番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因原核表达蛋白的抗血清制备及其检测应用

 以受番木瓜环斑病毒（Papaya ring spot virus,PRSV）侵染的番木瓜（Carica papaya）叶片为供试材料,采用RT-PCR 方法克隆其外壳蛋白基因cp,并将其连接到原核表达载体pET-28b（+）上,酶切鉴定及克隆测序确定开放阅读框的正确性,将获得的重组质粒转化大肠杆菌表达宿主菌。通过摸索转化的表达宿主菌种类、IPTG 浓度及诱导时间,获得高效表达PRSV cp 的条件。SDS-PAGE 分析结果表明,CP 融合蛋白分子量为36.8 kD。以Ni2+-NTA 亲和层析柱纯化的融合蛋白为抗原,免疫注射新西兰大白兔制备得到高效价抗体,间接ELISA 测定效价为1︰16 384。Western blot 检测结果表明,制备的抗血清可与诱导表达的融合蛋白发生特异性反应。通过ID-ELISA 检测田间样品证实了制备的抗血清与PRSV 侵染病叶发生了良好的特异性反应。本试验为PRSV 的快速检测以及PRSV 编码蛋白的功能研究奠定了基础。     

番木瓜PRSV和PLDMV复合侵染中呈中性互作

商业化的抗番木瓜环斑病毒（papayaringspotvirus,PRSV）的转基因番木瓜品种‘华农1号’的应用成功控制了华南地区该毁灭性病毒。然而近年来在广东和海南的一些转基因或非转基因植株上发现了另一种具有严重危害的病毒——番木瓜畸形花叶病毒（papayaleafdistortionmosaicvirus,PLDMV）。为了明确这两种病毒在番木瓜上的相互关系,通过人工接种分析二者在转基因和非转基因番木瓜上的侵染率、症状、细胞病理变化以及病毒积累量等特征。结果表明,‘华农1号’对PRSV有很强的抗性,但对PLDMV却高度感病,且PLDMV并不能协助PRSV克服转基因番木瓜对其的抗性;两种病毒单独侵染和复合侵染非转基因番木瓜均能引致严重的症状,二者症状无明显差异。细胞病理学分析表明,病毒侵染后叶片叶绿体萎缩且排列不紧凑,复合侵染并未对叶肉细胞造成更为严重的损害。接种PRSV的转基因番木瓜15d后PRSV积累量逐渐减少,直至检测不到;而接种PLDMV后其积累量逐渐升高并保持在一个较高的水平。在转基因和非转基因番木瓜上,PRSV的积累量始终低于PLDMV,在非转基因番木瓜上,两种病毒长期共...     

甘蔗黄叶病毒P0基因的克隆与原核表达及抗血清制备

根据已发表ScYLV-P0基因系列设计特异性引物,应用RT-PCR技术从甘蔗病叶的mRNA扩增得到目的DNA片段.以pET32a（＋）为原核表达载体,构建重组表达质粒pET32a-P0.经过双酶切鉴定和DNA测序后,将重组表达质粒转入大肠杆菌BL21 （DE3）pLySs,在30℃培养条件下IPTG诱导表达.通过SDS-PAGE电泳检测融合蛋白表达情况.表达结果显示,在该表达系统中,融合表达蛋白P0是以包涵体形式的蛋白存在;P0融合蛋白大小约45kDa,与P0开放阅读框的理论推算值29.991 kDa加上载体自身蛋白约18 kDa相符,用Ni2＋-NTA琼脂糖亲和层析纯化融合蛋白,免疫家兔制备出抗血清,通过酶联法（ID-ELISA）测定本实验制备的ScYLY-P0抗血清工作浓度为1：25000.     

