高产漆酶真菌菌株的筛选及酶学性质研究

从6株野生真菌和5株食用真菌中筛选出高产漆酶菌株,并对筛选出的野生菌株漆酶酶学性质进行初步探究。使用G-PDA确定菌株的产漆酶能力,然后通过液体发酵对产生的粗酶液进行酶活力测定,确定高产漆酶菌株,最后分别在不同pH和温度下进行酶学性质探究。初步筛选结果:第7天时,05号菌丝直径最大89.1mm,08号显色圈直径最大76.8mm,04号的显色圈颜色最深,09号显色反应最不明显。对于漆酶活力:04号活力最高262.7U/mL,其次是08号和05号分别为255.3U/mL、203.9U/mL。01和06号酶活力达到最大所需时间最短。酶学性质方面,08号的最适pH是3.2、最适温度是40℃;在不同pH、温度下分别保温2h,pH=4.0酶活力残余率为94.20%;温度在20~40℃内,酶活力残余率在99.00%以上。结果表明,0.04%G-PDA最适作为产漆酶真菌的初筛培养基;高产漆酶能力的菌株有04、05和08号菌株,且08号菌株漆酶的最适应用条件是pH=4.0、温度为40℃。     

Penidiella sp.HEY-1β-葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

通过Penidiella sp.HEY-1发酵豆渣可制备产胞外β-葡萄糖苷酶(BGL).粗酶液经过乙醇沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析等步骤后获得了凝胶电泳均一的BGL.通过SDS-PAGE测得其分子质量为65.5 ku.该酶反应的最适温度为6...     

Penidiella sp. HEY-1β-葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

通过Penidiella sp. HEY-1发酵豆渣可制备产胞外β-葡萄糖苷酶(BGL)。粗酶液经过乙醇沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析等步骤后获得了凝胶电泳均一的BGL。通过SDS-PAGE测得其分子质量为65.5 ku。该酶反应的最适温度为60~70℃,最适pH值为3.0,在70℃以下及pH值2.0~8.0范围内均能保持稳定。Mn2+对酶有激活作用,而Na+对酶有抑制作用,其他金属离子对酶的活性影响不大。底物专一性实验表明,该酶可作用于对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(p-NPGlu)、邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(o-NPG)。作用于p-NPGlu和o-NPG的米氏常数(Km)值分别为0.434和0.411 mmol/L,酶促反应的最大速度(vmax)分别为1.0×10-3和3.3×10-4mol/(L.min)。     

木聚糖酶产生菌的筛选及其酶学性质初步研究

采用富集培养、平板划线分离、透明圈平板筛选的方法,从长期堆放玉米芯的土壤中分离到9株木聚糖酶产生菌,然后采用自然选育的方法从这些菌株中筛选出一株优良木聚糖酶菌株,用该菌株发酵产酶并对其酶学性质进行了初步研究.结果表明:在温度28~30℃、pH初始值5.0左右、摇床转速150 r/min、发酵48 h所产的木聚糖酶酶活较高,木聚糖酶活达到13.68 U/mL;酶促反应的较适温度为53℃,pH值为5.3左右;该酶较耐热,温度在60℃下,120 min后酶活仍残留60.82%.     

产纤维素酶细菌的筛选及酶学特性研究

以腐烂的废纸浆为原料，经反复筛选及刚果红染色鉴定，获得一株高活力纤维素酶生产细菌。该菌形态杆状，可产芽孢，适宜在pH值为9．0－10．0、35－37℃条件下生长。摇瓶产酶试验结果表明：该菌的发酵液在中性和碱性条件下都可测得较高的纤维素酶活力，其CMC酶活力分别可达69．4U/mL（pH值为6．7和53．6U／mL（pH值9．5）。酶反应的适宜温度为50℃，适宜中性至碱性，Ca^ 2和Mn^＋2对酶反应有促进作用，Pb^ 2和Hg^ 2对酶反应有抑制作用。这种酶制剂在棉织品的水选整理及洗涤剂工业中具有良好的应用前景。     

木霉木聚糖酶的酶学性质研究

木聚糖酶是一种应用性很强的酶。试验采用DNS法对一种木（Trichoderma）产木聚糖酶的酶学性质进行了研究，结果表明：酶的最适催化温度和pH分别为50℃和5．5，Cu^2＋、Fe^2＋、Fe^3＋、Mn^2＋对酶活有很强的抑制作用，该酶对木聚糖和桑树叶粉分解能力很强，对其他底物分解能力微弱。     

