葡萄根癌病菌的快速检测技术

根据葡萄根癌病菌核糖体基因间隔片段(16S-23S Ribosomal DNA Intergenic Spacer,ITS)特异区域设计,合成了一对引物,建立了快速检测葡萄根癌病菌的PCR方法,并对反应条件进行优化,组装成快速检测试剂盒。结果表明:只有葡萄根癌病菌能扩增出大小为758 bp的特异性条带,而非葡萄根癌病菌均未能扩增出任何条带。检测灵敏度达10个细菌/μL左右,且稳定性好,经多次反复冻融,扩增条带未发现有明显变化。通过对田间病样进行检测,证实该试剂盒具有操作简便、快速(4 h左右完成检测)、灵敏度高、特异性强、重复性和稳定性好等优点。     

香菇菌株ITS序列分子检测

根据真菌核糖体通用引物ITS1和ITS4扩增出13个福建袋栽香菇主要菌株的ITS、5．8srDNA序列,将该序列提交NCBI中Genbank数据库,并根据该序列特征及ITS区的差异性,分别设计出针对菌株L9015和菌株Cr02进行PCR检测的特异引物探针,结果显示特异引物具有良好的特异性。     

杧果露水斑病病原菌枝状枝孢霉的巢氏PCR检测方法的建立

【目的】杧果露水斑病是当前生产上影响杧果产业的重要病害之一,因潜伏期长常在发病初期不易被察觉而错过防治适期,建立其主要致病菌Cladosporium cladosporioides的快速准确检测方法,对于该病的早期诊断和及时防控尤为重要。【方法】将该病菌的ITS序列与NCBI中的数据大量比对后,在差异位点大的区域设计了8对引物,通过筛选获得两对特异性良好的引物及其扩增条件。【结果】两对特异性引物分别是ML-SF9/ML-SR5和ML-SF10/ML-SR10,扩增条件:94℃4 min;94℃45 s,65℃45 s,72℃1 min,36周;72℃10 min,特异条带大小分别为408 bp和424 bp。为了提高检测的灵敏度,又与真菌通用引物ITS1/ITS4结合后,建立了杧果露水斑病病原菌的两套巢式PCR快速检测体系,可检测病菌DNA的含量最低为3.55×10-9ng·μL-1,比常规PCR灵敏度提高了1万倍,且能实现对潜伏期果实的特异性检测。【结论】此技术操作简单、特异性强、灵敏度高,为杧果露水斑病的早期诊断提供了新方法。     

进境西葫芦种子蔓枯病菌的分离与鉴定

为了检测进境植物种子中携带的病原真菌,对一批籽粒颜色不正常的意大利西葫芦(Cucurbita pepo L.)种子进行了病原菌分离、致病性测定、PCR检测及rDNA ITS序列分析。结果表明,在种子样品中分离到1株疑似蔓枯病菌Phoma cucurbitacearum的分离物ZuSc-1,分离物ZuSc-1在PDA培养基上菌落圆形,背面初期白色,后期变为灰黑色,菌落表面略隆起,不形成子囊座和分生孢子器。该分离物人工接种西葫芦胚根产生蔓枯病的典型症状。特异性引物DB17F/DB17R扩增分离物ZuSc-1的DNA得到预期556 bp的产物,分离物rDNA ITS序列与蔓枯病菌(序列号EU167573、GU045304和AY293804)的序列相似性为100%。根据分离菌株形态学特征、致病性测定、PCR检测及rDNA ITS序列分析,将该菌株鉴定为瓜类黑腐球壳菌Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm,其无性型为Phoma cucurbitacearum(Fr.:Fr.)Sacc.。     

红掌组培变异株的特异DNA片段分析

利用ISSR引物对红掌亲本及其组织培养后代的形态变异株进行2次PCR扩增分析,回收特异DNA片段,测定其扩增产物的基因序列,并用BLAST方法进行同源性分析。结果表明:变异株的基因组特异DNA片段为680 bp,在核酸和蛋白质水平均没有发现同源性较高的基因或蛋白质,说明红掌在组织培养过程中可能产生新的遗传重组,出现新的基因型。     

