非洲猪瘟病毒亲核结构蛋白p1O可溶性表达及多克隆抗体制备

利用大肠埃希菌表达非洲猪瘟病毒(ASFV)亲核结构蛋白p10,IPTG诱导可表达可溶性重组蛋白p10,分子量约为30 ku.SDS-PAGE和Western blot鉴定结果表明,成功获得重组蛋白p10,且重组蛋白可与ASF阳性血清发生特异性反应.将纯化后的p10作为抗原免疫新西兰白兔,分离血清并分析其反应特异性.EL...     

非洲猪瘟病毒UBCv1的原核表达及多抗制备

[目的]为研究非洲猪瘟病毒(ASFV)泛素结合酶(UBCv1)的生物学功能及致病机制奠定基础.[方法]以p3XFLAG-CMV-7.1-I215L质粒为模板,利用PCR方法扩增非洲猪瘟病毒I215L基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a,构建pET-28a-I215L重组质粒,并将其转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达重组蛋白.重组蛋白经His柱层析纯化后免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,采用ELISA方法检测抗体效价,Western blot检测抗体特异性.[结果]成功构建了重组质粒pET-28a-I215L,重组菌经IPTG诱导后能够可溶性表达重组蛋白,产物约28 kDa,与预测大小一致.用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,ELISA测定抗体效价为1∶7290000;Western blot结果显示抗体具有较好的特异性.[结论]成功表达纯化了ASFV的泛素结合酶并制备其多克隆抗体,为后期解析ASFV泛素结合酶的结构、功能及病毒相关致病机制提供了重要的生物材料.     

基于p72蛋白的非洲猪瘟病毒抗体检测试纸研制

为了研制灵敏、准确、特异及稳定的非洲猪瘟抗体快速检测试纸产品,以非洲猪瘟病毒（ASFV）p72蛋白为检测抗原,以金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）为拦截线,对比重组蛋白p72的不同状态对试纸检测性能影响,优化标记条件、喷膜浓度、样品垫缓冲体系及成分、显色时间等因素,确定ASFV抗体检测试纸产品化的具体参数,并对试纸的特异性、均一性、准确性及稳定性进行鉴定。结果显示,试纸的检测敏感性为1∶51 200,优于商业化ASFV检测试剂盒,与其他猪源病毒阳性血清无交叉反应,变异系数小于10%,在临床样本检测中未见假阴性及假阳性结果,具有良好的敏感性、特异性、均一性及准确性;经加速稳定试验验证,可以室温保存1 a以上;与进口商品化试剂盒的总符合率为91.6%。综上,成功研制了ASFV抗体检测试纸,且试纸的检测性能良好,可以用于ASFV抗体的快速筛查。     

非洲猪瘟p62蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

为了获得非洲猪瘟(african swine fever virus, ASFV)p62蛋白进行血清学诊断技术研究。根据GenBank ASFV参考序列合成CP530R基因(编码p62蛋白),插入pET-32a(+)载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,SDS-PAGE及Western blot鉴定。采用Ni柱纯化p62蛋白,然后免疫Balb/c雌鼠,制备鼠抗ASFV p62蛋白的多克隆抗体,ELISA检测多抗效价。结果表明,成功构建了pET32a-p62质粒,表达蛋白为56.1 kDa,以包涵体表达为主。Western blot显示该蛋白能与ASFV阳性血清结合。Ni柱纯化获得p62蛋白浓度为2.9 mg/mL。用该蛋白免疫小鼠,三免后抗体效价达1∶256 000。表明表达蛋白具有良好抗原性,制备的p62多克隆抗体具有较高的反应性和特异性,为进一步研究p62蛋白的特性和诊断奠定基础。     

非洲猪瘟病毒沈阳分离株p30基因的克隆及其亲水区的原核表达

2018年中国首次发生了非洲猪瘟疫情。本研究从来源于沈阳地区的1个非洲猪瘟病毒(African swine fever vi?rus, ASFV)分离株中克隆了p30基因(GenBank No. MK482370)。序列分析发现,该基因与安徽分离株相同(GenBank No.MK128995),而与已报道的沈阳分离株SY-18株(GenBank No. MH766894)不同,新克隆的p30基因全长585 bp,编码194个氨基酸,而SY-18株p30基因全长606 bp,编码201个氨基酸。该结果提示,我国的ASFV存在基因变异或者传播来源复杂,流行病学分析应关注该基因,不同毒株的致病力有待深入研究。本研究利用pGEX-6p-1表达系统成功表达了p30基因的亲水区;通过Ni-NTA-琼脂糖亲和层析技术对重组蛋白进行纯化,获得了纯度较高的重组蛋白,为ASFV的血清学监测提供了抗原。     