败酱多酚氧化酶的酶学性质研究

研究了败酱多酚氧化酶的酶学性质，结果表明：以邻苯二酚为底物，该酶最适pH为7．8，最适温度为26℃，温度60℃以上酶迅速失活。Vc、NaHSO3、L-Cys能完全抑制酶活性，苯甲酸钠、EDTA等对酶活性有明显的抑制作用。该酶能催化焦性没食子酸、邻苯二酚、愈创木酚氧化，但对焦性没食子酸的亲和力更强。     

Paraconiothyium variable GHJ-4木质素降解酶的酶学性质

【目的】研究木质素降解子囊菌Paraconiothyrium variabile GHJ-4分泌的漆酶(laccase)、锰过氧化物酶(MnP)和木质素过氧化物酶(LiP)3种木质素降解酶的酶活性变化规律及其酶学性质,为利用该菌株进行木质素降解酶的工业化生产和应用提供依据。【方法】分别以愈创木酚、2,6-二甲基苯酚和黎芦醇为底物测定laccase,MnP和LiP的酶活性,研究3种酶的最适反应温度和pH、温度和pH稳定性及金属离子对其活性的影响。【结果】GHJ-4菌株发酵18,15和21天后,分别获得laccase,MnP和LiP最高酶活为1 390.3,30.3和52.5 U·mL~(-1)。laccase的最适反应温度为55℃左右,最适反应pH为5.5左右,在55℃以下、pH 4.0~7.0的范围内较为稳定;MnP的最适反应温度为60℃左右,最适反应pH为5.0左右,在55℃以下、pH 4.0~9.0的范围内较为稳定;LiP的最适反应温度为40℃左右,最适反应pH为3.0左右,在40℃以下、pH 2.0~4.0的范围内较为稳定。Mg~(2+),Zn~(2+),Cu~(2+),K~+对laccase起促进作用,Na~+和Zn~(2+)对LiP起促进作用,Mn~(2+)对MnP起激活作用,而Fe~(3+),Ca~(2+),Pb~(2+),Co~(2+),Al~(3+)对3种酶均起抑制作用,其中尤以5 mmol·L~(-1)Fe~(3+)对3种酶的抑制作用最强。【结论】温度、pH及金属离子对Paraconiothyrium variabile GHJ-4 3种木质素降解酶的酶学特性均有着不同程度的影响。     

β-甘露聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质

以能水解魔芋葡甘聚糖的野生筛选菌种枯草杆菌A 33为材料,通过PCR技术从A 33基因组中扩增出β-甘露聚糖酶基因编码序列.经过克隆、测序及BLA ST比对分析,证实该基因编码β-甘露聚糖酶,属于β-甘露聚糖酶家族中的一员,该基因已注册G enBank.将该基因克隆到原核表达载体pRSET-A中并转入大肠杆菌表达系统BL 21(DE 3)pLysS,经过诱导获得了此酶的高效表达.其表达量达到37.78 U/mL,酶学特性分析表明其作用的最适pH为5.0,最适温度为60℃.     

米黑根毛霉脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达及酶学性质研究

根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子使用偏爱性,对米黑根毛霉脂肪酶(RML)成熟肽基因进行全面密码子优化,以提高RML基因在酵母细胞中表达的水平,并对重组脂肪酶的酶学性质进行了研究。运用重叠延伸PCR合成优化后的RML成熟肽基因,并进一步构建毕赤酵母表达载体p PIC9K-RML,通过电击法转化毕赤酵母GS115菌株,经G418抗性和PCR筛选获得高拷贝转化重组子。重组酵母菌用0.5%甲醇诱导异源基因表达,在28℃摇瓶培养168 h后酶活力达到122 U/m L,较未优化的原始菌株的表达酶活提高了10倍。重组脂肪酶最适温度为45℃,最适p H值为7,甲醇体积分数为40%以下时重组RML具有较好的稳定性。     

核桃病害病原菌Pestalotiopsis sp.的防治研究

由病原菌Pestalotiopsis sp.造成的核桃病害在大理州危害严重.2006~2009年连续4年的研究表明:在越冬期进行清园,核桃萌芽前、展叶后和座果后(错开花期)分别喷施5°、0.5°、0.3°的石硫合剂,发病期喷施80%的甲基托布津与90%百菌清混合剂(按1∶1混合)1 200倍液,通过清园、预防与化学防治有机结合,并辅以合理营林措施,能有效防治该病原菌的危害并迅速恢复核桃产量.     

