苹果MdMYB2基因的克隆及功能鉴定

以‘嘎拉’苹果为材料,采用同源克隆和PCR技术分离了苹果基因MdMYB2(基因序列号:MDP0000823458)。MdMYB2的开放阅读框(ORF)长度为873 bp,编码含有290个氨基酸的蛋白,预测其蛋白质分子量为32.92 kD,等电点为4.91。系统进化树分析显示,苹果MYB2与梨MYBL2亲缘关系最近,同源性最高。组织表达分析表明,MdMYB2在苹果的各个组织均有表达,在茎和果实中表达相对较高。MdMYB2的表达明显受盐胁迫的诱导。构建了MdMYB2的表达载体,并通过农杆菌介导的遗传转化得到了转基因苹果愈伤和转基因拟南芥植株。抗性试验表明,过量表达MdMYB2明显提高了转基因苹果愈伤对盐胁迫的抗性。此外,异位表达MdMYB2也能提高拟南芥对盐胁迫的抗性,以上试验结果表明MdMYB2在植物盐胁迫响应中发挥重要作用。     

苹果MdMYB2基因对非生物胁迫的响应

为阐明苹果(Malus×domestica)R2R3-MYB转录因子基因MdMYB2在非生物胁迫条件下的生物学功能,对MdMYB2的启动子序列进行分析,发现其含有非生物胁迫相关顺式作用元件,且MdMYB2的表达量受外源ABA、聚乙二醇(PEG)和4℃低温的诱导。在不同处理对MdMYB2过表达拟南芥植株和MdMYB2过表达苹果愈伤组织的试验中发现,外源ABA处理抑制了MdMYB2转基因拟南芥种子的萌发,且转基因幼苗提高了对ABA的敏感性、耐旱性和抗冷性。同时,过表达MdMYB2的苹果愈伤组织也表现出对ABA敏感、耐旱和抗冷的表型。以上结果说明MdMYB2在植物的逆境胁迫响应中发挥重要作用。     

苹果MdMYB116对白粉病的抗性研究

以抗白粉病的‘嘎拉’苹果为试材,克隆得到MdMYB116的cDNA全长序列。该基因的开放阅读框为900 bp,编码299个氨基酸,含有2个保守结构域。系统进化树结果表明,MdMYB116与梨PbMYB108-like的相似性最高,为93.38%。亚细胞定位试验显示MdMYB116定位在细胞核内。MdMYB116接种苹果白粉病菌6～12 h表达量上升,并达到高峰。酵母转录激活验证得出MdMYB116全长含有自激活活性。将MdMYB116异源转化拟南芥,得到的转基因植株接种白粉病菌处理后,其抗性显著高于野生型和pad4突变体植株。组织化学染色观察发现,与野生型和pad4突变体植株相比,转基因株系活性氧积累水平更高,死细胞数量和胼胝质积累也更多,说明转基因株系存在较严重的过敏致死情况,证明MdMYB116参与植株对白粉病的免疫调节反应。通过分析相关抗病基因的表达结果,说明MdMYB116通过参与SA和/或MeJA的信号途径增强防御反应。     

MdMYB10对苹果果皮苯丙氨酸代谢的影响

MdMYB10对苹果果皮花青苷合成起重要作用,但对苯丙氨酸代谢途径中其他酚类物质合成是否起作用尚不清楚。从‘粉红女士’苹果（Malus ? domestica‘Pink Lady’）果皮中克隆了MdMYB10,分别构建其过表达载体pCAMBIA2301-MdMYB10和沉默载体pTRV2-MdMYB10,在套袋苹果果皮下注射农杆菌诱导MdMYB10过表达和沉默,分析MdMYB10对解袋后苹果果皮苯丙氨酸代谢的影响。结果表明,在过表达MdMYB10的果皮组织中,MdMYB10表达量上调了19.62倍,MdPAL、MdCHS、MdF3H、MdDFR、MdANS、MdUFGT、MdFLS、MdANR均有不同程度的上调,只有MdLAR无显著变化;沉默MdMYB10的果皮组织中,MdMYB10表达量降低了87%;MdCHS、MdF3H、MdDFR、MdANS和MdUFGT均有不同程度的下调,其中MdANS和MdUFGT下调最多,分别下调83%和82%。在过表达MdMYB10的果皮中,花青苷含量升高了3.05倍,槲皮素–3–O–半乳糖苷、表儿茶素、原花青素B2、绿原酸、对香豆酸含量均有不同程度升高,根皮苷含量无明显变化;在沉默MdMYB10的果皮中,花青苷含量降低了83%,槲皮素–3–O–半乳糖苷和表儿茶素含量分别降低58%和52%,原花青素B2、根皮苷含量无明显变化,而绿原酸含量升高了24%,对香豆酸含量升高了21%。可见,MdMYB10不仅调控苹果果皮中花青苷合成,同时还调控苯丙氨酸代谢中绿原酸、对香豆酸、槲皮素–3–O–半乳糖苷、表儿茶素和原花青素B2等物质的合成,但对根皮苷的形成作用不明显。     