番木瓜环斑病毒甜瓜分离物的基因组及其侵染性克隆

番木瓜环斑病毒（papaya ringspot virus,PRSV）是瓜类作物主要病毒之一,分析了甜瓜分离物HaNHK10的基因组序列和分子变异,构建了具有侵染性的全长cDNA克隆。结果显示,HaNHK10分离物基因组全长为10 332 nt,与其他分离物的核苷酸和氨基酸序列一致性分别为74.60%～97.80%和85.30%～98.50%。基于全基因组序列的系统进化分析显示,HaNHK10与来自中国的所有分离物均聚集于II组中,并与中国山东的西葫芦分离物PRSV-SD亲缘关系最近。接种试验显示,HaNHK10分离物的全长cDNA克隆具有侵染性,它能系统侵染甜瓜、黄瓜、西瓜、南瓜、西葫芦和瓠瓜6种作物,经接种产生的病毒后代也能够通过摩擦接种侵染植株。     

切花月季ACC合成酶基因的克隆和原核表达

克隆了与伤害诱导相关的Rh-ACS1和与花朵开放进程及乙烯诱导相关的Rh-ACS3基因全长。结果表明,Rh-ACS1基因全长为2 132 bp,开放阅读框（ORF）长度为1 476 bp,推定编码491个氨基酸。Rh-ACS3基因的全长1 734 bp,ORF长度为1 545 bp,推定编码514个氨基酸。对这两个基因编码的蛋白进行原核表达分析,结果显示,在37 ℃条件下,0.6 mmol · L-1 IPTG诱导3 h后,携带Rh-ACS1 ORF和Rh-ACS3 ORF的原核表达载体分别在大肠杆菌中诱导生成了大量分子量约为70和60 kD的蛋白质,其大小与根据基因序列预测的理论值相一致。     

苹果褪绿叶斑病毒外壳蛋白基因的原核表达及抗血清制备

【目的】为了制备苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)的抗血清,【方法】将ACLSV外壳蛋白(Coat protein,CP)基因克隆到原核表达载体pEHISTEV和pEHISEGFPTEV,转化大肠杆菌Rosetta,切胶回收诱导表达的CP融合蛋白免疫新西兰长耳兔,制备ACLSV的抗血清。【结果】利用原核表达载体pEHISTEV和pE-HISEGFPTEV在Rosetta中分别表达出了分子质量为25 ku和55 ku的ACLSV CP融合蛋白。切胶回收25 ku的融合蛋白免疫新西兰长耳兔。经ELISA测定,所制备的抗血清效价为1∶1 024,Western blot及组织印迹分析表明抗血清能与ACLSV CP发生特异性的免疫反应。【结论】该血清特异性强,效价高,可用于苹果叶片、果实和枝条等样品中A-CLSV的检测。     

苹果AFS基因的克隆与原核表达

 通过RT-PCR扩增到苹果α - 法尼烯合成酶(α-Farnesene Synthase, AFS) 基因的编码区全长,将其克隆到pET-30a ( + ) 上, 构建了该基因的原核表达载体pET-AFS, 转化大肠杆菌BL21。SDS2PAGE检测结果表明, 此基因表达了1个约66 kD的蛋白, 1 mmol/L异丙基-β - D - 硫代半乳糖苷( IPTG) 诱导该基因高效表达, 6 h表达量最高, 诱导产物以包涵体形式存在。     

苦瓜谷氨酰胺合成酶基因(McGS1)原核表达载体的构建及表达分析

以"热研3号"苦瓜为试材,根据苦瓜谷氨酰胺合成酶基因(McGS1)全长序列信息设计引物,提取"热研3号"苦瓜总RNA并反转录成cDNA作为模板,通过PCR扩增、产物测序、酶切等方法与pET-30a(+)原核表达载体相连,构建苦瓜McGS1基因原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达分析,研究不同IPTG浓度及诱导时间对苦瓜McGS1基因蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的影响。结果表明:该研究成功构建了苦瓜McGS1基因的原核表达载体,37℃、0.2μmol/L IPTG诱导4h苦瓜McGS1基因蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中可高效表达,表达的蛋白质分子量约为35kDa。     

扁桃AcSFB基因的克隆与原核表达分析

 利用RT-PCR和RACE技术, 从新疆栽培扁桃‘鹰嘴’花药中获得了一个全长的SFB ( S-hap-lotype-specific F-box gene) 基因(GenBank登录号为FJ362525) , 命名为AcSFBd。该基因全长1 125 bp, 编码374个氨基酸, 在N末端含有一个大约50个氨基酸组成的F2box基序, 含有两个高变区(Hva和Hvb)和两个可变区(V1和V2) 。生物信息学的方法成功预测了AcSFBd蛋白分子质量为43 kD, 为亲水性、非分泌型蛋白, 在基质内起连接酶(EC6. - . - . -) 的作用。成功构建了原核表达载体, 并转化大肠杆菌BL21 (DE3) , SDS2PAGE检测结果显示表达了一个约60 kD的蛋白。     

