一株棉花黄萎病拮抗芽孢细菌的分离鉴定及活性检测

 采用改良的琼脂平板扩散法,通过初筛和复筛,得到一株对棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）具有较强的抑菌活性的拮抗细菌Z-5菌株。通过对该菌株的形态特征观察、生理生化鉴定和16S rDNA的序列分析,确定拮抗细菌Z-5菌株为Bacillus malacitensis。盆栽实验表明Z-5菌株对大丽轮枝菌的防治效果达到76.05%,对棉花黄萎病具有明显的防治作用。     

棉花黄萎病拮抗细菌的筛选与抗菌物分析

对21株芽孢杆菌属细菌分别进行了摇瓶震荡培养,其发酵液上清液用硫酸铵盐析,杯碟法测定了沉淀物对大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)的拮抗活性,并对其中6株具有较强抑菌活性菌株的抗菌物进行了蛋白酶稳定性、热稳定性等分析.结果显示,BDT-25、JJ-5、DHT-12、80b-2、DHT-13和JJ-134菌株的抑菌活性较高;6株拮抗细菌发酵液沉淀物均对氯仿敏感,抗菌物溶液经蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶处理后活性丧失或显著下降,对温度也较敏感,认为这些抗菌物质为蛋白或多肽类物质.拮抗菌株产生的抗菌蛋白通过抑制大丽轮枝菌孢子萌发和使菌丝体原生质凝集而抑制其生长.     

棉花黄萎病拮抗细菌DS45-2菌株在土壤和棉花根内的定殖

通过盆栽试验,对棉花黄萎病拮抗细菌DS45-2菌株在土壤和棉花根际、根内的定殖情况进行了分析。结果表明,在自然条件下,拮抗细菌DS45-2菌株能够在土壤及棉花根际、根内定殖。拮抗菌株DS45-2施到土壤中后的45d内,其定殖数量在开始25d内显著下降,但随后下降缓慢并逐渐趋于稳定,维持在106个·g-1土左右。接菌后45d,DS45-2在棉花根内的定殖菌量达2.35×104个·g-1根,在棉花根际的定殖菌量达97.4×106个·g-1土,且重新分离出的拮抗菌株保持较高的拮抗活性。DS45-2菌株在灭菌土中的定殖数量高于自然土中的数量。随土层深度的增加,定殖菌量呈下降趋势,但变化不明显。     

棉花黄萎病拮抗细菌2-70（Bacillus subtilis）菌株定殖能力的研究

试验通过灭菌土和非灭菌土两种土样,试验前分别对这两种土样进行三种不同的处理,即：用拮抗菌芽孢液浸种,土壤全部混菌,部分混菌进行盆栽试验。主要通过盆栽试验,考察棉花黄萎病拮抗细菌2—70在土壤中的定植情况及在棉花根内和根际的定植情况。结果表明,在实验室条件下,拮抗细菌2．70能够在灭菌土和非灭菌土中定殖,且定殖数量达10^6cfu／g土左右,经过五个月后仍能保持较高的抑菌活性,并且菌株在灭菌土中的定殖数量高于非灭菌土中的数量。通过对棉苗根内细菌的回收,证实拮抗细菌2．70能在棉花根内定殖,数量达到10^3cfu／g。     

棉花黄萎病拮抗细菌LC-04菌株的抗菌蛋白产生条件研究

LC-04菌株是从棉花叶部组织中分离出的一株类芽孢杆菌,其发酵液上清液的硫酸铵沉淀物对大丽轮枝菌V-190菌株的生长具有明显的拮抗作用,实验证明发酵液中含有蛋白质类抗菌物质。LC-04菌株的适宜发酵条件为:在pH7的LBG培养基中于30℃,180 r.min-1摇床振荡培养48 h,用70%硫酸铵对LC-04菌株发酵液上清液进行盐析,可以沉淀最多的抗菌蛋白。     

棉花黄萎病菌拮抗细菌TUBP1的分离鉴定及其防病作用

为研制和开发新疆棉花黄萎病优良生防菌剂,采用琼脂平板扩散法,通过初筛和复筛,分离得到一株对棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)具有较强抑菌活性的拮抗菌株TUBP1。通过对形态观察、生理生化实验、16S rDNA和gyrB的基因序列分析,确定该菌株为Bacillus axarquiensis;利用生长速率法和牛津杯法分别测定了发酵液对棉花黄萎病菌抑菌活性,对棉花黄萎病菌菌丝生长抑制率为78.62%±3.48%,抑菌圈直径为21.00±3.86 mm。温室盆栽试验中,TUBP1最大生防效果为43.67%,小区试验中,TUBP1最大生防效果为43.07%。     