兔出血症病毒衣壳蛋白VP60的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】构建兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因的原核表达载体,进行原核表达并制备其蛋白抗体。【方法】以保存的VP60基因的质粒(pTeasy-VP60)为模版,用PCR方法获得VP60基因,并将其克隆到pET28a(+)载体上,构建重组表达载体pET28a(+)-VP60,酶切鉴定和测序验证后转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,优化诱导表达时间和IPTG浓度;利用镍离子螯合层析纯化重组蛋白,并制备了高效价的抗VP60多克隆抗体。【结果】成功构建了兔出血症病毒衣壳蛋白VP60的原核表达质粒pET28a(+)-VP60,其在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达,重组蛋白分子质量为60 ku,制备的多克隆抗体具有较强的免疫结合活性。【结论】成功实现了VP60基因的原核表达,制备了重组蛋白VP60的多克隆抗体,为进一步的VP60转基因研究奠定了基础。     

鹅源新城疫病毒M基因的原核表达及其多克隆抗体制备

试验旨在制备原核表达鹅源新城疫病毒(NDV)JS/5/05/Go株M蛋白的多克隆抗体并进行鉴定。以鹅源NDV总RNA为模板,RT-PCR扩增M基因,亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)获得重组质粒pET32a-M,转化E.coli BL21(DE3)菌株进行诱导表达,SDS-PAGE电泳检测表达产物;用KCl染色切胶纯化法纯化重组蛋白;采用切胶免疫小鼠的方法制备M蛋白多克隆抗体,抗体效价用间接ELISA检测,特异性用Western blot和间接免疫荧光法鉴定。结果表明,在大肠杆菌中成功表达了分子量约为55 000的重组蛋白,用切胶纯化法获得了纯度较高的重组蛋白;ELISA法检测抗体效价可达1∶102 400,Western blot和间接免疫荧光试验结果表明制备的多克隆抗体能够特异性识别纯化的M蛋白及NDV自身表达的M蛋白。     

乌鳢水泡病毒L蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

为研究L蛋白在乌鳢水泡病毒(snakehead vesiculovirus, SHVV)增殖过程中发挥的作用,扩增SHVV L基因的前900个碱基,将其克隆到载体pET-32a(+)中,构建原核表达质粒pET32a-L,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。设置不同温度、IPTG浓度及诱导时间,选择最佳的表达条件。通过NI-NTA亲和层析柱纯化蛋白,并利用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。用Western blot鉴定抗体特异性,间接免疫荧光观察L蛋白在SHVV感染斑点叉尾鮰卵巢细胞(channel catfish ovary, CCO)中的定位情况。结果显示,纯化的L蛋白分子质量约42 ku,与预期大小相符。制备的L蛋白多克隆抗体可以与L蛋白发生特异性免疫反应,且L蛋白主要定位在细胞质,表明L蛋白多克隆抗体制备成功。     

猪源IKKγ在原核和真核表达系统中的表达及其多克隆抗体制备

[目的]制备猪源IKKγ多克隆抗体,为进一步研究IKKγ蛋白生物学特性及揭示IKKγ蛋白与猪瘟病毒(CSFV)间相互作用机制打下基础.[方法]利用RT-PCR从猪肾细胞(PK-15)中克隆原核表达的IKKγ基因功能片段(561 bp),与原核表达载体pET-32a(+)构建原核重组质粒pET-IKKγ,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后进行IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经纯化和浓缩后,免疫小鼠制备猪源IKKγ多克隆抗体.同时克隆IKKγ基因全长序列(1356 bp),与真核表达载体pCMV-HA构建真核重组质粒pCMV-HA-IKKγ,分别转染293T细胞和PK-15细胞,检测融合蛋白表达情况.[结果]以原核重组质粒pET-IKKγ转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导能表达出约40 kD的融合蛋白,且融合蛋白主要以可溶性蛋白形式进行表达,可通过Ni-NTA亲和层析柱进行纯化,已获得较高纯度的融合蛋白IKKγ.构建的真核重组质粒pCMV-HA-IKKγ能在293T细胞中成功表达出IKKγ蛋白;制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体能与293T细胞表达融合蛋白IKKγ发生特异性反应,其抗体效价为1:16000,与PK-15细胞表达IKKγ蛋白也具有良好的反应性,其中CSFV感染后36 h是IKKγ蛋白表达高峰期.此外,制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体能在PK-15细胞中成功检测到IKKγ蛋白,说明猪源IKKγ多克隆抗体与真核细胞瞬时表达的IKKγ蛋白特异性良好.[结论]制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体具有效价高、特异性强等特点,可用于检测CSFV感染PK-15细胞中IKKγ蛋白表达水平,为下一步研究IKKγ蛋白生物学特性及揭示NF-κB信号通路转录调节功能机制提供技术支持.     

