大豆Usp1基因的克隆和表达分析

在对大豆根系盐胁迫抑制差减杂交文库EST序列分析的基础上,利用RT-PCR技术克隆得到了一个大豆Us-pA基因,命名为GmUsp1,其编码一个包含164个氨基酸残基的多肽链。多序列比对和编码蛋白结构分析表明,GmUsp1属于泛应激蛋白(Universal Stress Protein)家族成员之一。其氨基酸序列与蚕豆Vf_enod18序列相似度最高,属于MJ-0577类中含有ATP结合位点的UspA亚族,与MJ-0577有相似的蛋白二级结构。分别采用250 mmol.L-1NaCl、100μmol.L-1ABA和30%PEG 6000进行胁迫处理,耐盐品种文丰7号和盐敏感品种Union的GmUsp1均被诱导表达,二者对胁迫诱导响应时间和表达量存在差异,说明GmUsp1可能参与大豆对非生物逆境胁迫的应答调控。     

大豆脱氢抗坏血酸还原酶基因的电子克隆及进化分析

利用生物信息学和实验验证的技术路线,以拟南芥脱氢抗坏血酸还原酶基因cDNA序列为信息探针,对大豆EST数据库进行同源搜索,经同源性比对和序列组装,获得全长为955bp的大豆脱氢抗坏血酸还原酶基因的cDNA序列(GenBank登录号为DQ006810),经RT-PCR扩增,分子克隆和序列分析验证,结果表明与电子克隆完全一致.该cDNA序列具有完整的开放阅读框架(ORF,36bp-815bp),推测编码蛋白为259个氨基酸.通过与几种植物脱氢抗坏血酸还原酶蛋白序列的比较,发现该基因具有较高的保守性.结果表明根据物种问同源基因序列,对跨物种问EST数据库进行同源检索筛选,拼接,是新基因克隆的一条有效途径.     

西藏青稞品种喜玛拉雅10号干旱胁迫的SSH文库构建及干旱诱导表达基因分析

为了研究西藏青稞抗旱的分子机制,以西藏耐旱青稞(Hordeum vulgare L.var.nudum HK.f.)品种喜玛拉雅10号为材料,利用抑制性差减杂交技术(SSH)构建青稞苗期叶片干旱胁迫诱导基因表达的正向差减文库。挑取600个阳性克隆进行PCR验证,并对验证后的单克隆进行测序分析,共获得420个有效序列。去除冗余序列和嵌合序列后,获得220条高质量EST序列,其中183条singlets,37条contigs。BlastN分析表明,其中189个EST序列可以在GenBank的unigene中找到同源序列,31个未能找到unigene同源序列;BlastX分析表明,62个EST序列unigene与未知功能蛋白或假定蛋白有较高的相似性;158条EST序列与已知功能蛋白有较高的同源性。获得的EST序列多数不仅与植物的非生物胁迫相关,也与植物的生物胁迫反应相关,说明植物在胁迫反应中有明显的共同机制。其中与大麦表达序列高度同源的EST占58%;这些基因涉及参与信号转导和转录调节的基因(11.96%),编码保护、防御和胁迫耐受蛋白的基因(9.78%),跨膜转运相关基因(5.43%),光合作用基因(6.52%),参与结构和功能代谢合成途径中的一些酶(30.43%)等代谢过程。实验结果表明,青稞在干旱复水条件下可诱导一系列特异基因的表达,如参与抗旱反应相关酶和蛋白基因锌指蛋白、衰老相关蛋白、CAS、细胞色素P450、热激蛋白、胁迫诱导蛋白,以及LEA蛋白、脱水蛋白、P5CS等保护蛋白基因。用KOBAS系统将56个EST定位到32个Pathways中,初步分析发现,谷氨酸盐代谢途径(Glutamate metabolism)、精氨酸和脯氨酸代谢途径(Arginine and proline metabolism)、泛素蛋白介导的蛋白质水解代谢(Ubiquitin mediated proteolysis)途径可能与青稞抗旱相关性较大。     