利用拮抗真菌防治棉花黄萎病

从分离和征集的土壤真菌中筛选出13个对黄萎病菌有生防潜力的菌株。温室盆栽试验表明,这13个菌株均可有效地降低棉黄萎病的发生率和病情指数,其中以菌株T3 4(Trichodermasp.)、THT(T.hamatum)和T2 4(T.sp.)作用效果最为明显。田间小区防效试验表明,3个木霉菌株对棉黄萎病第一次发病高峰和第二次发病高峰的防治效果达到38.2%～53.5%和13.6%～36.0%。     

棉花根部拮抗枯萎病菌或黄萎病菌的可培养内生细菌多样性分析

为解析棉花内生细菌的种群结构,更好地开发利用生防内生细菌,以棉花枯萎病菌、黄萎病菌为指示病原真菌,对常抗棉和泗棉3号根部分离获得的内生细菌进行拮抗活性筛选,获得87株至少对其中1个指示病原真菌具有拮抗作用的内生细菌。ARDRA分析(Amplified ribosomal DNA restriction analysis)和16S r DNA序列测定表明棉花根部可培养内生拮抗细菌可分为13个ARDRA类群,分属于芽孢杆菌属(Bacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、农杆菌属(Agrobacterium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、不动杆菌属(Acinetobacter)和假单孢菌属(Pseudomonas)7个属。其中常抗棉根部内生拮抗细菌分属于芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、伯克霍尔德氏菌属和农杆菌属,而泗棉3号根部内生拮抗细菌则分属于芽孢杆菌属、伯克霍尔德氏菌属、中华根瘤菌属、不动杆菌属和假单孢菌属,二者的优势种群都是芽孢杆菌属细菌。BOX-PCR分析显示这些内生拮抗细菌具有丰富的遗传多样性。通过测定这些内生拮抗细菌对棉花黄萎病菌和棉花枯萎病菌的拮抗力大小,以及是否具有产纤维素酶、几丁质酶、蛋白酶和嗜铁素的活性,表明这些内生拮抗细菌具有不同的生防作用机制。     

棉花内生拮抗菌Paenibacillus xylanilyticus YUPP-1抗黄萎病研究

 在棉花现蕾期筛选到一个高抗黄萎病的内生菌菌株,根据16S rDNA序列同源性,将其命名为Paenibacillus xylanilyticus YUPP-1(解木聚糖类芽孢杆菌YUPP-1)。当把该菌标记后,每株棉花施用该菌株达到1×10⁶ cfu时,该菌能顺利定殖于棉花体内。室内盆栽抗病实验表明：当生防菌灌根处理的菌量为每株1×10⁶,1×10⁷,1×10⁸ cfu,其在结铃期的发病株率仅为8%,5%和2%,而此时对照的发病株率高达96%。2008－2009年的小区防治结果表明：当生防菌灌根处理的菌量为每株1×10⁸ cfu时,2008年处理区的棉花黄萎病发病株率和病指为14.8%和8.5,对照分别为53.3%和26.5,2009年处理区的棉花黄萎病发病株率和病指为9.4%和6.5,对照为37.8%和18.8。这些结果表明,解木聚糖类芽孢杆菌YUPP-1对防治棉花黄萎病具有巨大的应用潜力。     

棉花抗黄萎病QTL定位研究进展

QTL(quantitative trait locus)定位将控制数量性状的基因分解成单个孟德尔因子进行详细剖析,更为细致地了解数量性状的遗传规律,为加速棉花抗黄萎病的遗传改良奠定基础。本文概述了棉花抗黄萎病QTL定位理论和现状,讨论了棉花抗黄萎病QTL定位过程中存在的问题及在遗传改良上的应用前景。     

棉花黄萎病菌落叶型菌系研究

通过对我国棉花黄萎病菌 V_B 与已知的美国落叶型黄萎病菌 T_9以及我国非落叶型黄萎病菌 V_6、V_10进行对照比较研究,所得结果表明,菌系 V_B 为强致病力,病株落叶成光杆,在6个抗感不同的棉花寄主上致病,平均病情指数达54.6;对不同温度反应显示偏耐高温,适宜生长温度为20～30℃,最佳温度25℃;在 PDA 培养基上菌落白色,微菌核不明显,呈束状膨胀菌丝团等生理特性方面,均和美国落叶型黄萎菌 T_9表现趋于一致,而与非落叶型黄萎菌系差异明显。从而证实江苏常熟徐市的棉花黄萎菌系 V_B 是落叶型的病原菌。为综合防治提供科学依据。     

