禽致病性大肠杆菌唾液酸酶siaK1基因缺失株的构建及其生物学特性分析

禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)是危害养禽业发展的重要病原之一。本试验利用Red同源重组技术构建APEC IMT5155唾液酸酶基因sia K1缺失株和互补株,系统比较其生物学特性的差异。生长曲线测定表明,缺失株比野生株和互补株生长速度加快,而野生株和互补株的生长速度无明显差异;生物被膜形成能力测定表明,sia K1缺失导致细菌生物被膜形成能力显著减弱,而互补株可恢复至野生株水平,说明sia K1基因缺失可影响禽致病性大肠杆菌的生长速度及生物被膜的形成。本研究为进一步探讨sia K1基因功能奠定了基础。     

禽致病性大肠杆菌ibeA基因缺失及其特性分析

运用大肠杆菌Red同源重组系统,对禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)DE02株的ibeA基因进行了缺失,其结果为揭示IbeA的功能奠定了基础.通过对APEC ibeA基因缺失株与人脑微血管内皮细胞(Human brain microvascular endothelial cells,HBMECs)的黏附与侵袭,发现ibeA基因缺失后与HBMECs的黏附率为45%,侵袭率为1.2%,相对于野生型APEC均显著降低;提示ibeA基因是APEC的重要致病因子.     

禽致病性大肠杆菌tonB基因缺失株的构建及其生物学特性研究

为了研究摄铁蛋白TonB对于禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)铁摄取能力及致病性的影响,试验采用同源重组技术构建了APEC tonB基因缺失及回复株,通过测定在正常和贫铁环境下的生长曲线、铁摄取能力等研究tonB对APEC生物学特性的影响,并通过鸡攻毒模型评价了其与APEC毒力之间的关联性。结果显示：APEC TZ18ΔtonB缺失株在正常环境中的生长速度与野生株相比没有差异,但其在贫铁环境中的生长速度显著下降(P<0.05);TZ18ΔtonB缺失株菌体内摄入的铁含量明显低于野生株;TZ18ΔtonB缺失株感染1日龄雏鸡的半数致死量(104.236)高于野生株(10^3.328),显示其毒力下降了8.1倍(P<0.05);此外,TZ18ΔtonB缺失株在21日龄SPF鸡体内心血、肝脏和肺脏中的载菌量显著低于野生株感染水平(P<0.01),而tonB基因回复株的感染水平接近野生株。结果表明：tonB参与APEC铁摄取进程并影响其毒力。     

禽致病性大肠杆菌clpV2基因缺失株的构建及生物学特性分析

旨在研究六型分泌系统2（type VI secretion system 2,T6SS2）clpV2基因对禽致病性大肠杆菌（avian pathogenic Escherichia coli,APEC） TW-XM菌株生物学特性的影响。本研究利用Red同源重组构建clpV2基因缺失株,将clpV2基因克隆到表达载体pBR322中,成功构建回补株。对突变株的部分生物学特性进行分析。结果显示：各突变株均能稳定遗传,且clpV2基因的缺失不影响TW-XM菌株的生长速度以及对多种抗生素的敏感性,但会导致其运动能力和生物被膜形成能力显著下降。综上表明,clpV2基因的缺失会影响TW-XM菌株的部分生物学特性,为进一步研究clpV2基因的功能和APEC的致病机制奠定基础。     

禽致病性大肠杆菌clpV基因缺失株的构建及其对Ⅰ型菌毛主要基因表达的影响

为研究禽致病性大肠杆菌(APEC)六型分泌系统(typeⅥsecretion system,T6SS) clpV基因对Ⅰ型菌毛表达的影响,本研究利用Red同源重组系统构建了禽致病性大肠杆菌clpV基因缺失株TW-XM△clpV.将clpV基因克隆到表达载体pBR322中,构建相应回补株TW-XMC△clpV.通过PCR...     

