梨贝壳杉烯酸氧化酶基因PcKAO1 的克隆与表达分析

 以梨矮化砧木‘中矮1 号’新梢叶片为试材,根据苹果基因组中相关序列信息设计特异引 物,通过RT-PCR 的方法克隆了梨赤霉素合成过程中关键酶--贝壳杉烯酸氧化酶（KAO）基因的编码 框全长序列。该序列全长1 568 bp,开放阅读框（ORF）编码503 个氨基酸,相对分子量为57.59 kD,等 电点为9.47,氨基酸序列与其它物种已知的KAO 序列具有53.14% ~ 98.61%的相似性,且具有细胞色素 P450 家族蛋白典型的功能结构域和跨膜结构域,将该基因命名为PcKAO1,GenBank 登录号为 KC153027.1。用同样的方法克隆了对照梨品种‘早酥’（乔化）和‘锦香’（半矮化）的PcKAO1 基因, 通过比对分析发现3 个品种的PcKAO1 基因间仅有个别碱基差异,其编码的蛋白序列完全一致。RT-PCR 半定量分析表明：PcKAO1 基因在‘中矮1 号’各个检测的器官组织中均有表达,其中以种子和子房中的 表达量最高;在3 个品种的新梢叶片中,除新梢生长初期（5 月10 日）之外,其他时期矮化砧木‘中矮 1 号’均低于乔化和半矮化的对照品种‘早酥’和‘锦香’,而在这些时期‘中矮1 号’新梢生长逐渐减 缓乃至停长。     

荔枝漆酶基因LcLac 的克隆与表达分析

 为了探明荔枝漆酶基因LcLac的表达与果皮褐变之间的关系,通过筛选‘妃子笑’荔枝果皮cDNA文库和3′-RACE技术,克隆获得了荔枝LcLac全长cDNA序列（EU 527187.1）。该序列全长1 779 bp,5′-UTR长26 bp,3′-UTR长52 bp,含一个1 701 bp的完整开放阅读框,编码含566个氨基酸残基的多肽。该氨基酸残基序列与欧亚槭树等物种的漆酶蛋白相似性较高。荧光定量PCR结果表明,LcLac在荔枝花中表达量最高,果肉中表达量最低。在采后贮藏前期,随LcLac表达量上升果皮褐变指数升高,且褐变指数较高的‘妃子笑’果皮中LcLac表达量高于褐变指数低的‘紫娘喜’果皮。贮藏中后期严重褐变果皮中LcLac表达量比贮藏前期低。采后贮藏前期果皮中LcLac的上调表达可能对其褐变起促进作用。     

茄子花青素合成相关基因SmMYB 的克隆与表达分析

 以茄子（Solanum melongena L.）‘YZ14’（紫茄）和‘YZ3’（白茄）为试验材料,采用 同源克隆与RACE（rapid amplification of cDNA ends）相结合的方法克隆了茄子MYB 基因cDNA 及gDNA 全长序列,命名为SmMYB。序列分析结果表明：该基因cDNA 全长1 035 bp,开放阅读框837 bp,编码 278 个氨基酸,与辣椒（Capsicum annuum L.）MYB 转录因子氨基酸序列相似性达71%;成熟蛋白的等电 点为8.47,具有2 个典型的DNA-binding 结构域且亚细胞定位于细胞核;gDNA 全长3 834 bp,包含3 个 外显子及2 个内含子。荧光半定量检测结果表明：SmMYB 在茄子根、茎、叶、花瓣、果皮中均有表达, 但表达水平具有组织特异性;遮光处理后紫色茄子果皮中该基因表达量变化与花青素合成量变化趋势相 似。推测SmMYB 为一个MYB 转录因子基因,正向调控茄子花青素的合成。     

葡萄白粉病菌应答基因VpSTART的克隆及表达分析

 在前期获得葡萄白粉病菌应答基因VpSTART的EST基础上,采用RACE和RT-PCR技术克隆该基因cDNA全长序列。VpSTART全长1 321 bp,3′端非编码区114 bp,包含一个1 206 bp开放阅读框,编码401个氨基酸。VpSTART蛋白分子量为45.3 kD,与欧亚种葡萄、玉米、拟南芥、蒺藜状苜蓿和蓖麻的蛋白同源性分别为99%、64%、58%、46%和25%。实时荧光定量PCR表明,VpSTART在‘商–24’葡萄花序、卷须和茎中表达量较高;感白粉病的‘湖南–1’葡萄叶片接种白粉病菌后VpSTART表达量与对照没有显著差异,而抗白粉病的‘商–24’葡萄接种12 h后VpSTART表达量增加,在24 ~ 96 h表现显著性差异;用SA、MeJA和Eth等不同信号分子分别处理‘湖南–1’和‘商–24’葡萄叶片1 ~ 48 h后,VpSTART基因的表达受SA负调控,受MeJA和Eth正调控。     