核桃早实性相关性状的SCAR标记

用RAPD技术对新疆核桃早实特性的分子标记进行了研究。用180个10-mer随机引物分别扩增早实和晚实近等基因池DNA筛选出5个多态性引物,结果只有引物OPG15(5′-ACTGGGACTC-3′)扩增得到1条约710bp的早实核桃特异片段。对该片段进行克隆和序列分析,并根据序列分析结果将该RAPD标记转化为重复性和特异性更好的SCAR标记。研究设计出了1对早实核桃特异SCAR引物P1(5'-ACTGGGACTCCAATTGTATC-3')和P2(5'-ACTGGGACTCTCAACTAT-3'),用这对特异引物对14份材料进行PCR扩增,结果所有晚实核桃材料无任何扩增,但早实材料均扩增出了预期大小759bp的特异带。     

岩陀ITS2片段PCR扩增条件优化及物种鉴别研究

以岩陀植物叶片为材料,利用试剂盒提取方法提取植物叶片中的DNA,对ITS2序列进行PCR扩增条件优化并对ITS2序列鉴别物种能力进行考察;通过单因素实验分别研究退火温度、DNA模板量、循环次数等因素对岩陀DNA条形码鉴别中所选的ITS2序列扩增反应的影响,并对扩增体系进行优化,采用Seqman7.1软件对测序峰图进行校对拼接,应用MEGA计算种内种间遗传距离,采用邻接法(neighbor-joining,NJ)构建系统发育树;结果表明:优化后的PCR扩增反应体系总体积为25μL,含TaqPCR Master Mix 12.5μL、DNA模板量5ng、上下游引物(10mol/L)各1μL、dd H2O 9.5μL,ITS2序列在退火温度设置为60℃,循环次数为30次的条件下进行PCR扩增,获得清晰单一的电泳条带,ITS2测序成功率100%,比对后的序列长度475bp,GC含量约50%,种内种间变异存在重叠,没有明显的Barcoding gap;结论:通过试剂盒提取岩陀植物叶片DNA,在优化后的PCR扩增反应体系对ITS2序列进行扩增,可以满足后续对鬼灯檠属多基原植物岩陀的亲缘关系、物种鉴别和遗传多样性等领域的研究,但ITS2序列不适合岩陀种DNA条形码鉴别。     

双孢蘑菇褐腐病病原菌的分离及分子鉴定

对引起双孢蘑菇(Agaricus bisporus)褐腐病的病原菌进行分离和分子鉴定.分离培养褐腐病病原菌,采用CTAB法抽提其基因组总DNA,利用真菌通用引物ITS1和ITS4扩增菌株rDNA ITS区序列,扩增产物纯化后克隆转化至大肠杆菌,挑选克隆成功的菌株进行测序.测序结果在GenBank中进行同源性搜索,并下载部分具有代表性种的ITS序列,利用软件MEGA4 构建分子系统发育树,通过序列分析,鉴定出引起双孢蘑菇褐腐病的病原菌为Mycogone perniciosa.     

不同地区松茸ITS序列分析及系统发育研究

对吉林省延吉市和云南省昆明市松茸子实体的ITS序列进行遗传多样性研究。提取两个地区松茸子实体的基因组DNA,应用特异引物对其ITS序列进行PCR扩增及测序,并对云南省昆明市松茸样品进行克隆及测序。之后从GenBank上获取5个地区7条松茸ITS序列,并利用MEGA、BLAST、DNAMAN和ClustalX软件进行对比分析和构建系统发育树。对云南松茸样品克隆发现,ITS序列中有A与G、T与c的颠换,并插入1个碱基T。序列对比发现,松茸ITS序列长度在600bp～604bp范围内,G＋C含量在43．0％～44．2％之间,共有41个变异位点,ITS2变异位点数要多于ITSl的变异位点数。同时,多个位点存在着转换、颠换、插入和缺失,表明不同产地松茸ITS序列在进化过程中存在差异,为真菌分类、鉴定等研究提供了重要的资料和依据。     