gltS基因缺失对禽致病性大肠杆菌生物学特性的影响

为研究谷氨酸转运蛋白GltS编码基因对禽致病性大肠杆菌(APEC)生物学特性的影响,本研究利用λ-Red同源重组方法构建APEC CE129(WT)株gltS基因缺失株CE129ΔgltS(KO)和基因回补株CE129ΔgltS/gltS (RS),并均经PCR及测序鉴定,结果显示,gltS基因缺失株及回补株均正确构建。通过连续10 h测定各菌株OD600nm值绘制WT、KO、RS菌株的生长曲线,利用梅里埃自动生化鉴定系统测定3株菌的生化特性;利用K-B纸片法检测3株菌对8类16种药物的敏感性;利用半固体培养基检测3株菌的运动能力。结果显示,3株菌的生长特性、生化特性、药敏特性和运动能力均无明显差异。利用细菌平板计数法计算检测WT与KO菌株的体外竞争指数(CI),分析KO菌株是否致弱。利用结晶紫染色法测定3株菌的生物被膜(BF)的形成能力,并利用刚果红琼脂板及含荧光增白剂的琼脂板分别检测菌株BF中curli菌毛及纤维素的形成情况。结果显示,WT与KO菌株的体外CI为0.32,表明KO菌株轻度致弱。BF形成能力检测结果显示,相对于WT、RS菌株,KO菌株BF的形成能力极显著降低(P<...     

禽致病性大肠杆菌未知功能基因突变株的构建及致病特性分析

采用抑制差减杂交技术(SSH)对禽致病性大肠杆菌(APEC)高致病株E037(血清型O78)与非致病菌株K-12 MG1655进行基因组差异片段克隆与分析。从E037株中共检出17个特异性差异片段,选取其中的编号为88#的基因进行突变株的构建。通过PCR扩增出88#的目的基因片段,并插入到T-easy载体的多克隆位点中,随之克隆到p MEG-375自杀性载体中,构建自杀性载体p MEG375-88#,将突变载体转化到受体APEC E037中,根据同源重组原理,筛选出E03788#基因插入突变株E037-1。对21日龄白来航SPF鸡右胸气囊分别接种E037、E037-1株0.1 mL(108cfu/mL),在6,24和48 h分别扑杀SPF鸡,无菌采集血液、心脏、肝、脾、左肺、肾进行细菌学检查,同时进行病变观察。结果显示:接种鸡6 h后,E037-1在肝、脾和肺中的细菌数比E037明显降低,差异极显著(P0.01);接种鸡24 h后,E037-1在心脏、肝、脾和肺中的细菌数与E037比较有所降低,差异显著(P0.05);接种鸡48 h后,E037-1在心、肝中的细菌数比E037明显降低,差异极显著(P0.01),说明E037-1突变株的致病性明显下降。结果显示88#基因可能是APEC的致病相关基因,其功能值得进一步研究。     

53株禽致病性大肠杆菌的耐药表型及耐药基因的检测

为了解禽致病性大肠杆菌耐药表型及耐药基因的情况,选取江苏、安徽等地分离的53株禽致病性大肠杆菌,采用药敏纸片法对9种抗菌药物进行药敏试验,并对四环素类tet(A)、tet(B)、tet(C)、tet(W)、tet(M)、tet(O)、tet(K)、tet(L)耐药基因,喹诺酮类GryA、ParC耐药基因,磺胺类sulⅠ、sulⅡ、sulⅢ耐药基因,β-内酰胺类SHV、CTX-M、ompCA耐药基因,氨基糖苷类aac(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ、aac(6')-Ⅰb、aac(6')-Ⅱ、ant(3″)-Ⅰ、armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、npmA耐药基因进行PCR检测。结果显示:53株禽致病性大肠杆菌对磺胺异噁唑、环丙沙星、氨苄西林、多西环素的耐药率较高,分别为88.68%(47/53)、71.71%(38/53)、86.79%(46/53)、75.47%(40/53)。其中50株禽致病性大肠杆菌表现为多重耐药,耐4、5、6种药物的现象最为普遍,且不同地区菌株存在差异。tet(A)是四环素耐药基因中最为流行的一种耐药基因(52.83%,28/53),喹诺酮类耐药基因主要由gryA(94.33%,50/53)、parC(94.33%,50/53)基因编码,耐磺胺类药物sulⅠ、sulⅡ、sulⅢ基因均有检出,分别为96.23%(52/53)、98.11%(48/53)、86.79%(46/53),耐β-内酰胺类药物中仅检出ompC A基因(30.19%,16/53),在检测的11种耐氨基糖苷类耐药基因中,最为流行为aac(3)-Ⅱ、aac(6')-Ⅰb、ant(3″)-Ⅰ基因,分别为92.59%(49/53)、98.11%(52/53)、100%(53/53)。耐药基因与相关耐药菌株检出率基本呈正相关。试验结果表明:53株禽致病性大肠杆菌耐药性高,耐药谱广,耐药基因流行现象十分普遍。本试验结果能为禽致病性大肠杆菌的耐药现状与临床用药提供理论指导。     