猪Jiv基因的克隆表达与多克隆抗体制备

【目的】克隆猪Jiv蛋白核心区的2 112bp的基因片段,构建其原核表达载体后进行蛋白的表达和纯化,制备抗猪Jiv蛋白的多克隆抗体。【方法】利用RT-PCR方法,从猪脾脏组织RNA中扩增得到猪Jiv基因,将其克隆到pMD19-T载体并测序,以此为基础构建原核表达载体pET32a-Jiv,转化E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中,利用IPTG诱导表达,获得大量包涵体形式的猪Jiv融合蛋白。通过镍离子螯合层析柱对表达的目的蛋白进行纯化,对纯化后的包涵体蛋白进行透析复性,以每只新西兰白兔400μg蛋白的初次免疫剂量和500μg蛋白的加强免疫剂量进行免疫,共免疫5次,采集血清,采用间接ELISA法检测抗体效价达到一定水平后,收集抗体,利用Western blot检测抗体特异性。【结果】克隆得到长度为2 112bp的猪Jiv基因片段;构建的pET32a-Jiv在E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中经诱导后高效表达,SDS-PAGE结果显示,纯化得到分子质量约为95ku的猪Jiv融合蛋白;测得的猪Jiv蛋白多克隆抗体效价达1∶6 400;Western blot检测结果证实,所获得抗体能够有效地应用于猪Jiv蛋白抗原的检测。【结论】成功地克隆了猪Jiv基因,制备了抗猪Jiv蛋白的多克隆抗体。     

鸡IL-18成熟蛋白基因原核表达载体的构建及多克隆抗体的制备

应用RT-PCR技术得到鸡IL-18成熟蛋白基因(chicken mature interleukin-18),将克隆片段与原核表达载体pET28a+连接,构建了重组表达载体pET28a+-ChMIL18,转化至大肠杆菌BL21感受态细胞,获得重组表达菌株。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析后,用含有融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳颗粒免疫家兔,制备兔抗鸡IL-18多克隆抗体,Western-Blot检测抗体效价和特异性。结果表明,鸡IL-18在BL21中得到了表达,相对分子质量约为23kD,获得了具有较高效价的特异性多克隆抗体。为进一步研究鸡IL-18成熟蛋白的生物学活性和作用机制奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体制备、鉴定及阻断ELISA方法的建立

【背景】非洲猪瘟（ASF）于2018年8月在中国首次出现,对养猪业造成了巨大危害,损失惨重。目前尚无安全有效的疫苗用来预防ASF,于是建立快速特异的检测方法对于防控ASF提供了有效的手段。【目的】制备非洲猪瘟病毒（ASFV）特异性单克隆抗体,建立ASF快速特异性的检测方法。为ASF的检测和防控提供借鉴技术手段。【方法】构建表达载体pET-28a-P30,通过原核表达系统获得ASFV P30重组蛋白,以纯化的P30蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合和细胞亚克隆制备出ASFV P30蛋白特异性杂交瘤细胞株;对P30蛋白进行截短表达,利用Western Blot和间接酶联免疫吸附试验（iELISA）鉴定单克隆抗体所对应的抗原表位;并利用制备的单克隆抗体建立非洲猪瘟阻断ELISA抗体检测方法。【结果】通过双酶切和PCR验证,结果显示构建出重组载体pET-28a-P30,经测序其序列未发生突变;IPTG诱导后,P30重组蛋白主要表达在包涵体中,分子量约为33 kD。纯化的P30蛋白与弗氏佐剂1﹕1混合免疫小鼠,3次免疫后,小鼠血清效价达到1﹕102 400,说明表达的蛋白具有良好的免疫原性。经细胞融合和亚克隆,获得8株P30蛋白特异性杂交瘤细胞,Western Blot和间接免疫荧光试验（IFA）检测获得的8株单抗均具有良好的反应性。叠加试验显示8株单克隆抗体均针对相同的抗原位点;截短表达P30蛋白不同片段,选取制备的2-12B单克隆抗体与不同的截短P30蛋白反应,显示单克隆抗体的抗原表位区为187—194aa。利用2-12B单克隆抗体并经过条件优化,成功建立了ASF阻断ELISA抗体检测方法,检测了190份临床样品,并与商品化非洲猪瘟ELISA抗体检测试剂盒进行对比,两方法阳性符合率为90.91%,总符合率为96.32%。【结论】本研究成功获得ASFV P30蛋白,经过iELISA、Western Blot和IFA筛选出反应性良好的特异性单克隆抗体8株,抗原识别表位区为187—194aa。并利用制备的单克隆抗体建立了特异性高,敏感性好的ASFV阻断ELISA抗体检测方法,为ASF的检测及其防控提供了手段和支撑。     