接头连接介导的PCR 扩增马铃薯抗晚疫病基因侧翼序列研究

利用接头连接介导的PCR 技术，以前期NBS profiling 试验获得的1 条马铃薯抗晚疫病基因
片段为基础，设计巢式基因特异性引物，扩增获得两侧序列。结果表明：基因组DNA 经DraⅠ酶切后，
在已有536 bp 片段的左侧和右侧均得到序列延伸，右侧扩增得到2 301 bp，左侧扩增得到820 bp，去除
边界序列后，向左延伸789 bp，向右延伸2 273 bp，拼接后共长3 443 bp。采用GENSCAN 进行基因预测，
发现包含内含子在内的晚疫病抗性基因全长2 413 bp，在该预测基因 的UTR 区域设计特异性引物，在马
铃薯抗病和感病的基因型中扩增包含完整基因在内的2 571 bp 序列，发现该特异候选基因与晚疫病抗性相
连锁。     

安祖花细菌性疫病的Nested-PCR检测

根据基因库中已发表的安祖花细菌性疫病致病菌粉黛黄单胞杆菌（Xanthomonas campestris pv.dieffenbachiae）基因序列设计引物XcF1/XcR1、XcF2/XcR2,通过扩增条件优化,建立了安祖花细菌性疫病的Nested-PCR检测方法,可以直接从感染细菌性疫病的安祖花组织DNA中扩增出1...     

不同红掌品种在组培生产上的差异表现

以"亚利桑那"、"阿拉巴马"、"粉冠军"3个红掌品种根茎、叶柄、叶片为外植体,研究比较了3个品种的外植体诱导、继代增殖、生根培养的差异表现。结果表明:根茎诱导无菌芽成功率为86.9～90.0%,叶片诱导愈伤组织成功率为80%～84%,叶柄诱导愈伤组织成功率为64%～68%,根茎一般较难诱导出愈伤组织;不同品种的红掌增殖继代的增殖倍率不同,"粉冠军"最高为6.8,其次为"亚利桑那"5.8,"阿拉巴马"为3.8。红掌的生根较易,不同品种的红掌生根率均可达到95%以上。     

红掌查尔酮异构酶基因的克隆与表达分析

以红掌栽培品种‘Dakota’为材料,采用RACE技术克隆获得AnCHI基因的cDNA序列,分析花青素含量与该基因表达的关系,进一步完善红掌花青素合成途径。结果表明：AnCHI序列全长为1 117 bp,其中开放阅读框为777 bp,编码258个氨基酸;AnCHI在不同时期红掌佛焰苞以及根、茎、叶、肉穗组织中均有表达,且在佛焰苞发育前期表达量明显高于后期,测得花青素含量与基因表达量变化基本一致;构建的pGEX-4T1-AnCHI重组表达载体在原核中正确表达。初步验证了AnCHI的表达可能对红掌佛焰苞花青素的合成有一定促进作用。     

红掌炭疽病病原的分离鉴定及其核糖体DNA2ITS序列分析

 在广州、南京和扬州等地红掌病株上分离的炭疽菌中存在形态差异明显的两个群体。各选取两个代表菌株进行形态特征、致病性、寄主范围鉴定及核糖体DNA ITS序列分析。结果表明,红掌炭疽病病株上有两种致病菌：胶孢炭疽和毁灭炭疽,后者导致红掌炭疽病为首次报道。     

红掌新品种‘双冠红掌’

‘双冠红掌’是以‘粉冠军’为母本,‘橙冠军’为父本杂交育成的盆花新品种。平均株高45.5 cm,冠幅60.5 cm。叶片卵形,平均长20.4 cm,宽11.3 cm。佛焰苞略高于叶,平均长10.8 cm,宽7.2 cm,红色。肉穗花序内弯,平均长3.2 cm,橙黄色。从组培苗出瓶至成品花约18个月。     