棉花品种对黄萎病慢病性初步研究

2002-2003年在河南省新乡县李台基地重病田,通过定株定时调查发病情况和各单株的产量结构,研究了不同抗病性棉花品种对黄萎病慢萎性。结果表明,若单纯以8月下旬的病情指数为标准,不少品种的抗病性均不理想,但从黄萎病发展历程分析,则发现有一部分耐至感病品种,其病情发展缓慢,对产量的影响也达不到显著水平。为此,提出棉花品种存在对黄萎病的慢病性,简称棉花品种慢萎性。     

Detection of the Colonization Ability of Antagonistic Bacteria Strain Z-5 against Cotton Verticillium Wilt

The first step in the biological control of plant diseases is to determine whether antagonistic microorganisms can colonize successfully the plant rhizosphere soil. Bacillus Z-5 was isolated from cotton plant soil and showed a significant biocontrol effect on cotton Verticillium wilt. The strain Z-5 was marked with resistance to rifampicin and pathogenic fungi. A Z-5 mutant strain that could stably grow in 300 μg·mL^-1 rifampicin NA medium and had wild-type antagonistic activity against pathogen fungi, colony morphology, and cell morphology was selected. The marked strain Z-5 was used to treat cotton seeds by seed soaking, seed dressing, and soil drench. The number of Z-5 cells in cotton plant root soil, roots, stems, and leaves was tested using dilution on rifampicin plate after different periods. The result showed that the number of antagonistic bacteria of soil drench group in cotton plant root soil was 49.72×10⁴ cfu·g^-1, while seed soaking and seed dressing groups yielded about 0.49×10⁴ and 2.07×10⁴ cfu·g^-1. The number of antagonistic bacteria of the soil drench group in cotton plant roots was 4.93×10⁴ cfu·g^-1, while the seed soaking and seed dressing group yielded 4.12×10⁴ and 3.29×10⁴ cfu·g^-1.The number of antagonistic bacteria of the soil drench group in cotton stems was 1.32×10⁴ cfu·g^-1, while the seed soaking and seed dressing group yielded 0.17×10⁴ and 0.74×10⁴ cfu·g^-1. The number of antagonistic bacteria of soil drench group in cotton leaves was 0.27×10⁴ cfu·g^-1, while seed soaking and seed dressing group yielded 0.17×10⁴ and 0.22×10⁴ cfu·g^-1. These results showed that the Z-5 strain could effectively colonize cotton roots soil and that in vivo , the soil drench group showed a better colonization effect by the strain Z-5 than the seed soaking and seed dressing group.     

棉花抗黄萎病生理与生化机制研究

本文概述了棉花抗黄萎病的特点与规律,指出棉花植株是通过自身组织结构的强化、植物抗毒素的合成以及微生物之间的互作三方面应对黄萎病菌的侵染。认为棉花植株主要通过促进木质素生成和增加积累量以强化组织结构。在棉花抗病反应中以植物抗毒素的合成为主要途径,包括萜类、酶类和激素类3类化学物质,其中酶类物质如几丁质酶已经在很多植物中被证明具有抗病作用,但是其具体作用途径仍不清楚。土壤中某些微生物也可以对黄萎病菌产生作用。重点讨论了在棉花抗黄萎病信号通路中重要分子磷酸激酶和磷酸酯酶在植株抗性防卫中起着级联调控开关的作用,在现有信号调控研究基础上其在抗病机制中可能的参与途径。对目前棉花抗黄萎病分子育种研究中存在的主要问题和可能的解决途径进行了探讨,展望了其发展的方向。     