禽致病性大肠杆菌phoP/phoQ基因敲除株的构建及其毒力基因转录调控的研究

为研究Pho P/Q二元调控系统对禽致病性大肠杆菌(APEC)致病性的调控作用,本研究采用Red同源重组技术分别构建了APEC AE17株的pho P基因敲除株AE18和pho Q基因敲除株AE19,并通过p STV-28质粒分别构建pho P和pho Q基因回补株CAE18和CAE19。并对这些菌株的运动能力、对鸡胚成纤维细胞(CEF)的黏附和侵入能力以及其13个毒力基因的转录水平进行了检测。结果表明,pho P和pho Q基因敲除株运动性能力分别为AE17的70.92%和83.83%;黏附和侵入CEF细胞的能力比AE17均极显著降低,分别为AE17的63.11%、65.42%和59.83%、57.82%。荧光定量PCR结果显示,AE18的毒力基因(sod A、pol A和iss)和AE19的毒力基因(fim C和iss)比AE17相应的毒力基因m RNA的转录水平均呈极显著下降(p0.01)。此外,回补株CAE18和CAE19株能够部分恢复运动性能力、黏附和侵入CEF细胞的能力及相关毒力基因的转录水平。结果表明pho P和pho Q基因的敲除均能够显著改变APEC AE17株相关的生物学特性,并且能够调控毒力基因的转录水平,使其毒力显著下降。本研究为进一步了解APEC的Pho P/Q二元调控系统对其致病性影响提供实验依据。     

江苏部分地区鸭源致病性大肠杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

为研究江苏地区鸭源致病性大肠杆菌的生物学特性,试验对2018-2020年采集的泰州和徐州两地发病鸭场病料进行了大肠杆菌分离鉴定.结果 显示:16 S rRNA共鉴定出79株大肠杆菌,其中O抗原血清型菌株42株,涉及14种血清型,优势血清型有O78(19.0％)、O65(14.3％)、O24(14.3％)和O1(11.9...     

禽病原性大肠杆菌tsh突变株的构建及分离株tsh基因的检测

运用基因重组方法将庆大霉素（Gentamycin,GM）抗性基因连接到PCR扩增的tsh两端区域产生的2个目的基因片段之间,并共同插入到pUC18载体的多克隆位点中,构建出带GM标志的载体pUC18-tshFRGM,从中切下此tshF-GM-tshR片段,再将之克隆到pMEG-375自杀性载体中,构建出自杀性载体pMEG375-tshFRGM,将突变载体转化到含tsh基因的受体APEC E037株中,根据同源重组原理,筛选出tsh基因缺失的E037突变株,命名为E037（Δtsh）。E037和E037（Δtsh）株对1日龄鸡的LD50分别为105.6CFU和109.0CFU,动物感染性试验表明E037（Δtsh）株在内脏器官和血液中的感染能力和大肠杆菌病变程度均有明显下降。在243株禽源分离株中,有167株为tsh＋菌株,其中高致病株、中等致病株和低致病株分别为87.4%（146/167）、12.6%（21/167）和0%（0/167）;O1、O2和O78血清型的高致病株占所在血清型分离株的89.5%-100%,而其它血清型的高致病株仅占其它分离株的53.3%,差异极显著（P〈0.01）。结果显示tsh＋株大多数为高致病性菌株,且其致病性与血清型的种类有一定的相关性,温度敏感性血凝素为APEC重要的致病因子。     

