鸭星状病毒单克隆抗体的制备及鉴定

为了制备针对鸭星状病毒(Duck astrovirus,DAstV)衣壳蛋白的单克隆抗体,以DAstV C-NGB株为免疫原,用ORF2重组蛋白作为抗原进行筛选,获得7株稳定分泌抗DAstV ORF2蛋白单抗的杂交瘤细胞。取E5C1株和C10F6株进行鉴定,结果表明,2株单抗均为IgM,轻链均为κ型;细胞上清和小鼠腹水的效价分别为10~5和10~6以上;免疫印迹试验表明,2株单抗均能识别重组ORF2蛋白;特异性试验表明,E5C1株杂交瘤细胞的培养上清只与DAstV反应。     

猪圆环病毒4型Cap蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为制备猪圆环病毒4型(PCV4)Cap蛋白单克隆抗体,以原核表达的重组Cap蛋白免疫6～8周龄小鼠,三次免疫后取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。利用亚克隆技术和间接免疫荧光(IFA)方法筛选到2株阳性单克隆杂交瘤细胞株,分别命名为5H9和2F3。间接免疫荧光和Western blot试验表明,2株单抗均能特异性识别293T细胞中特异表达的Cap蛋白,且5H9和2F3的IFA效价分别为1∶12 800和1∶6 400。亚类鉴定结果表明,两株单抗重链均属于IgG1,轻链类型为kappa型。本研究制备的抗PCV4 Cap特异性单抗,为PCV4检测方法的建立和流行病学调查提供了有效的生物材料,也为该病毒的分离鉴定与Cap蛋白功能的探究奠定了基础。     

小鼠抗鹅细小病毒VP3蛋白单克隆抗体的制备

采用杂交瘤技术,用纯化的鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV) VP3蛋白免疫Balb/c小鼠制备单克隆抗体(mAb),经间接ELISA方法筛选和有限稀释法进行3次亚克隆后获得一株抗鹅细小病毒VP3蛋白杂交瘤细胞株(4E5).经鉴定,该mAb为IgGl亚型,轻链为κ链.Western blot试验结果表...     

抗猪输血传播病毒1型Cap蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备抗猪输血传播病毒1型(TTV1) Cap蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究采用PCR法扩增TTV1ORF1 (1501nt～2475nt)编码重组Cap蛋白的C末端截短序列,将PCR产物克隆于pGEX-6P-1载体中,并在大肠杆菌Rosetta (DE3)菌株中诱导表达,获得含GST标签的重组蛋白(rCap),经SDS-PAGE和western blot鉴定表明rCap约为64.0.ku,以包涵体形式存在.用纯化的rCap免疫BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术获得8株稳定分泌抗rCap蛋白的杂交瘤细胞株,MAb亚类均为IgGl/κ型;western blot鉴定表明有7株MAbs与rCap产生特异性反应,另1株MAb呈阴性.为验证8株MAbs与真核表达的Cap蛋白的免疫反应性,将全长与截短的TTV1ORF1基因片段克隆于pcDNA3.1载体,转染293T细胞进行蛋白瞬时表达,采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法检测表明,这8株MAbs均能够与瞬时表达的全长rCap产生特异性反应,其中6株与截短表达的rCap反应.本研究表达的rCap蛋白及制备的MAbs,为该病毒检测方法的建立及抗原表位的鉴定奠定了基础.     

抗猪圆环病毒2型Cap蛋白中和性单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化的杆状病毒表达的重组猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白(PCV2-rCap)免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞瘤杂交技术获得了5株稳定分泌抗PCV2-rCap蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为1D2、2E8、3A10、5F2和6F10.这5株杂交瘤细胞诱导同品系小鼠产生的腹水抗体效价分别为1:2 048 000、1:512 000、1:1 024 000、1:512 000、1:1 024 000;其中1D2、2E8、5F2和6F10单抗亚类为IgG2a,仅3A10为IgG1;2E8、3A10、5F2和6F10单抗轻链为入型,仅1D2轻链为K型.Western blot结果显示,这5株单抗中2E8、3A10、5F2和6F10可与自然PCV2-Cap发生反应,而1D2无反应.IPMA和抗原捕获ELISA结果表明,ID2单抗可与PCV2病毒蛋白发生反应,而与PCV1无交叉反应;病毒中和试验证实,1D2单抗具有中和活性,是一株针对PCV2-Cap蛋白中和表位的单抗.这些单抗的制备为PCV2抗原表位分析及分子诊断提供了技术手段.     