罗汉果葡萄糖基转移酶基因的克隆及原核表达

 从罗汉果（Siraitia grosvenorii）转录组中获得一条与罗汉果甜苷Ⅴ生物合成相关的葡萄糖基转移酶（UDPG）的unigene片段,以罗汉果授粉后70 d的果实RNA为模板,利用RACE和RT-PCR技术克隆UDPG全长基因,将克隆得到的SgUDPG1基因连接到原核表达载体pEASY-E1上,构建融合表达载体,转化到大肠杆菌BL21（DE3）,通过IPTG诱导表达,重组蛋白纯化,SDS-PAGE检测表达产物以及Western-blotting和质谱鉴定蛋白产物。结果表明,获得了1条SgUDPG1,全长为1 959 bp,开放阅读框ORF为1 365 bp,编码1条454 aa的肽链,理论分子量为51.2 kD,等电点为5.39,具有植物中次生代谢产物糖基转移酶特有的保守结构域PSPG-box motif。SgUDPG1在授粉后50 d和70 d的果实中表达逐渐升高,是对照授粉后3 d的5.16倍和13.12倍,与果实中甜苷Ⅴ含量呈相同趋势。此基因的ORF可以在大肠杆菌中表达,并且可以纯化出比理论分子量大5.3 kD的融合蛋白,通过Western-blotting和质谱鉴定,确定该蛋白属于罗汉果葡萄糖基转移酶。     

番木瓜抗PRSV突变的抗病性鉴定

通过接种PRSV Ys、Vb和Sm3个株系及田间诱发鉴定,研究了抗PRSV突变岭抗1号（聪1）的抗病稳定性。结果表明,LK-1表现出高抗PRSV-Ys和PRSV-Vb2个株系的能力,对PRSV．Sm株系则无明显抗病能力,抗病性不因自交繁殖而丧失,种植到田间的接种苗成株期的田间抗性表现与苗期表现基本一致,表明LK-1的抗病性能具较高的稳定性。     

茄子TRV-VIGS体系的优化及SmIAA19基因功能初步分析

以经过改造的烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）载体PYL156为工具,采用叶片注射法侵染茄子（Solanum melongena L.）叶片,通过表型比较、TRV病毒分子检测和荧光定量PCR技术分析,探究环境温度、植株大小、目的基因插入片段大小对茄子TRV-VIGS沉默体系的影响。结果表明,昼夜温度为（25 ± 3）℃和（20 ± 2）℃时,接种茄子幼苗子叶的植株沉默效果明显,侵染后植株叶片中目的基因表达量与阴性对照相比明显降低;早春日光温室和秋季日光温室条件下,侵染植株表型性状和基因表达量差异不显著。沉默片段大小为200 bp左右时目的基因的沉默效果最好;侵染茄子幼苗子叶期植株出现明显病毒斑,而接种6周龄真叶则无明显表型差异。用茄子生长素诱导基因（SmIAA19）为靶基因对其进行验证,结果表明显著抑制了SmIAA19的表达,其在叶片中的表达量和生长素含量均显著降低,表明SmIAA19是1个与生长素代谢途径相关的基因。     

利用VIGS技术研究马铃薯抗晚疫病基因R3a和RB的信号传导

 利用VIGS技术,在烟草中沉默已知的抗病信号传导关键基因SIPK、NDR1、SGT1、HSP90、NPR1、Rar1、EDS1、WRKY1,再瞬时表达马铃薯抗病基因和其相应的无毒基因RB-Avrblb1和R3a-Avr3a,根据过敏反应（Hypersensitive Response,HR）反应是否被阻断来研究RB和R3a介导的抗病信号传导。结果发现SGT1和HSP90基因沉默阻断了HR反应的发生,表明SGT1和HSP90是参与RB和R3a抗病信号传导途径过程中的关键基因。该技术体系的建立,为以后发现新的晚疫病抗病相关基因的功能验证提供了一个高效的技术平台。     