转沙冬青锌指蛋白基因AmZFPG 烟草非生物胁迫抗性分析

 分析了沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）锌指蛋白基因AmZFPG 在非生物胁迫下的表达 特性,结果显示AmZFPG 受低温、干旱、高盐胁迫诱导表达,表明该蛋白参与多种胁迫相关的信号转导 和应答反应。为进一步探索AmZFPG 的功能,构建了真核表达载体AmZFPG-pCAMBIA2300,将该基因 转入烟草（Nicotiana tabacum L.）,对转基因烟草T1 代进行非生物胁迫分析,结果显示,转基因烟草的耐 寒性、耐旱性、耐盐性均获得了提高。     

转香樟CcCBFs烟草的抗逆性分析

为探究香樟CBF基因（CcCBFa、CcCBFb和CcCBFc）增强植株非生物胁迫抗性的功能,对获得的T1代转基因烟草,分别进行300 mmol · L-1甘露醇模拟干旱、300 mmol · L-1 NaCl溶液模拟高盐和4 ℃模拟低温胁迫处理,测定其丙二醛、脯氨酸和可溶性糖含量,探讨其抗逆性。结果表明：CcCBFb和CcCBFc可显著增强烟草抗旱性;CcCBFa和CcCBFc可显著增强烟草抗盐性;CcCBFc可显著增强烟草抗寒性。CcCBFc可以提高转基因烟草抗旱、抗盐、抗寒能力。     

山楂过氧化物酶基因的克隆及在烟草中异位表达分析

【目的】从山楂(Crataegus pinnatifida)中克隆过氧化物酶(POD)编码基因,通过转基因验证其在木质素合成中的作用,为揭示山楂内果皮形成分子机制奠定基础。【方法】利用RT-PCR技术从山楂克隆基因,以p RI 101-AN为构建基因过量表达载体的基础载体,通过农杆菌介导的遗传转化方法将目的基因导入烟草。【结果】从山楂中克隆出编码序列长度为996 bp的POD72基因,命名为Cp POD72。山楂POD72与木本和草本植物POD72的氨基酸序列一致性均较高。构建了Cp POD72基因的过量表达载体,通过农杆菌介导的转化获得了66个烟草转化植株。RT-PCR检测结果显示Cp POD72基因在烟草转基因植物中异位表达,组织化学染色分析表明转Cp POD72基因烟草植株中木质素含量增加。【结论】Cp POD72基因可能参与木质素合成。     

提高苹果基因转化效率的研究

采用根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）强株系ＥＨＡ１０５（ｐ３５ｓＧＵＳ－ｉｎｔｒｏｎ）研究了影响‘皇家嘎拉’苹果（Ｍａｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ Ｂｏｒｋｈ．）外植体的β－葡萄糖醛酸酶（ＧＵＳ）基因的瞬时、稳定表达水科和转基因植株的再生。证明在培养基生长素（ＩＢＡ、ＮＡＡ）存在的条件下,外植体的ＧＵＳ基因的瞬时表达水平提高了３～４倍,而共培养两周后稳定表达水平提高２     

MdMYB73的分子克隆及其在苹果愈伤组织和拟南芥幼苗中的盐抗性功能鉴定

从‘嘎拉’苹果中克隆了一个MYB转录因子基因(序列号:MDP0000894463)。该基因包含长为729 bp完整的开放阅读框,编码243个氨基酸,预测其蛋白质分子量为26.34 kD,等电点为9.29。系统进化树分析表明,这一MYB转录因子与拟南芥AtMYB73同源序列相似性最高,因此将其命名为MdMYB73。功能域分析表明,MdMYB73蛋白含有保守的R2R3-typeMYB绑定域。荧光定量PCR分析表明,MdMYB73在苹果的各个组织均有表达,在叶片和花中表达相对较高;MdMYB73的表达明显受盐胁迫的诱导。将异位表达MdMYB73的拟南芥幼苗进行抗盐鉴定,结果表明MdMYB73负调控拟南芥盐胁迫抗性;同时,AtSOS1,AtSOS3和AtNHX1抗盐相关基因的表达水平显著降低,表明MdMYB73可能负调控SOS反应,影响拟南芥抵抗高盐胁迫过程。将MdMYB73基因遗传转化苹果愈伤组织,抗盐表型分析表明,MdMYB73过量表达也明显降低了转基因愈伤组织对盐胁迫的抗性。     