红掌愈伤组织和再生团块发育过程中糖和蛋白质的组织化学研究

以红掌叶片诱导出的4类愈伤组织和气生根根段诱导的再生团块为试材,研究糖和蛋白质在愈伤组织衰老与再生团块发生发育过程中的变化。经石蜡切片PAS和汞溴酚兰组织化学染色观察发现,糖主要以颗粒状存在于愈伤组织细胞中,并有明显的围绕核的现象,蛋白质主要集中于细胞核及其周围。糖和蛋白质的含量在黄绿愈伤组织中有明显的从外向内减少的梯度变化;深绿愈伤组织中梯度不太明显。糖在金黄色愈伤组织中含量很低,没有梯度;在褐色愈伤组织中散乱分布。蛋白质含量变化在金黄色愈伤组织中由外层细胞向内层细胞有一定的梯度但不明显;在褐色愈伤组织中没有梯度。刚形成的再生团块的糖和蛋白质含量在由外向内的细胞中有明显的梯度变化,在再生团块膨大生长过程中两者含量少,没有梯度变化。分化期再生团块中的糖主要集中在分裂旺盛的分生细胞团和维管组织周围,蛋白质则集中于分生细胞团的细胞中。在各类愈伤组织和再生团块中均出现各种特化细胞。糖的含量及其梯度变化是愈伤组织和再生团块分化的重要内在条件,蛋白质含量以及核形态是否完整是愈伤组织和再生团块分化的关键。     

红掌苗期施肥试验研究

试验初步探索了5种不同类型的肥料施用对红掌苗期生长的影响,旨在为红掌苗期的科学施肥提供理论依据。结果表明:处理D对红掌苗期生长的叶片数、株高、最大叶片叶长及最大叶片叶宽4个指标综合效果最佳,处理E、C次之,处理B和A表现最差。     

红掌叶片愈伤组织和气生根再生团块的细胞学研

 对红掌叶片诱导产生的3种愈伤组织和气生根再生团块的形成、不定芽的分化发育过程进行了显微观察。结果表明: 黄绿、黄和褐色3种愈伤组织的细胞核质比依次减小, 细胞排列越来越疏松, 细胞质变稀薄, 细胞形态变得不完整, 其中黄色和褐色愈伤组织出现类似凋亡小体的小泡, 细胞最终凋亡。叶片气生根的形态发生为间接器官发生方式, 再生团块由气生根根段切口的皮层细胞分裂分化而来。再生团块内部有大量的密集小细胞团, 细胞分裂旺盛, 为分化的原始组织, 以后逐渐分化为不定芽, 形态发生以间接器官发生方式为主, 也有少量胚状体发生方式, 小细胞团是分化产生不定芽的基础。芽的分化发生方式属内起源, 随着小细胞团的不断生长, 外层细胞逐渐凋亡, 最终使分化的芽突出再生团块再生成苗。     

红掌组织培养过程中外植体褐变的研究

在红掌组织培养过程中,外植体易发生褐变,严重阻碍了红掌组织培养的正常进行。现以红掌‘红粉佳人’(Anthuriumandraeanum cv.Sonate)品种为试材,取健康植株幼嫩叶片为外植体,对其愈伤组织培养过程中褐变现象进行研究。研究不同抗氧化剂、吸附剂(柠檬酸、抗坏血酸VC、叶酸、聚乙烯吡咯烷酮PVP、活性碳AC)以及不同培养基硬度的防褐化效果。结果表明:使用硬度为5 g/L琼脂的MS培养基,并添加6-BA1.0 mg/L+2,4-D0.2 mg/L+聚乙烯吡咯烷酮(PVP)0.2%可有效控制褐变并获得较高的愈伤诱导率。