禽致病性大肠埃希菌黏附素研究进展

黏附素是具有黏附宿主细胞能力的细菌表面结构的统称,是直接介导细菌对宿主细胞黏附的物质,故又称定居因子(colonization factor)。在禽致病性大肠埃希菌侵袭宿主组织并引起宿主发病的过程中,黏附是病原菌接触和感染细胞的第一步,因此,黏附素黏附宿主上皮细胞并使宿主致病的作用机理引起了研究者的广泛关注。论文通过对禽致病性大肠埃希菌黏附素的组成成分、黏附机制、种类、分子生物学特性以及相应的黏附素受体等进行相关综述,为研究禽大肠杆菌病的发病机理及对该病进行免疫预防提供理论依据。     

Development of Monoclonal Antibodies against the cOmpT Protein of Avian Pathogenic Escherichia coli and Identification of Epitopes Recognized by Monoclonal Antibodies

To development monoclonal antibodies against cOmpT of avian pathogenic Escherichia coli (APEC), the recombinant cOmpT of APEC origin expression plasmid pET-28a-compT was employed, and cOmpT protein with a molecular weight about 36 kD in the form of inclusion bodies was obtained after induction with IPTG, and then renatured by urea gradient dialysis. BALB/c mice were immunized with the purified cOmpT. An indirect enzyme-linked immunosorbent assay (iELISA) was developed, the optimal coating concentration of the antigen was 0.625 μg·mL^-1 and the optimal serum dilution was 1:6 400. After the fourth immunization, the spleen of immunized mice was collected for cell fusion, three monoclonal hybridomas that can secrete antibody specific to cOmpT were obtained after multiple screenings, named 1G8, 2C3 and 2G3 respectively. And all of their immunoglobulin subclasses were IgG2b. The titers of monoclonal antibodies in the cell culture supernatant were 1:200, 1:3 200 and 1:3 200 determined by iELISA, respectively. All three monoclonal antibodies were confirmed to react with cOmpT in Western blot, without cross reaction with other tested bacteria. The antigenic epitopes recognized by the three monoclonal antibodies were identified by using a series of E. coli strains harboring expression plasmids recombined with truncated fragments from compT gene. The results revealed that the antigenic epitope required for reactivity with the 1G8 was ⁸³DQDWMDS⁸⁹, and ⁹⁰SNPGTW⁹⁵, ¹⁹⁷TFKYSGW²⁰³were recognized by 2C3 and 2G3, respectively. In this study, three monoclonal antibodies against cOmpT were successfully developed and the antigenic epitopes recognized by the antibodies were identified. The cOmpT specific monoclonal antibodies obtained in this study are potentially useful tools for both the functional study of cOmpT and the development of APEC epitope vaccines.     

禽致病性大肠杆菌cOmpT单克隆抗体的研制及其识别抗原表位的鉴定

旨在制备禽致病性大肠杆菌（APEC）染色体编码外膜蛋白（cOmpT）的特异性单克隆抗体,本研究利用实验室已构建的APEC cOmpT重组表达质粒pET-28a-compT,经IPTG诱导表达后,获得以包涵体形式存在的约36 ku的重组蛋白cOmpT,利用尿素浓度梯度透析复性获得纯化蛋白cOmpT,并以此免疫BALB/c小鼠。建立间接ELISA检测方法,最适抗原包被浓度为0.625 μg·mL^-1,最适血清稀释度为1：6 400。4次免疫后取小鼠脾进行细胞融合,采用有限稀释法多轮筛选后得到3株能稳定分泌针对cOmpT蛋白的单克隆抗体,分别命名为1G8、2C3和2G3,均为IgG2b亚类。3株杂交瘤细胞上清ELISA抗体效价分别为1：200、1：3 200和1：3 200。Western blot结果显示,3株单抗均能与cOmpT发生特异性反应,而不与其他受检菌发生交叉反应。运用原核表达系统对compT基因进行截短表达,对单克隆抗体针对的cOmpT抗原表位进行鉴定,结果显示单抗1G8、2C3和2G3识别的抗原表位分别是⁸³DQDWMDS⁸⁹、⁹⁰SNPGTW⁹⁵和¹⁹⁷TFKYSGW²⁰³。本研究成功制备了3株抗cOmpT蛋白的单克隆抗体,并对其识别的抗原表位进行了鉴定,为cOmpT蛋白功能研究和APEC新型表位疫苗研发奠定了基础。     