拟南芥AtTrx5增强植物菌核病的抗性研究

核盘菌是危害十字花科作物生产的重要病原菌。核盘菌诱导寄主产生过量活性氧（ROS），造成寄主细胞死亡，硫氧还蛋白（Trx）在寄主抗氧化过程中起重要作用。筛选并鉴定硫氧还蛋白（Trx），分析其与核盘菌抗性的关系，将为植物抗菌核病育种提供基因资源。本研究通过生物信息学及转录组数据分析，从拟南芥中筛选到一个关键Trx基因AtTrx5。AtTrx5与甘蓝型油菜BnaA08g04320D的亲缘关系最近，氨基酸相似性为85%。油菜同源基因Trx5表现出上调表达。AtTrx5超表达植株在接种核盘菌24 h后的菌斑面积相比野生型（WT）减小30%～39%，而AtTrx5基因T-DNA突变体的菌斑面积比WT增加39.2%。在侵染过程中超表达转基因拟南芥中AtTrx5的表达量均高于WT，而T-DNA突变体中AtTrx5的表达量则低于WT。DAB染色、H2O2含量、·O2-含量测定结果表明，侵染过程中拟南芥T-DNA突变体中积累的ROS高于WT，超表达转基因拟南芥中积累的ROS少于WT。     

大豆Glyma.05G222700.2基因生物信息学与逆境表达分析

为研究Glyma.05G222700.2基因编码的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶在抗非生物胁迫过程的功能和原理,促进大豆抗逆候选基因的开发利用,本研究通过生物信息学方法对大豆Glyma.05G222700.2基因进行同源序列、蛋白结构、进化树和转录组分析,通过qRT-PCR分析盐胁迫下大豆不同组织中该基因的表达情况。结果表明:该基因编码区长2 040 bp,编码697个氨基酸,预测分子量为656.54 kD,pI8.026。多序列比对发现Glyma.05G222700.2蛋白包含1个Pkinase结构域。进化树分析表明该蛋白与野大豆、刺毛黧豆、赤豆一致性较高。转录组数据表明Glyma.05G222700.2基因在大豆各组织中均有表达,其中在种子中表达量最高,在根中表达量最低。qRT-PCR结果发现Glyma.05G222700.2基因在毛状根、茎、叶中均有表达,在茎中表达量最高,在叶中表达量最低;在毛状根中盐胁迫12 h表达量达到极值,盐胁迫24 h表达量下降;在茎中表达量呈上升趋势,在24 h表达量达到极值;在叶中表达量不稳定,盐胁迫2 h该基因不表达,盐胁迫6 h该基因表达量达到极值并高于对照,盐胁迫12和24 h表达量低于对照。推断该基因可能在大豆抵抗盐胁迫过程中起到重要作用。     

大豆EST序列长度与SSR特性的关系

为了分析大豆EST-SSR的特征和比较其不同长度EST序列中的SSR特性,从NCBI下载了大豆EST序列,应用SSRIT搜索SSR,分析了20 183个无冗余的EST序列,发现了1747个EST序列(8.66%)含有SSR,长度超过400 bp的EST序列含SSR的比例为10.05%,而长度在400 bp以下的EST序列SSR的比例为4.74%.二核苷酸和三核苷酸SSR是大豆EST-SSR的主要类型,分别的60.45%和37.04%,最常见的SSR基元是:AT、AG、AAT、AC、AAG、ACG.在1798个EST-SSR中,51.45%的长度大于12 hp,13.35%长度大于20 hp.推断NCBI大豆EST数据库中含有12 3527个SSR,大豆EST-SSR可用于大豆分子标记,具有重要的开发价值,为有针对性设计EST-SSR引物奠定基础.     