棉花对黄萎病的抗病机制研究进展

本文概述了棉花黄萎病抗性的遗传规律和特点，从寄主与病原菌识别的相互作用、组织抗性、生理生化抗性、生态抗性4个方面综述了棉花对黄萎病抗病机制的研究进展。指出真菌诱导子是寄主与病原菌识别和互作的关键因素，不同棉株的固有组织结构抗性和诱导组织结构抗性对黄萎病的抗病表现也不相同；在生理生化抗性上重点介绍了植物抗毒素、酶、糖类物质、激素与棉花抗病性的关系；阐述了棉花对黄萎病的生态抗性，即棉花根系分泌物和根系微生物与黄萎病抗性的相互作用。在这4种抗性中，生理生化抗性起主导作用，但离不开多种抗性机制的相互作用和协调。此外，作者对棉花抗黄萎病分子育种的进展作了概述，简要介绍了RFLP、RAPD、AFLP、SSR等分子标记技术和转基因技术在分子育种中的应用与所取得的进展。最后对棉花黄萎病抗性机制及棉花抗黄萎病分子育种研究的未来发展方向和重点作了展望。     

不同强度温度刺激对棉花黄萎病的影响

采用三个不同抗性的棉花品种、三个不同的黄萎病菌系和三个温度梯度,完全随机区组设计,在人工气候箱中研究刺激不同时间对棉花黄萎病发病的影响。结果表明,刺激温度的高低和品种的抗性对棉花黄萎病的发生与扩展有显著的影响,而菌系致病力以及刺激时间长短对棉花黄萎病的发生也存在显著差异,但影响较小;品种的抗病性对棉花黄萎病的发生起着至关重要的制约作用;温度对黄萎病的发生与扩展起着关键作用。初步明确了影响棉花黄萎病发生与扩展的几个因子间的互作效应及其影响程度。     

棉花黄萎病及抗病育种研究进展

 介绍了黄萎病病菌致病机理、棉花黄萎病抗病机理及棉花抗黄萎病育种研究的现状,从不同的方面分析了制约棉花抗黄萎病育种研究的因素,提出了加快抗黄萎病育种研究进程的对策和建议。     

Physiological Mechanism of Different Varieties and Potassium Application Amounts on Cotton Resistance to Verticillium Wilt

[Objective] It has theoretical guiding significance for the comprehensive control technology of Verticillium wilt of cotton to explore the effect of potassium nutrition on mechanism of cotton Verticillium wilt resistance under the condition of pathogen stress of Verticillium dahliae. [Method] Three cotton cultivars Jimian 11 (JM-11 as susceptible cultivar), Zhongzhimian 2 (ZZM-2 as control cultivar), Nongda 601 (ND-601 as resistant cultivar) were adopted, and each cultivar had 0, 75, 150, 225, 300 kg· hm－2 potassium levels represented by K0, K75, K150, K225, K300. Two factors split plot experiment was designed under artificial nursery inoculated Verticillium dahlia, to observe disease index of Verticillium wilt, and researched resistance associated substances content and enzyme activity. [Result] (1) The lignin, total phenol contents and POD, PAL activity in leaves or roots of JM-11 were more greatly influenced by Verticillium wilt compared with ZZM-2, ND-601; the crucial disease resistance substances and enzymes were lignin, total phenol and PAL for JM-11, total phenol for ZZM-2 and ND-601. (2) The lignin, total phenol contents and POD, PAL activities of JM-11 were more sensitive to root potassium than ND-601, but weaker than that of ZZM-2. The sensitivity of POD, PAL activities in functional leaves of JM-11 to potassium were more sensitive than ND-601 and ZZM-2. (3) The best effect of potash fertilizer for relieving disease index for JM-11, ZZM-2, ND-601 were 32.5%, 26.4%, 16.5%, and corresponding potassium application amounts were 290.5 kg·hm－2, 253.5 kg·hm－2 and 229.5 kg·hm－2, respectively. [Conclusion] Application of potassium could increase the resistance to Verticillium wilt and reduce the occurrence of cotton Verticillium wilt.     

陆地棉抗黄萎病性状的遗传及分子标记研究

 以陆地棉抗黄萎病品系常96和感病品种军棉1号为研究材料,构建了一个含有138个F₂单株的作图群体。利用强致病力菌株VD8对P₁、P₂、F₁、F_2：3群体进行营养钵接种,估算各世代的相对病指。应用主基因 多基因混合遗传模型分析得出该组合的最适遗传模型为C-0模型,即加性-显性-上位性多基因模型。对1998对SSR引物和230对SRAP引物进行筛选,获得148个SSR和6个SRAP多态性标记位点,进一步利用MAPMAKER作图软件,构建了一张含122个标记位点的陆陆杂种遗传连锁图。利用复合区间作图法在第9染色体NAU462-JESPR114区间内,检测到1个抗黄萎病QTL,可解释的表型变异为13.8%。