异位表达苹果G蛋白偶联受体基因MdGCR1降低烟草的抗旱性

以‘嘎拉’苹果(Malus×domestica‘Royal Gala’)为材料,采用同源克隆和PCR技术分离了G蛋白偶联受体基因MdGCR1。其开放阅读框(ORF)为960 bp,编码含有319个氨基酸的蛋白。系统进化树分析显示,MdGCR1与梨GCR1亲缘关系最近,同源性最高。基因表达分析显示MdGCR1主要在苹果根、茎和叶中表达,在花和果实中的表达量较低;MdGCR1受多种逆境胁迫诱导,参与多种激素响应。构建了MdGCR1植物过表达载体,并通过农杆菌介导的遗传转化获得了转MdGCR1烟草。转基因材料抗性试验结果显示:超量表达MdGCR1显著降低烟草对干旱胁迫的抗性,表明苹果G蛋白偶联受体基因MdGCR1在响应植物抗旱胁迫中发挥重要作用。     

甜瓜CmGnT基因的克隆及非生物胁迫下的表达分析

为了探究非生物胁迫下甜瓜N–乙酰氨基葡萄糖基转移酶基因(CmGnT)的作用机制,根据甜瓜cDNA序列设计引物,利用RT-PCR技术克隆得到CmGnT。生物信息学分析表明,CmGnT的cDNA全长为2 193 bp,开放阅读框(ORF)为1 179 bp,编码392个氨基酸。CmGnT蛋白分子量约为46 kD,理论等电点(pI)为7.93。蛋白结构分析表明,CmGnT含有β–1,4–N–乙酰氨基葡萄糖转移酶结构域,属于糖基转移酶17家族。该基因编码的蛋白有1个强的跨膜螺旋结构。进化树分析表明,CmGnT氨基酸序列与黄瓜CsGnT(登录号:XP_004135275.1)亲缘关系最近,同源性为99.74%,与西瓜Cs Gn T的同源性为97.70%。实时荧光定量PCR分析结果表明,在NaCl、PEG、H_2O_2和ABA等非生物胁迫下的甜瓜叶片中CmGnT都显著上调表达,表明CmGnT受非生物胁迫诱导,推测其在甜瓜响09应非生物胁迫过程中起到重要作用。     

月季Rchsp17.8基因转化烟草的非生物胁迫耐性研究

为了研究从月季中分离的小分子热激蛋白Rchsp1718的生理功能, 把Rchsp1718的编码框插入到表达载体PHB的35S组成型启动子后面, 通过农杆菌GV3101转化烟草, 获得转基因植株。在高温、干旱、渗透、高盐胁迫条件下分别检测转基因烟草形态、失水率、电导率、脯氨酸含量及其内外源基因表达模式。结果显示: 与对照相比, 转基因烟草抗性表型明显, 电导率较低, 脯氨酸含量大幅度提高, 失水率降低; P5CS基因的表达量上调, 说明转Rchsp1718基因烟草苗在高温以及高渗透胁迫下表现出明显的耐受性。     

荷花NnNHX1基因耐盐性在转化烟草中的验证

 为研究荷花液泡膜型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因NnNHX1的耐盐性,构建了植物表达载体pCAMBIA1301-220-NnNHX1,并通过农杆菌介导的叶盘转化法将NnNHX1基因转入烟草。利用荧光定量PCR分析NnNHX1在转基因烟草中的表达情况。对转基因烟草进行盐胁迫试验,并测定其在盐胁迫条件下叶绿素、脯氨酸和丙二醛含量、相对电导率、SOD和POD活性等相关生理指标及后代种子的发芽率。结果显示,在获得的7个转NnNHX1基因烟草株系中,T-N1、T-N2和T-N10等3个株系NnNHX1表达量较高。盐胁迫下,转基因烟草组培苗和盆栽苗的生长状况都好于对照植株,在叶绿素含量、脯氨酸含量、细胞质膜的完整性（相对电导率和丙二醛含量）和抗氧化酶（SOD和POD）活性等方面都好于对照,并且后代种子的发芽率也明显高于对照。表明荷花NnNHX1基因能够在烟草中正常翻译和表达,NnNHX1的过量表达提高了转基因烟草的耐盐性。     

拟南芥耐寒基因AtCOR15a在番茄中异源表达增强其耐寒性

拟南芥耐寒基因AtCOR15a由冷诱导启动子RD29A控制后,重组进双元表达载体,经根癌农杆菌介导,将该基因导入‘Ailsa Craig’番茄。研究发现,筛选出的3个高表达转基因株系的耐寒性比野生型显著增强;外源基因AtCOR15a的表达量在低温处理过程中呈现先增后降的变化趋势,且在处理6h达到最大值;在冷胁迫下,该基因的表达促进了转基因植株中SlDehydrin-like(Sl DEHL)和SlDehydrin Ci7(SlCi7)等内源冷诱导基因的表达,降低了细胞膜透性和丙二醛(MDA)含量,减少了活性氧H_2O_2和O_2~.的积累,增强了超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶等活性氧清除酶的活性,提高了游离脯氨酸含量。因此,AtCOR15a异源表达能够显著增强转基因番茄的耐寒性。     