核糖体基因GmRPL12对大豆低硫耐性的调控作用研究

为研究大豆中核糖体基因对大豆耐低硫胁迫功能的调控作用,从科丰1号根中克隆1个大豆核糖体蛋白编码基因GmRPL12。分析基因结构和低硫胁迫下不同组织中的表达情况,将基因过表达载体和干扰载体转化科丰1号毛状根,获得转基因嵌合体,并进行基因表达分析和植株表型分析。序列分析结果表明:基因编码区全长576 bp,预测蛋白C端包含1个核糖体蛋白L7/L12保守结构域RPL12。该基因在根中表达量较高,表达水平受低硫诱导,不同品种中该基因对低硫响应的模式不同。通过毛状根遗传转化获得GmRPL12基因过表达、RNA干扰以及空载体对照的大豆嵌合体。低硫处理与正常硫水平处理相比,GmRPL12基因过表达的大豆嵌合体植株倒一叶和倒二叶SPAD、株高、地上部鲜重和干重、地下部鲜重和干重显著增加,RNA干扰下调大豆嵌合体植株的以上指标。GmRPL12基因的过量表达能显著增加低硫处理时地上部、地下部的无机硫含量,以及正常硫水平处理时地上部的无机硫含量。研究结果暗示GmRPL12基因可能参与大豆对低硫耐性和大豆硫代谢的调控。     

过表达GmNHX1基因提高大豆根系的耐盐性

Na+/H+反向转运蛋白可调控细胞质pH值、钠离子浓度和细胞体积,从而减轻盐胁迫对植物的伤害.利用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)介导法,向大豆根系导入由CaMV35S启动子调控的Na+/H+反向转运蛋白编码基因GmNHX1的cDNA序列,通过该基因的过量表达,提高大豆的耐盐性.通过潮霉素...     

巴西橡胶树6个小G蛋白基因cDNA的克隆与序列分析

利用笔者实验室建立的橡胶树胶乳EST序列数据库,结合RT-PCR和RACE技术,克隆巴西橡胶树6个小G蛋白基因的cDNA,并以拟南芥小G蛋白家族基因为模板进行进化树分析.结果表明:所克隆的基因分属于小G蛋白的Arf与Rab家族,将其分别命名为HbArfl、HbArf2、HbRab1、HbRab2、HbRab3和HbRab4.氨基酸序列分析发现,HbRab1、HbRab2、HbRab3和HbRab4均具有小G蛋白家族的保守结构域,即4个鸟苷酸(GTP/GDP)结合域、1个效应区和C端半胱氨酸结构域,而HbArf1和HbArf2除在C端无半胱氨酸结构域及效应区序列保守性差外,HbArf1还缺少2个鸟苷酸结合区,HbArf2缺少1个鸟苷酸结合区.     

大豆PAL2基因的克隆与分析

采用RT-PCR法克隆了1个大豆PAL基因,并利用网络工具分析预测了其编码蛋白。结果表明:该基因是大豆PAL基因家族的1个新成员,命名为GmPAL2(登录号:GQ220305),其全长2284bp,编码1个包含717个氨基酸残基的多肽链,分子量为78.116kD;经BLASTp比对表明:该蛋白序列与菜豆PAL2蛋白同源性最高,达到92%,与大豆PAL1的同源性为89%。该研究结果为进一步研究整个大豆PAL基因家族的特性奠定了基础。     

花生果种皮特异表达基因AhPSG13的克隆和表达研究

为了克隆在花生果种皮中特异表达的基因,本实验从花生果皮种仁抑制消减文库中筛选出一个277bp的EST序列并进行研究,通过构建花生果皮全长cDNA文库,获得此目的基因G13的全长为1369bp,开放阅读框从第28个碱基始至1122个碱基止,预测分子量为39865.59,等电点5.73。生物信息学分析表明该基因编码的蛋白具有4个跨膜结构域和多个活性位点,可能与细胞内DNA转录有关;该蛋白与多种豆科作物的半胱氨酸蛋白酶具有较高同源性,推测为花生半胱氨酸蛋白酶相关基因;RT-PCR研究该基因表达,结果显示该基因在果种皮中特异表达,于30d果皮中表达量最大。本研究克隆的AhPSG13基因序列已经登陆到GenBank,登录号为FJ475061。     