传染性囊病病毒VP5蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

传染性囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)的非结构蛋白VP5在病毒感染细胞的不同阶段发挥着抑制或诱导细胞凋亡的重要作用。为制备抗血清I型IBDV VP5蛋白的单克隆抗体,取经His-VP5蛋白免疫4次的BALB/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,3次亚克隆后获得2株能稳定分泌VP5蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为5EC7和2BE5。经间接ELISA测定,以上2株单抗的亲和力解离常数分别为1.14×10~(-10)和4.87×10~(-10),亚类分别为Ig G2a和Ig G1。通过Western Blot和间接免疫荧光试验检测,2株单抗均能识别IBDV感染DF-1细胞后产生的VP5蛋白。Western Blot试验表明,2株单抗识别的抗原表位区域为VP5 N-端的1~10 aa。该单抗为研究血清I型IBDV VP5蛋白的生物学功能及病毒致病机理奠定基础。     

伪狂犬病病毒gE基因的表达及gE蛋白单克隆抗体的制备

以猪伪狂犬病病毒（PRV）Min-A株pMD-gE质粒为模板,利用所合成的特异性引物进行PCR扩增,获得了1 000 bp的DNA片段,并将其克隆至表达载体pET-30a中,转化到大肠杆菌中进行了原核表达,对表达产物进行了抗原性分析;在此基础上,用纯化的gE蛋白免疫BALB/c小鼠,筛选和鉴定了分泌抗gE蛋白单抗的杂交瘤细胞株。结果显示,原核表达的gE蛋白具有良好的抗原性,其分子质量为46 ku。筛选获得3株分泌抗gE蛋白单抗的杂交瘤细胞株,Western-blot和间接免疫荧光试验证实,所获得的3株单抗具有良好的特异免疫反应原性。3株单抗均为IgG1亚类,且轻链均为κ链。     

鸡传染性贫血病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备CIAV VP2单克隆抗体,将原核表达的His-VP2融合蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠。经4次免疫后,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合。将原核表达的GST-VP2融合蛋白作为包被抗原,利用间接ELISA筛选阳性克隆。阳性细胞株经3次亚克隆后,获得3株稳定分泌抗CIAV VP2蛋白的杂交瘤细胞克隆,分别命名为3D7、3B8、2D3。经间接ELISA测定,以上3株杂交瘤细胞腹水效价分别为1:8.0×10~5、1:4.0×10~5,以及1:6.4×10~6,亲和力解离常数分别为7.34×10~(-11)、2.65×10~(-11),以及2.98×10~(-11)。IgG亚类分别为IgG1、IgG2b以及IgG2b。经Western Blot试验证明,3D7株单抗能特异地识别CIAV VP2蛋白,其识别的抗原表位区域为VP2 N-端的20~40 aa。经IFA试验证明,3株单抗均能识别天然的CIAVVP2蛋白。此单抗为研究CIAVVP2的生物学功能和CIAV致病机理奠定基础。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的研制及其应用

以真核表达的猪圆环病毒2型（PCV2）Cap蛋白所形成的病毒样颗粒作为免疫原,按照常规方法免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞融合。经间接ELISA法和间接免疫荧光试验（IFA）筛选,总共获得了4株分泌抗PCV2 Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为7A6、3F2、3B7、1A6。4株单抗腹水效价均达到1:10⁵。IFA和免疫过氧化物酶单层实验结果显示,4株单抗均能与PCV2发生特异反应,与PCV1无交叉反应。PCV2 Cap蛋白单克隆抗体的制备,为猪圆环2型病毒抗原表位分析及其相关抗原抗体诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

1型鹅星状病毒ORF2蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

[目的] 利用原核表达系统表达1型鹅星状病毒（Goose astrovirus 1,GAstV-1）结构蛋白ORF2,并制备其多克隆抗体。[方法] 根据GAstV-1 TZ03株基因序列,对ORF2基因序列进行大肠杆菌密码子偏爱性优化和合成,将其克隆至原核表达载体pET-30a（+）,构建重组质粒pET-ORF2,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,IPTG诱导表达重组蛋白,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白;将鉴定正确的重组蛋白纯化后免疫家兔制备多克隆抗体,以间接免疫荧光试验鉴定多克隆抗体的特异性。[结果] 酶切和测序结果显示,成功获得重组质粒pET-ORF2;SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子质量约为70 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果表明,该蛋白能与抗His标签鼠单克隆抗体发生特异性反应。间接ELISA检测制备的兔抗ORF2蛋白多克隆抗体效价达1：128 000;间接免疫荧光试验结果显示,制备的多克隆抗体能与GAstV-1发生特异性反应。[结论] 原核表达的GAstV-1 ORF2重组蛋白具有良好的免疫原性,制备的兔源多克隆抗体具有较高的效价和特异性,为研制GAstV-1相关诊断试剂奠定了基础。     

Preparation of Monoclonal Antibodies against Porcine Circovirus Type 2 Cap Protein

The structural protein Cap encoded by ORF2 of porcine circovirus type 2 (PCV2) was expressed in genetic engineering recombinant bacteria and used as the immunogen after purification.Five hybridoma cell lines against PCV2 Cap protein named as 3D12,4D5,4B9,4C9 and 4G10,respectively,were developed after fusion between SP2/0 myeloma cells and spleen cells of BALB/c mice immunized with purified recombinant PCV2 Cap protein.Except the heavy chain type of 4D5 was identified as IgG2b,others were identified as IgG1;The light chains were all kappa.In Western blotting assay,all the monoclonal antibodies (mAbs) couldn't specifically recognize the 47 ku recombinant PCV2 Cap protein,but showed strong specific fluorescence in PCV2 infected PK15 cells in IFA,which indicated that all the mAbs recognized comformational epitope.The neutralization test showed that all the mAbs had neutralization activity.These results laid the foundation for further study of the structure and function of PCV2 ORF2 gene,and establishment of the method for diagnosing PCV2 rapidly and exactly.     

猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备

本研究利用已构建的基因工程重组菌表达猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)ORF2编码的Cap蛋白,纯化后作为免疫原,免疫8周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。经间接免疫荧光试验(IFA)筛选及有限稀释法进行3次亚克隆后,本试验最终获得5株稳定分泌抗PCV2 Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为3D12、4D5、4B9、4C9和4G10。其中4D5为IgG2b亚型,其余4株单克隆抗体均为IgG1亚型,轻链类型均为κ。Western blotting鉴定结果表明获得的5株单克隆抗体均不能特异性的识别47 ku重组PCV2 Cap蛋白;对病毒感染细胞进行IFA试验,结果显示5株单克隆抗体均特异性的识别病毒抗原,表明5株单克隆抗体识别的抗原表位均为构象表位。中和试验结果表明,5株单克隆抗体均有中和活性。本试验结果为进一步探索ORF2基因的结构、功能及建立快速准确的诊断方法奠定了基础。     

恩诺沙星单克隆抗体的制备及其鉴定

采用碳二亚胺法和氯甲酸异丁酯法合成恩诺沙星的人工抗原,结合比为15∶1。用人工抗原腹腔免疫BALB/c小鼠,有限稀释法筛选获得分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株2H10C2F11,并将该细胞株注射小鼠腹腔获得腹水。纯化后的抗体效价为3.96×10-6,紫外分析方法计算蛋白含量为1.139 mg/mL,琼脂双扩实验表明抗体为IgG1型,SDS-PAGE电泳图谱显示纯化效果理想;经间接ELISA方法测定,抗体的亲和力为1.8×108L/moL。     

非洲猪瘟病毒pS273R蛋白水解酶单克隆抗体制备

本研究旨在制备非洲猪瘟病毒(ASFV)S273R蛋白的特异性单克隆抗体.本研究以原核表达的非洲猪瘟病毒重组S273R蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞.结果显示:基于纯化的S273R蛋白建立的间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选和亚克隆,获得了 4株可稳定分泌抗ASFV S273R...     

牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为制备牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gD蛋白单克隆抗体,并对其免疫学特性进行分析与鉴定。用CHO细胞表达的IBRV-gD蛋白作为免疫原免疫8周龄的Balb/c小鼠,无菌取其脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合,筛选阳性杂交瘤细胞株,经小鼠腹腔注射,待小鼠腹腔膨胀后,收集腹水,纯化后进行单克隆抗体浓度、纯度、类及亚类、抗体效价、相对亲和常数、Western blot和间接免疫荧光测定。结果表明,筛选到2株阳性杂交瘤细胞株,分别命名为4G3D4和9D7A7。4G3D4和9D7A7这2株单抗纯化后的浓度分别为2.6 mg/mL、1.6 mg/mL;亲和常数分别为2.30E+10、1.88E+09;抗体亚类均为IgG1,轻链为kappa链;且均能与IBRV发生特异性反应,与接种IBRV的MDBK细胞发生反应,产生特异性荧光;间接ELISA测定腹水效价分别为1∶204800、1∶12800。利用CHO细胞表达的IBRV-gD蛋白成功制备了2株单克隆抗体,为下一步建立特异性的IBRV检测方法奠定了基础。     

猪瘟病毒E2蛋白A/D区单抗的制备及其抗原表位的初步研究

应用分子克隆技术将猪瘟病毒E2蛋白部分基因插入到载体pGEX-4T-1中构建重组质粒pGEX-4T-E（A）,在大肠杆菌Rosetta中表达融合蛋白GST-E（A）,以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经克隆化和间接ELISA筛选,获得了C3、A1两株稳定分泌抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,ELISA结果显示,其腹水效价为1∶128000和1∶256000。Western blotting结果证实,单克隆抗体C3和A1能与猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）发生特异性的反应,表明该单抗是针对猪瘟病毒E2蛋白的保守线性表位。     

禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备、鉴定与初步应用

为获得禽脑脊髓炎病毒(Avian Encephalomyelitis virus,AEV)VP1蛋白的单克隆抗体,通过原核表达AEV VP1蛋白,纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠,并按常规方法制备杂交瘤细胞。经ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经过3次亚克隆获得2株杂交瘤细胞株,命名为4#、19#,并进行了抗体亚类的鉴定、Western-blot和IFA检测。结果显示：制备的株单克隆抗体亚型分别为IgG2b、IgG2a,Western-blot和IFA试验结果表明单克隆抗体均能与AEV发生特异性反应而与其他禽病常见病毒均无交叉反应。运用建立的IFA对单抗进行了初步运用,在外源病毒检测方面与经典方法符合率高。本研究成功制备了AEV单克隆抗体,为进一步建立AEV检测方法和深入研究AEV的生物学特性奠定了基础。