耐碱性木聚糖酶高产菌的分离、鉴定及其酶学性质的研究

从造纸废液中筛选得到一株耐用性木聚糖酶高产菌,经初步鉴定为类黄假单胞菌,其木聚糖酶活力达３８７ＩＵ／ｍＬ培养基。酶学性质的初步研究表明：酶作用最适温度为６０℃,６５℃和７０℃时的半衰期分别为１０５和１０ｍｉｎ,该日作用最适ｐＨ值为１０．０,酶的ｐＨ值稳定范围在８．０～１０．５之间。     

偏肿革裥菌锰过氧化物酶酶学性质和染料脱色

【目的】研究白腐菌偏肿革裥菌(Lenzites gibbosa)所产锰过氧化物酶(MnP)纯酶的序列特征、酶学性质及其对染料的脱色能力,为其应用于木质素降解、染料脱色奠定基础。【方法】将纯化后的样品经SDS-PAGE检测后获得的唯一L.gibbosa MnP条带切割,采用Nano液相色谱-电喷雾串联质谱法联用(Nano LC-ESI-MS/MS)多肽测序技术对蛋白氨基酸序列进行测定。利用该SDS-PAGE图谱,建立蛋白分子量与迁移率的标准直线,从标准直线上求出MnP纯酶样品的表观分子量;参照酶活测定方法检测最适反应温度及温度稳定性、最适反应p H值及p H稳定性;采用lineweaver-Burk双倒数作图法求解米氏动力学常数Km值。研究L.gibbosa菌种培养液和MnP纯酶液对蒽醌类的茜素红、偶氮类的刚果红、杂环类的中性红和三苯基甲烷类的结晶紫等4种不同类型染料的脱色能力。【结果】串联质谱扫描出2条MnP的保守序列肽段,与克隆到的基因Lg-mnp1编码的Lg-MnP1(Gen Bank登录号:ACO92620)序列完全吻合,表明其所代表的酶蛋白Lg-MnP1就是唯一电泳带中主要的蛋白。Lg-MnP1的表观分子量为45.39 k Da,最适反应温度为35℃,在低于40℃的条件下都具有一定的催化能力,但温度超过50℃后迅速失活;其最适反应pH值为3.5,p H超过4.5反应程度就迅速下降,在p H为2~3时最稳定;在以2,6-DMP为底物时,在21℃条件下其米氏常数Km为6.124 mmol·L~(-1)。L.gibbosa培养液对染料在1 h的脱色率分别为茜素红100%、中性红22.17%、刚果红19.09%,对结晶紫的脱色率很低,在36 h脱色率仅为0.018%。纯化后的Lg-MnP1溶液对染料的最大脱色率在2 h分别为中性红100%、刚果红95.55%、茜素红75.85%和结晶紫36.57%。【结论】SDS-PAGE得到的唯一一条电泳带中的MnP是Lg-MnP1。Lg-MnP1是一种中温性、偏酸性的酶,与2,6-DMP的亲和力较大。L.gibbosa含有菌丝的培养液对茜素红具有彻底的降解效果,但Lg-MnP1纯酶液对中性红、刚果红和结晶紫的降解效率要远高于同时含有菌丝、漆酶和MnPs的培养液。     

凝结芽孢杆菌N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶基因的克隆鉴定及酶学性质

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase,NAGase)是微生物几丁质酶系中不可缺少的一部分,近年来由于其在几丁质降解过程中的特殊作用而受到关注。笔者从凝结芽孢杆菌NL01基因组上克隆获得了1个假定的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶基因,长度为1 761 bp,编码586个氨基酸,蛋白质理论分子量为64.5 k Da,编码氨基酸序列与已报道的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶相似性仅为38%。将该基因克隆至表达载体pETDuet-1上,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行重组表达,结果显示重粗酶具有N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力,经镍柱纯化获得纯酶的比酶活为74.3 U/mg。对重组酶酶学性质研究发现,该酶是一种新型耐高温N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶。最适pH为5.5,最适温度为75℃,pH和热稳定性较好,在pH 3.5~7.5范围内比较稳定,在不高于65℃条件下热处理30 min后,酶活力可以保持在70%以上。     

漆酶高产菌株筛选及漆酶基因片段的克隆

研究利用不同底物浓度、不同培养时间、不同培养基为优化因素,对漆酶产生菌株筛选条件进行了初步研究,从广泛4株食用真菌中筛选具有高产漆酶特性的真菌,双孢菇2796,并以双孢菇2796为供体菌,提取菌株RNA,运用RT-PCR方法对漆酶基因进行扩增,克隆后得到长度为160bp的漆酶基因片段。     