鸡源致病性大肠埃希菌菌毛基因研究进展

菌毛是鸡大肠埃希菌的重要致病因子之一。文章对鸡源致病性大肠埃希菌菌毛的特点及分类,各型菌毛亚单位基因结构及其功能与控制,鸡源致病性与其他动物源大肠埃希菌菌毛之间的同源性进行了综述。这对了解菌毛亚单位基因结构与致病力的关系,探讨鸡源大肠埃希菌的致病力与分布有重要意义。     

禽致病性大肠杆菌Hcp2b对雏鸡气管黏膜细胞因子-细胞因子受体相互作用通路的影响

T6SS(type Ⅵ secretion system)是革兰阴性菌中常见的一种分泌系统,其效应蛋白Hcp2b作用机制迄今仍未明晰.本研究以禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)Hcp2b蛋白为研究主体,旨在探究Hcp2b蛋白在APEC感染鸡气管黏膜过程中发挥...     

河南省鸡致病性大肠杆菌耐庆大霉素质粒的检测分析

通过对12株100%耐庆大霉素的多重耐药菌株的质粒提取,电泳检测和转化试验,成功获得了2株由质粒介导的耐庆大霉素的多重耐药菌株。结果表明:同一质粒可编码一个至数个耐药性基因,不同质粒可以携带相同的耐药性基因,并且这些质粒可以传递多种耐药性。证明了菌株对庆大霉素的耐药性是由耐药性质粒介导的,细菌的抗药性与耐药性质粒的转移有很大关系。     

鸭源致病性嗜水气单胞菌的分离鉴定与生物学特性分析

为了解嗜水气单胞菌的肉鸭健康带毒、致病与耐药情况,对贵州省三穗县某肉鸭屠宰场临床健康肉鸭随机取样,进行嗜水气单胞菌的分离鉴定、毒力基因检测及耐药性分析。结果显示,分离菌具有嗜水气单胞菌典型的培养特征,菌落形态、菌体形态和生化特性均与嗜水气单胞菌相符;16 S rRNA基因序列系统进化树显示,该分离菌与嗜水气单胞菌聚为一支,同源性均>99%;动物回归试验显示,该分离菌对小鼠有较强的致病性;毒力基因PCR检测显示,该分离菌携带aer、hly、epa、act、alt和ahp等6种毒力基因;药敏试验结果显示,该分离菌对复方新诺明、磺胺嘧啶、环丙沙星和诺氟沙星等15种药物耐药;耐药基因PCR检测显示,该分离菌携带qnrB、Sul1和IntI1等3种耐药基因,与药敏试验表型相符。研究结果为嗜水气单胞菌的生物学特性研究及防控提供参考依据。     

六株传染性支气管炎病毒的生物学特性鉴定及遗传进化分析

从华南地区疑似传染性支气管炎的病料中,分离到6株传染性支气管炎病毒并对这些分离株进行鸡胚矮小化试验、新城疫病毒干扰试验、血凝特性试验、鸡胚气管环感染试验、S1基因的克隆测序与序列分析。结果表明,各分离株均对鸡胚有明显的致矮小化作用;对新城疫病毒有明显的干扰作用;无直接血凝性,经10g/L胰酶处理后,可凝集鸡的红细胞;对鸡胚气管环有明显的感染致病变作用;利用RT-PCR方法,成功扩增出分离株的S1基因,与参考株S1基因序列比对,其中1株(GD-09II)属于Mass型,剩下5株与LX4型亲缘关系较近。