马铃薯卷叶病毒衣壳蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

本研究克隆马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)衣壳蛋白(Coat Protein,CP)基因,改造其密码子,使其偏好原核表达,构建pCzn1-PLRV CP重组表达载体,通过大肠杆菌表达纯化,经Western Blot方法鉴定为PLRV CP蛋白,纯化后的蛋白免疫日本大耳兔,成功制备PLRV CP蛋白多克隆抗体,识别重组蛋白效价为128000倍,识别PLRV叶片的效价为32000倍,经Western Blot方法分析,其特异性良好.本研究为PLRV检测方法的建立及脱毒种薯的检测提供了必需的生物材料.     

马铃薯M病毒衣壳蛋白原核表达和多克隆抗体制备

本研究利用RT-PCR技术从发病马铃薯植株叶片中克隆马铃薯M病毒(Potato virus M,PVM)的衣壳蛋白全长基因,该基因由912个碱基组成。将其亚克隆到表达载体pET-28b(+)中后,转化大肠杆菌菌株Rosetta。经IPTG诱导处理后,获得的重组蛋白大小约为33 kDa,与预期大小一致。经镍离子亲和层析纯化后免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体,免疫4次后多抗血清效价为1∶64 000。经ELISA和Western blot分析表明,多克隆抗体能够特异性的识别PVM。PVM多克隆抗体的制备为PVM快速检测方法的建立奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体制备及线性抗原表位定位

【目的】制备非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）p30蛋白的单克隆抗体（monoclonal antibodies,MAbs）并初步分析其所识别的线性抗原表位,为ASFV及其抗体检测方法的建立及p30蛋白结构和功能的研究奠定基础。【方法】将原核表达并纯化的p30重组蛋白作为免疫原,免疫6—8周龄BALB/c雌鼠,每两周免疫1次,共免疫3次,首次免疫是抗原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后免疫,第二次和第三次免疫与等体积的弗氏不完全佐剂乳化,3次免疫后1 w断尾采血,间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清抗体效价,选择血清效价最高的小鼠进行加强免疫,3 d后取小鼠脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按照4﹕1的比例使用PEG进行常规细胞融合。利用重组p30蛋白作为包被抗原,间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,有限稀释法进行克隆纯化,直至筛出能够稳定分泌抗体的MAbs。将ASFV接种于猪肺泡巨噬细胞,以筛选的MAbs为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗,进行间接免疫荧光试验（IFA）。将感染和未感染ASFV的细胞沉淀处理后进行 SDS-PAGE并转印至硝酸纤维素膜,分别以IFA鉴定为阳性的MAbs上清为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗,进行Western blotting分析,筛选获得p30 MAbs。根据已知序列设计引物扩增p30ab与p30bc两段截短基因,其中p30ab代表由第86—153位氨基酸残基的截短体,p30bc代表由第120—187位氨基酸残基的截短体,原核表达部分重叠的截短p30蛋白,最终获得重组蛋白GST-p30ab与重组蛋白GST-p30bc。分别以GST-p30ab和GST-p30bc融合蛋白为包被抗原,以5株MAbs为一抗,以兔抗鼠HRP-IgG为二抗, 通过间接ELISA方法初步定位p30蛋白的抗原表位。【结果】以纯化的重组蛋白为包被抗原,经间接ELISA试验筛选出25株可分泌抗重组 p30蛋白的杂交瘤细胞株。IFA结果显示,5株MAbs（8F4、1D3、1H2、6C3和8E11）与ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞IFA 试验呈阳性;Western blotting结果显示,5株MAbs均能够与ASFV感染的细胞呈阳性反应,与未感染病毒的细胞呈阴性反应。试验构建的p30截短体重组蛋白GST-p30ab以可溶和包涵体两种形式表达,而GST-p30bc仅以包涵体形式表达,以两组截短体融合蛋白为包被抗原,通过间接ELISA检测出MAbs 8F4、1H2和6C3与两个重组蛋白均能有效结合,证明MAbs 8F4、1H2和6C3抗原识别区域为两组截短蛋白重叠区域,即第120—153位氨基酸;MAbs 8E11与1D3则只能与GST-p30ab蛋白结合, 证明MAbs 8E11与1D3抗原识别区域为两个重组蛋白的非重叠区域,即第86—119位氨基酸。【结论】本研究可溶性地表达了p30蛋白的第86—153位氨基酸截短体重组蛋白,制备了5株p30 MAbs,定位到2个p30蛋白抗原表位。结合ELISA和IFA,可建立十分可靠的ASFV及其抗体的检测手段。     