漆酶预处理前后蔗渣半纤维素的提取及性质研究

以蔗渣为原料,经漆酶预处理后通过微波辅助碱法提取半纤维素,研究了漆酶预处理对蔗渣半纤维素提取效果的影响,并采用扫描电子显微镜、比表面积及孔径分析仪和凝胶渗透色谱仪等对漆酶预处理前后的蔗渣形貌、孔隙特征和半纤维素相对分子质量等进行表征。结果表明:蔗渣经160 U/g漆酶预处理后的蔗渣表面有片状结构生成,与未处理样相比,总孔体积和比表面积明显增加,分别提高了26.7%和90.5%,且局部有孔洞出现。预处理后的蔗渣50 g(绝干)在氢氧化钠质量分数8%、两者固液比1∶20(g∶mL)、微波功率800 W、提取时间50 min、提取温度90℃的微波辅助碱法提取条件下,蔗渣半纤维素产率高达89.0%。     

黄绿木霉固定化生产纤维素酶及酶学特性的研究

利用海藻酸钙凝胶包埋法制备固定化细胞黄绿木霉,结果表明:海藻酸钠质量浓度50 g/L,培养基初始pH值4.0~4.5,以滤纸浆为培养基碳源培养的小球的稳定性好。发酵产酶培养时以滤纸浆为碳源,海藻酸钠质量浓度为50 g/L,CaC l2质量浓度控制在20 g/L,培养基初始pH值选择为4.5,产酶效果好、酶活力高、保持时间长。添加表面活性剂Tw in-80后,产酶能力可进一步提高。通过(NH4)2SO4分级沉淀、Sephadex G-100分子筛层析和DEAE Sephadex A-50离子交换层析等步骤,分离纯化出黄绿木霉纤维素酶系中达到电泳纯的3种内切葡聚糖酶(EGⅠ、EGⅡ、EGⅢ)和2种β-葡萄糖苷酶(BGⅠ、BGⅡ)。通过SDS-PAGE和IEF电泳测得5个酶组分的相对分子质量(Mr)分别为62 300、71 900、52 600、85 300和78 300,等电点分别为5.4、4.8、5.0、5.6和5.8。     

橡胶木胶合板阻燃技术研究 Ⅳ.橡胶木胶合板的燃烧性质及热性质

通过对橡胶木胶合板与水曲柳胶合板、杨木胶合板、椴木胶合板的点着性、燃烧释热性、火焰传播性、发烟性以及热重曲线的对比,了解橡胶木胶合板的燃烧性质和热性质,并进一步探讨ＷＦＲ作为橡胶木胶合板阻燃剂的处理效果。     

来源于解酯菌的嗜热耐碱脂肪酶的表达纯化及其酶学性质研究

脂肪酶广泛应用于食品加工、生物柴油制备等领域。为了有效提高微生物脂肪酶的可利用度,将来源于解酯嗜热菌(Thermosyntropha lipolytica DSM 11003)的脂肪酶基因(tll2)克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中,获得重组质粒pET28a TLL2,将pET28a TLL2转入大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中进行高效表达。通过热处理和镍柱亲和层析得到电泳纯的蛋白TlLip2,对其进行酶学性质表征。结果显示,TlLip2的亚基分子质量为57 ku,比酶活为31 U/mg,最适反应pH及温度分别为8.0和60℃。在60℃以下、pH 6.0~11.0范围内,TlLip2的稳定性较好,相对酶活均维持在60%以上。金属离子K+和Na+对TlLip2有较大激活作用,而Co^2+、Zn^2+、SDS和Tween 80对TlLip2酶活力抑制作用明显。TlLip2在极性小的有机溶剂中具有较好的耐受性。TlLip2对中等碳链长度的对硝基苯酯显示出更高的活性,其中以对硝基苯己酯为底物时,TlLip2的酶活最高;以对硝基苯棕榈酸酯为底物时,该酶的动力学常数Km为0.29 mmol/L,Vmax为2.28 mmol/(L·min^-1),kcat为6.19 s^-1。此外,将其应用到油酸乙酯的合成研究中,以油酸和乙醇为底物,研究TlLip2催化制备油酸乙酯的转化条件,结果表明在60℃、加酶量为100 U/g的TlLip2,催化摩尔比为1∶2的油酸和乙醇,12 h后油酸乙酯的转化率达到62.1%,表明TlLip2在催化脂肪酸酯化方面具有较大的应用潜能。     

橡胶木胶合板阻燃技术研究：Ⅳ.橡胶木胶合板的燃烧性质及热性质

通过对橡胶木胶合板与水曲柳胶合板、杨木胶合板、椴木胶合板的点着性、燃烧释热性、火传播性、发烟性以及热重曲线的对比,了解橡胶木胶合板的燃烧性质和热性质是一步探讨ＷＦＲ作为橡胶木胶合板阻燃剂的处理效果。