玉米光周期敏感特性研究及长日照光周期诱导差减文库构建

以热带玉米自交系CML288为材料,通过对比研究表明,CML288对光周期非常敏感。通过长、短日照挪移试验发现,CML288短日照处理条件下,6～7叶期是光周期反应最敏感时期,7～9叶期是光周期敏感持续期,但敏感效应明显减弱。以CML288敏感期叶片与茎尖为材料,利用SSH技术构建了对长日照敏感而特异表达的基因文库,3 000多个单克隆被有效富集。对差减文库中分离的64个特异表达EST序列分析表明,16个EST序列与玉米已知功能的蛋白序列具有较高的同源性;41个序列与其它物种编码序列同源性较高;7个EST没有同源的序列,可能代表了新基因。     

巴西橡胶树胚胎晚期丰富蛋白基因的克隆及序列分析

根据抑制性消减杂交文库分离的EST片段,采用3’-RACE技术从巴西橡胶树胶乳中获得HbLEA14基因的全长cDNA序列,其ORF长456 bp,编码151个氨基酸,预测HbLEA14蛋白分子量为16.58 ku,等电点为5.10。同源性比对显示,HbLEA14与蓖麻RcLEA14、乳浆大戟EeLEA14、陆地棉GhLEA14、大豆GmLEA14、拟南芥AtLEA14、番茄SlER5的同源性分别为88%、80%、75%、73%、65%和61%,属于非典型第2组LEA蛋白。RT-PCR结果显示,死皮植株胶乳中HbLEA14的表达量明显高于健康树。     

应用抑制消减杂交技术 构建花生果皮差异表达文库

为构建花生果皮差异表达基因消减文库，分离花生果皮差异表达cDNA片段，本研究采用抑制消减杂交技术，以花生种仁cDNA为Driver，果皮cDNA为Tester，进行两次消减杂交和两次抑制性PCR，将第二次PCR产物与pGEM-T easy 载体相连，电击转化大肠杆菌，成功构建果皮差异表达cDNA文库。所长出菌落中89.2%为白色克隆。采用PCR法对重组子进行鉴定，发现其中单一扩增条带的克隆约占83.5%， 片段大小集中分布于250～750bp之间。     

甘蓝型油菜矮化突变体抑制消减cDNA文库 的构建及初步分析

采用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)技术，以甘蓝型油菜矮化突变体“NDF-1”为实验方（tester），野生型“3529”为驱动方（driver）构建植株差异表达的抑制消减cDNA文库。所建cDNA文库的插入片段大小主要集中在100 bp~1000 bp之间。斑点杂交筛选得到了32个阳性克隆，序列测定和同源性对比分析表明，其中的12个克隆功能未知，其余涉及到激素信号转导、第二信使、光合作用、脂肪酸代谢及衰老等多个方面。还对部分差异表达基因的功能进行了分析。为进一步认识油菜植株矮化的机理奠定了基础。     

大豆短日照诱导下新ESTs序列的筛选和功能推测

本研究对大豆短日照诱导的基因表达差异进行了比较基因组分析,在细胞分子水平上从基因差异表达的角度研究短日照诱导衰老过程中基因转录物丰度的变化,探索大豆衰老的复杂机制。利用本实验室已经获得的抑制性消减杂交第二次PCR扩增产物重新构建新的cDNA文库,继续筛选差异表达的ESTs。利用BLAST 软件在GenBank 数据库进行序列相似性比对,发现28个与暗诱导相关的差异表达新ESTs,归类并推测其参与机体暗适应上调表达的蛋白质功能,为进一步分离暗处理诱导表达的基因,揭示短日照加速衰老的作用机理提供基础数据。     