靶向CMV外壳蛋白基因的RNA干涉在番茄中转化及表达

以CMV(黄瓜花叶病毒)外壳蛋白基因为靶标基因,针对CMV 3个常见株系(普通株系、黄化株系和坏死株系)外壳蛋白基因间高度同源序列设计引物,经RT-PCR获得目的序列,构建RNA干涉双元载体(其中目的序列反向重复插入)。以含双元载体的根癌农杆菌介导转化无菌番茄苗,培育转基因番茄。人工接种CMV验证转基因番茄抗病毒能力,荧光定量PCR分析转基因番茄中外源基因的表达效果。结果表明:RNA干涉转基因番茄呈现不同程度的抗病毒能力;对表现抗病毒能力的转基因番茄进行荧光定量PCR分析显示,转基因番茄中靶标基因的转录mRNA存在一定程度的降解,且抗病毒能力与降解程度成正相关。     

蜡梅胚胎晚期丰富蛋白基因CpLEA的克隆及表达分析

从蜡梅 （Chimonanthus praecox）花cDNA文库中获得了1个胚胎晚期丰富蛋白（LEA）基因的cDNA全长序列,命名为CpLEA（GenBank登录号：JF412788）,该基因cDNA含有一个273 bp编码91个氨基酸的开放阅读框,从蜡梅基因组DNA中扩增该基因发现,该基因含有两个大小分别为35 bp和707 bp的内含子。生物信息学分析显示,CpLEA的编码蛋白含有4个胚胎晚期丰富蛋白第3族LEA蛋白特有的11个氨基酸的基元重复序列,进化树分析表明该编码蛋白与榛子的LEA蛋白亲缘关系最近。通过原核表达获得了与预期大小一致的融合蛋白。实时荧光定量PCR分析表明,该基因在蜡梅成熟种子中表达量最高,在根中几乎不表达;在盛开期花的各个部位中又以雌蕊中的表达量最高;在花发育早期表达量较高,随后下降并保持相对稳定,在衰败期突增并达到最高;检测该基因在脱落酸（ABA 50 μmol · L^-1）、低温（4 ℃）、高温（42 ℃）、干旱（30% PEG6000）和高盐（NaCl 1 mol · L^-1）5种外源非生物胁迫因子作用下的表达特性。结果表明,该基因能够被ABA、低温、高温、PEG 和NaCl诱导表达,并在随后的时间内呈现出不同的表达模式。表明CpLEA可能在蜡梅花发育和多种非生物胁迫响应中发挥作用。     

类番茄茄LA2951抗黄瓜花叶病毒QTL的定位

 类番茄茄（Solanum lycopersicoides）高抗黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）。通过4次独立试验,对来自类番茄茄LA2951的渐渗系（Introgression Line,IL）采用摩擦接种法,人工接种CMV亚组Ⅱ进行了筛选,定位了8个抗CMV的QTL,它们分别位于番茄第2、7、8、9、10、11和12染色体上,均可显著降低植株的病情指数,与前人已鉴定的来自多毛番茄（S. habrochaites）LA1777和智利番茄（S. chilense）LA0458的抗CMV位点不同位,为抗CMV新位点。通过对抗CMV的IL初步分析发现,这些IL包含的QTL呈现不完全显性遗传效应,QTL聚合为完全加性效应。     

响应黄龙病侵染的柑橘乙醇脱氢酶基因CsADH1的克隆与表达分析

对前期在感染黄龙病的‘晚锦橙’中发现的明显差异表达的柑橘乙醇脱氢酶(CsADH1)基因进行克隆测序分析,结果表明,CsADH1的CDS序列长为1143bp,编码380个氨基酸。蛋白质结构预测显示,CsADH1含有乙醇脱氢酶Gro ES(ADH_N)和ADH_zinc_N保守结构域。进化树分析显示,CsADH1蛋白与拟南芥、蓖麻和中国莲的ADH蛋白亲缘关系最近。亚细胞定位结果显示,CsADH1蛋白定位在细胞质中。以感病‘晚锦橙’的根和叶脉为材料,q PCR分析显示CsADH1在感病根和叶脉中均上调表达,且根中的表达水平是叶脉中的10倍。离子胁迫试验和外源植物生长调节剂诱导试验表明,Zn、水杨酸(SA)、生长素(IAA)和脱落酸(ABA)均显著诱导CsADH1上调表达,并且根中的表达水平明显高于叶中。本结果表明,CsADH1可能在柑橘根响应黄龙病菌侵染中起着重要作用。