BLCAP蛋白原核表达及其多克隆抗体制备

目的:利用原核表达系统表达BLCAP融合蛋白并制备其多克隆抗体。方法:构建原核表达重组质粒pET32a( )-BLCAP并转化到宿主菌BL21中,通过IPTG诱导表达并采用亲和层析的方法纯化和SDS-PAGE鉴定后免疫日本大耳白兔,制备BLCAP蛋白多克隆抗体并检测其特异性。结果:经过IPTG诱导,获得分子量大小约为28ku的融合蛋白,用纯化得到的融合蛋白免疫日本大耳白兔后得到抗BLCAP蛋白的多克隆抗体,通过Western blot检测证明该抗体能够与BLCAP融合蛋白发生特异性结合。结论:重组质粒表达的BLCAP融合蛋白具有良好的抗原性,制备的抗BLCAP的多克隆抗体特异性较好,为今后进一步研究BLCAP蛋白性质与功能奠定了基础。     

原核表达c-myc蛋白的多克隆抗体制备

探讨利用小鼠制备抗人c—myc蛋白多克隆抗体的方法。利用含PET28a／c—myc质粒的EcoliBL21,对c—myc蛋白进行原核表达,并进行纯化。WesternBlot结果只出现一条62KDa大小的特异性目的蛋白条带。用原核表达的c—myc蛋白抗原免疫5只Balb／c小鼠,最终免疫后的第7d采血,并对其血清效价进行ELISA（Enzyme—linked immunosorbnent assay）测定,抗血清达1：640000。本实验结果为c—myc单克隆抗体制备和肿瘤诊断试剂盒的研发提供基础实验数据。     

恶性疟原虫3D7株AP核酸内切酶的原核表达及多克隆抗体的制备

为研究恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)3D7株AP核酸内切酶(AP endonuclease)的功能,通过PCR的方法扩增PF3D7_0305600(292~1 137 bp),构建克隆载体。测序正确后,将该片段插入到pET-28a和p GEX-4T-1,构建重组表达载体p ET-28a-Ae、p GEX-4T-1-Ae。将表达载体转入BL21-Codon Plus表达重组蛋白r-Ae-His和r-Ae-GST,经SDS-PAGE和Western blot鉴定,r-Ae-His免疫家兔制备多克隆抗体,并用ELISA检测抗血清效价,Western blot检测抗体特异性。结果表明:表达的r-Ae-His分子量约为39 ku,r-Ae-GST分子量约为60 ku。制备的多克隆抗体能够特异性地识别天然蛋白,可用于恶性疟原虫3D7株AP核酸内切酶的后续研究。     

大鲵虹彩病毒主要衣壳蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

根据大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus,GSIV)主要衣壳蛋白(Major Capsid Protein,MCP)基因设计引物,PCR扩增得到MCP基因编码框全长序列1 392 bp,将其克隆到原核表达载体p ET-32a中,构建了重组原核表达载体p ET-32a-MCP,并在大肠杆菌BL21中得到了表达,融合表达的重组蛋白分子量约为70 ku,与预期大小一致,主要以包涵体的形式存在。对IPTG浓度,诱导温度等诱导表达条件进行优化,确定0.5 mmol/L的IPTG于37℃的条件下诱导6 h重组蛋白的表达量最佳。纯化GSIVMCP重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备了GSIV-MCP多克隆抗体,ELISA检测抗体效价大于1∶50 000。Western blot检测显示该抗体可以特异性识别重组蛋白。间接荧光免疫结果表明,该多克隆抗体可与由GSIV感染引起细胞病变的EPC细胞(GICB)发生特异性的结合。研究为建立GSIV免疫诊断方法以及为研究GSIV MCP基因编码蛋白的功能奠定了前期基础。