橡胶树铜转运蛋白基因的克隆及在健康树与死皮树中的差异表达

铜转运蛋白(Copper transporter,COPT)属于CTR/COPT铜转运家族,参与调节生物体内铜的动态平衡。根据抑制性消减杂交文库分离的EST片段,采用3’-RACE技术从巴西橡胶树胶乳中获得HbCOPT5基因的全长cDNA序列,其ORF长420 bp,共编码139个氨基酸,预测HbCOPT5蛋白分子量为15.67 ku,等电点为5.26,含有3个跨膜区。进化树分析结果表明,HbCOPT5与蓖麻、杨树中的COPT蛋白亲缘关系最近;在拟南芥的6个COPT蛋白中,与AtCOPT5的亲缘关系最近。RT-PCR结果显示,健康植株中HbCOPT5的表达量是死皮树中的2.8倍。     

西藏青稞品种藏青13高氮处理的SSH文库构建及分析

为了分析青稞高氮处理相关基因的表达,以藏青13为实验材料,通过抑制差减杂交构建了青稞高氮处理下的差减c DNA文库。在随机挑取的281个阳性克隆中,测序获得219条高质量的EST,含有212条非重复且与Genbank中的基因或蛋白具有较高的同源性的序列。对其进行Blast2Go功能注释可将差异表达的基因定位到细胞组件、分子功能和代谢过程3大类内。通过KEGG代谢途径分析,212个比对结果中的117个ESTs有详细的KO功能注释,定位到17个具体的代谢途径上,且主要定位在光合作用碳固定途径和氮素代谢途径。此外,分析还发现这些基因主要是编码参与结构和功能代谢合成途径中的一些酶,且参与信号转导、转录调节和光合作用等生理过程,说明这些基因很可能参与到青稞在高氮处理下的抗性反应中。     

蝴蝶兰蔗糖合成酶基因的cDNA克隆及其表达分析

利用低夜温诱导的蝴蝶兰花芽的抑制消减杂交文库中分离的蔗糖合成酶基因的ESTs片段,采用RT-PCR和RACE技术,从蝴蝶兰花芽中克隆得到蔗糖合成酶基因的全长cDNA,命名为PhSUS,GenBank登录号JX162557.该基因全长2 816 bp,包含147 bp的5’非编码区、218 bp的3 '非编码区和一个长度为2 451 bp编码816个氨基酸的开放阅读框.PhSUS预测的分子量为93.30 ku,等电点为5.95.蛋白同源性分析结果表明,PhSUS与兰科植物的文心兰、石斛兰和莫氏兰(Mokara)等的蔗糖合成酶有很高同源性.保守结构域分析结果表明,PhSUS含有蔗糖合成酶和葡糖基转移酶两个保守功能域及4个ADP结合位点.表达分析结果表明,PhSUS在检测的组织中都有表达,但表达丰度不同.PhSUS在花蕾发育中后期、成熟花和花器官的表达量都较营养阶段根和叶中的表达量高.PhSUS的克隆为研究其参与花芽分化和发育的表达调控奠定了重要基础.     

核盘菌诱导下甘蓝型油菜宁RS-1 的SSH文库构建

以甘蓝型油菜宁RS-1为材料,用核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary)对6叶期幼苗进行接种。提取经核盘菌诱导前和诱导后的宁RS-1叶片mRNA,经反转录成cDNA,以及经过酶解后加接头和两次杂交,构建差异表达的抑制消减(SSH)cDNA文库。正向消减文库是以诱导后的宁RS-1 cDNA为tester,以正常的宁RS-1 cDNA为driver。所构建的正向文库重组率达到96.2%,反向文库重组率达到94.5%,文库容量均达到了2 190和2 780,表明所构建的文库质量良好。对从文库中随机挑取的克隆进行测序分析,获得了与抗病和代谢有关的基因,如γ-谷氨酰半胱氨酸酶基因、抗真菌蛋白基因、铁蛋白基因、ACC氧化酶基因等,为开展油菜抗菌核病重要功能基因的克隆和鉴定奠定了基础。