砧木南瓜硅转运蛋白基因CmLsi3的克隆与表达分析

以用于黄瓜嫁接的砧木南瓜‘云南黑籽南瓜’（Cucurbita ficifolia,去蜡粉能力弱）和‘黄诚根2号’（C. moschata,去蜡粉能力强）为试材,采用同源克隆与RACE相结合的方法克隆到硅转运蛋白基因cDNA全长,命名为CmLsi3（GenBank登录号分别为KM203110和KM359142）。两种砧木南瓜CmLsi3基因cDNA全长为1 206 bp,开放阅读框为795 bp,编码264个氨基酸,两者仅有4个位点的氨基酸不同,但与黄瓜、玉米、大麦等作物硅转运蛋白氨基酸序列同源性均在50%以上。CmLsi3蛋白含有2个NPA模体、6个跨膜结构域以及1个由Gly（G）、Ser（S）、Gly（G）和Arg（R）组成的ar/R选择性过滤器,属于水通道蛋白NIPⅢ亚家族。实时荧光定量分析表明,CmLsi3基因在砧木南瓜根、茎、叶中均有表达,且‘云南黑籽南瓜’各器官CmLsi3基因的表达水平高于‘黄诚根2号’。     

牡丹切花ERF转录因子基因的分离与表达分析

利用已获得的‘洛阳红’牡丹花瓣转录组数据库,筛选得到3个与植物乙烯响应因子ERF蛋白同源性较高的Unigene序列,利用RACE及RT-PCR技术,设计特异性引物对3个ERF基因最大阅读框进行扩增并测序。生物信息学分析表明PsERF1、PsERF2和PsERF3分别含有长为1 158、747和609 bp的开放阅读框,编码383、248和202个氨基酸残基,且均含有1个典型的AP2结构域。进化分析表明3个牡丹ERF转录因子分别属于ERF亚家族的B2组、B1组和B3组。利用实时定量PCR分析了3个ERF基因在牡丹乙烯敏感型品种‘洛阳红’和乙烯不敏感型品种‘雪映桃花’不同花器官（花瓣、雄蕊、雌蕊和萼片）以及不同发育级别切花花瓣中的表达情况。结果表明,PsERF1在2个品种花瓣中的表达量显著高于其他花器官,其表达量在‘洛阳红’切花发育过程中逐渐增加,而在‘雪映桃花’切花发育过程中逐渐降低,推测PsERF1可能对牡丹切花的乙烯响应具有重要的调控作用,PsERF2和PsERF3则可能同时参与了多种信号途径。     

红肉苹果冷信号基因MdICE1的表达及其蛋白与MdMYB的互作

根据拟南芥AtICE1蛋白序列在苹果基因组中Blast比对得到苹果同源蛋白序列,利用DNAMAN软件设计特异性引物并克隆苹果冷信号基因（MDP0000662999）,暂命名为MdICE1。以从新疆红肉苹果与‘富士’杂交F1代中选出的‘紫红3号’叶片诱导出的红色愈伤组织为试材克隆MdICE1,测序发现该基因的开放阅读框长度为1 626 bp,编码541个氨基酸。进化树分析表明,MdICE1与AtICE1在同一进化支上,推测它们具有相似的功能。氨基酸序列比对发现,MdICE1存在bHLH基序。低温处理有利于苹果愈伤组织花青苷的累积;与培养在24 ℃下的愈伤组织相比,低温（8 ℃）诱导苹果愈伤组织冷信号基因MdICE1以及花青苷合成相关转录因子基因MdMYB10和MdbHLH3的表达。酵母双杂交试验证明MdICE1可以与MdMYB10相互作用;亚细胞定位发现MdICE1蛋白存在于细胞核内;转化大肠杆菌并诱导获得了MdICE1的重组蛋白,为进一步研究MdICE1蛋白在花青苷代谢途径中的功能奠定了基础。     

猕猴桃花青素合成途径基因AcCHS 和AcLDOX的克隆与表达分析

 根据物种水平上蛋白保守序列设计特异引物,扩增获得‘红阳’猕猴桃花青素合成途径中查尔酮合成酶（chalcone synthase,CHS）和无色花青素双加氧酶（leucoanthocyanidin dioxygenase,LDOX）基因的特异片段,用RACE（rapid-amplification of cDNA ends）技术克隆出这两个基因的cDNA全长,长度分别为1501 bp（AcCHS）和1381 bp（AcLDOX）,分别编码389个和355个氨基酸。通过比对发现AcCHS与棉花（Gossypium hirsutum）、山茶（Camellia japonica）和黄蜀魁（Abelmoschus manihot）的CHS序列相似性较高,达到95%,与葡萄（Vitis vinifera）和苹果（Malus × domestica）的相似性分别为94%和93%;AcLDOX与山葡萄（Vitis amurensis）和葡葡的相似性分别高达94%和93%。用实时荧光定量PCR分析AcCHS和AcLDOX在‘红阳’（红肉）、‘金魁’（绿肉）和‘金农’（黄肉）3种不同果肉颜色的猕猴桃内果皮中的表达,发现AcCHS的表达量在‘红阳’果实转色期（花后65 d）较高,而在‘金农’开花后表达量呈持续下降趋势;AcLDOX在‘红阳’果实发育早期呈上升趋势,花后65 d后迅速下降,在‘金魁’果实发育后期呈明显上升趋势,在‘金农’开花后呈持续下降趋势。     