过量表达杜鹃红山茶CaAPX1的烟草耐热性提高

根据山茶(Camellia japonica)同源序列设计特异性引物,利用同源克隆和3′,5′-RACE技术,从杜鹃红山茶(C.azalea)嫩叶组织中克隆出抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)基因,命名为CaAPX1(Gen Bank登录号:KP635267),基因全长1 097 bp,开放阅读框753 bp,编码250个氨基酸。实时荧光定量分析发现,CaAPX1在4种不同的山茶中均得到表达,其中较耐热的微花连蕊茶(C.minutiflora)表达量最高,其次是中等耐热的杜鹃红山茶和‘耐冬’山茶(C.japonica‘Naidong’),最低的为耐热性较差的‘恨天高’云南山茶(C.reticulata‘Hentiangao’)。结果表明该基因的表达量高低与测试物种的耐热性有关。CaAPX1在杜鹃红山茶4种组织中均得到表达,表达量由高到低依次为:叶片、花蕾、种胚、花芽,其中叶片表达量高达其他组织的1.29~4.26倍。CaAPX1转基因烟草分析表明,过量表达CaAPX1后,APX酶活性提高了2.58~3.81倍,抗坏血酸(Ascorbate,AsA)含量也提高了2.67~3.56倍,并且转基因烟草植株及其种子的耐热能力也提高。     

月季RcHSP17.8 基因表达提高大肠杆菌对非生物胁迫的耐性

 月季RcHSP1718为编码小分子热激蛋白基因, Southern检测其在月季基因组中为多拷贝存在。38 ℃/3 h热激处理后, 该基因在耐热月季品种‘曼海姆宫殿’ ( Schloss Mannieim) 、‘彩虹’ (Radio) 、‘赌城’ (Las Vegas) 、‘梅郎随想曲’ (Caprice de Meiland) 、‘小女孩’ ( Girl) 中强表达, 而在不耐热品种‘新十全’ (Kordes’Perfecta) 、‘绯扇’ (Hiogi) 、‘莱茵黄金’ ( Pfalzer Gold) 中弱表达或不表达, 表明该基因与月季耐热性关系密切。为确定月季RcHSP1718基因功能, 将其转化E.coli BL21, 结果表明重组菌株能正常诱导表达包含RcHSP17.8的融合蛋白, 并因此提高了重组菌株对高温、低温、高盐、高pH、重金属、氧化等非生物胁迫的耐性, 表明RcHSP17.8参与了上述非生物胁迫的响应。     

月季Rchsp1718基因转化烟草的非生物胁迫耐性研究

 为了研究从月季中分离的小分子热激蛋白Rchsp1718的生理功能, 把Rchsp1718的编码框插入到表达载体PHB的35S组成型启动子后面, 通过农杆菌GV3101转化烟草, 获得转基因植株。在高温、干旱、渗透、高盐胁迫条件下分别检测转基因烟草形态、失水率、电导率、脯氨酸含量及其内外源基因表达模式。结果显示: 与对照相比, 转基因烟草抗性表型明显, 电导率较低, 脯氨酸含量大幅度提高, 失水率降低; P5CS基因的表达量上调, 说明转Rchsp1718基因烟草苗在高温以及高渗透胁迫下表现出明显的耐受性。     

过表达香樟CcCBFb的烟草非生物胁迫抗性增强

为探究香樟Cc CBFb基因增强植株非生物胁迫抗性的功能,通过农杆菌介导法将该基因转入烟草中,经PCR和半定量RT-PCR技术鉴定阳性转基因株系后,对获得的T1代转基因无性系(T2和T4株系)以及野生型(WT)进行干旱(0、150、300和450 mmol·L~(-1)的甘露醇)、高盐(0、100、200和300 mmol·L~(-1)的Na Cl)、4℃低温、–4℃冰冻胁迫处理,结果显示:转基因烟草在干旱和高盐胁迫下,幼苗的存活率均高于野生型;经4℃低温处理后,转基因烟草植株的脯氨酸和可溶性糖含量均显著高于野生型植株,而丙二醛(MDA)含量均低于野生型植株;经–4℃的冰冻处理6 h后,野生型和转基因T4株系植株叶片均出现不同程度的萎蔫,而转基因T2株系植株未出现不良现象。由此可见,过表达CcCBFb基因不但能够增强烟草的抗旱和抗盐性,而且能够显著增强抗寒性。