜、质膜、高尔基体及内质网膜上;二级结构主要以α-螺旋为主,其中α-螺旋占43.35%,无规则卷曲占34.68%,延伸链占19.08%,β-转角占2.89%;预测SUT1蛋白主要在运载结合中发挥重要作用。SUT1基因表达分析结果表明,SUT1基因在各组织中均有表达,叶中表达量最高,其次分别为叶鞘、茎和根,穗中表达量最低。SUT1基因的克隆及其结构、性质与功能的初步分析,可为研究该基因在甜高粱源库互作关系中的功能机制奠定基础。     

绵羊C3d基因克隆及分子特征

本实验首次从绵羊肝脏组织克隆到了补体C3d的基因并对其核苷酸序列和推导的氨基酸序列以及蛋白结构进行了分析。绵羊补体C3d基因的编码区含有909个核苷酸,编码303个氨基酸残基,绵羊与人、牛、山羊、野猪、金仓鼠、小鼠、褐鼠、大袋鼠、兔和原鸡推导出的氨基酸序列的一致性分别为80.4% ,94.7% ,96.9% ,82.8% ,81.1% ,80.6% ,80.2%,71.0% ,75.2%和60.3%。高等动物中,绵羊与原鸡的一致性最低为60.3%,而与其他动物之间的一致性则较高为71.0%-96.9%。通过生物学软件分析发现绵羊C3d蛋白有2个蛋白激酶C磷酸化位点,1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,1个酪氨酸激酶磷酸化位点,1个十四(烷)酰化位点。绵羊C3d二级结构中螺旋和转角交替出现,其中α-螺旋占55.12%、β-折叠为2.31%,转角区域为42.57%,这样的结构有利于其桶状结构的形成。通过ESyPred3D同源建模预测可知绵羊C3d三级结构与人C3d一样也形成由核心和外层构成的桶状分子结构。本实验不仅为C3d在家畜上的免疫学基础研究提供实验依据,而且为构建高免疫原性的基因疫苗新技术奠定基础。     

菌寄生真菌黄蓝状菌(Talaromyces flavus)几丁质酶基因的克隆与生物信息学分析

菌寄生真菌的几丁质酶有很强的降解几丁质能力,在控制植物病害方面起着重要的作用.为克隆和研究菌寄生真菌黄蓝状菌(Talaromyces flavus)几丁质酶基因(tfchi1),本研究根据真菌几丁质酶基因的保守序列设计扩增基因中间片段的简并引物,采用RT-PCR、3'-RACE及5+-TAIL的方法获得了该基因的DNA和mRNA序列(GenBank:GU361769,GU361770).tfchi1长为2 561 bp,具有6个内含子,长度分别为129、78、68、65、53和59 bp,包含1 194bp的ORF,编码一个由397个氨基酸组成的蛋白.推导的tfchi1氨基酸序列以及蛋白质结构生物信息学分析表明,该蛋白具有典型的几丁质酶催化区保守序列SXGGW和DGXDXDWE,属于糖苷水解酶18家族几丁质酶,与柄篮状菌(Talaromyces stipitatus ATCC 10500)几丁质酶(XP_002480365)氨基酸序列同源性为96％,分子量为43.47kD,等电点为4.97.该蛋白无信号肽序列,有15个潜在的N-糖基化位点,Tfchi1的二级结构以无规卷曲和α-螺旋为蛋白的主要结构元件,三级结构中有(α/β)8的圆桶形结构.tfchi1转化毕赤酵母(Pichia pastoris )GS 115,酵母工程菌可分泌具几丁质酶活性的表达产物,重组蛋白的分子量与理论值相符.结果说明,本研究已从T.flavus中正确克隆了1个糖苷水解酶18家族几丁质酶基因.     

小麦蓝矮病植原体溶血素基因的分离及蛋白结构功能预测

从小麦蓝矮病(WBD)植原体基因组中分离出溶血素基因,大小为1 266 bp,编码421个氨基酸(GenBank登录号:EU747230).用生物信息学方法预测该蛋白在植原体侵染寄主过程中的致病作用.结果表明.该蛋白的二级结构中主要是螺旋,其次为折叠和无规则卷曲,不含转角,三级结构中含有三个功能区:DUF21(跨膜区结构域),CBS-pair-CorC-HlyC(双胱硫醚夂铣擅附峁褂和CorC-HlyC(转运体相关结构域).推测WBD的溶血素蛋白是具N端前导序列的N-末端跨膜蛋白,可能通过DUF21结构域中的跨膜螺旋与寄主细胞相互作用,由CBS结构域获得寄主的ATP,经CorC-Hlyc结构域转运,从而改变寄主体内ATP/ADP的浓度平衡而引发病害症状.