苹果PGIP基因部分家族成员启动子的克隆与功能分析

根据已发表的苹果基因组序列设计特异引物,克隆了苹果（Malus × domestica Borkh.）品种‘秦冠’和‘太平洋玫瑰’中PGIP家族基因PGIP1和PGIP2的启动子片段,序列分析结果表明PGIP1与PGIP2启动子序列相似度为71%,‘秦冠’和‘太平洋玫瑰’的PGIP1、PGIP2启动子相似度都达到了99%。两个品种PGIP1启动子中TATA-box和CAAT-box的数量明显多于PGIP2,PGIP1和PGIP2启动子分别存在茉莉酸甲酯和水杨酸响应元件,暗示PGIP1和PGIP2存在不同的抗病响应途径。构建了启动子︰︰GUS融合表达载体,通过对农杆菌介导法转化烟草叶片中的GUS活性分析,比较了不同启动子的活性。结果表明：PGIP1启动子活性在品种间差异不显著;PGIP2启动子活性在品种间差异显著,‘秦冠’是‘太平洋玫瑰’的2.37倍,可能与品种抗病性差异有关;同一品种中PGIP1启动子活性显著高于PGIP2。     

杜梨类钙调磷酸酶B亚基蛋白基因PbCBL2的克隆和功能初探

 类钙调磷酸酶B亚基蛋白（Calcineurin B-like protein,CBLs）是植物中一类重要的钙离子传感器,参与调控植物生长发育及逆境胁迫响应过程。为了探明杜梨CBLs家族成员PbCBL2的序列特征和表达模式,以杜梨（Pyrus betulaefolia Bunge）幼苗为试材,运用EST搜索结合RACE技术、染色体步移法对PbCBL2的cDNA、DNA和启动子进行克隆,采用半定量RT-PCR和原核表达研究该基因在非生物胁迫下的表达模式。结果表明,PbCBL2基因cDNA序列长681 bp,编码一个含有226个氨基酸残基的蛋白。基因组DNA序列长1 927 bp,包括8个外显子和7个内含子,启动子序列包含光反应元件、厌氧诱导必需顺式作用元件、赤霉素反应元件和水杨酸响应顺式作用元件。PbCBL2编码的多肽具有植物类钙调磷酸酶B亚基蛋白结合Ca²⁺所必需的4个EF手型结构和1个典型的植物钙调磷酸酶A亚基结合位点。未经处理的杜梨幼苗（对照）根和叶中未检测到PbCBL2的表达,PbCBL2的表达受NaCl、PEG6000、甘露醇和ABA诱导上调。PbCBL2转入大肠杆菌BL21（DE3）后,能够明显减轻NaCl、甘露醇和PEG6000对该菌株的生长抑制。PbCBL2基因具备植物CBLs基因家族的固有特征,对盐碱、干旱、渗透胁迫和ABA处理均存在转录响应,大肠杆菌转入该基因后能够提高对盐胁迫和渗透胁迫的耐受能力。     

文心兰开花相关OnAP1-like基因的克隆及表达分析

以南茜文心兰（Gower Ramsey）盛花期花葶提取的总RNA为模板,通过RT-PCR与RACE扩增,获得一个958 bp的AP1（APETALA1）-like基因的cDNA全长序列,其基因编码区690 bp,共编码氨基酸229个,命名为OnAP1-like（登录号：KC426946）。蛋白质二级结构分析表明,该蛋白质48.91%为α螺旋,10.92%为β折叠,40.17%为无规则卷曲,为亲水性蛋白质。蛋白序列比对和进化树分析表明,OnAP1-like 蛋白与蕙兰AP1-like蛋白一致性最高,进化距离最近。利用RT-qPCR对从文心兰不同时期不同器官中的OnAP1-like基因表达量进行分析,结果表明,同一器官不同发育时期比较,在叶中,花蕾期的表达量最高;在根中,随发育时间推移,表达量逐渐升高,至花后期达到最高;在花葶中的表达量的趋势与根相同。同一时期不同器官比较,抽葶前,根中表达量高于叶片;花蕾期,花瓣中的表达量最高;盛花期和花后期,花葶中的表达量最高。推测该基因在花的发育及形成中发挥作用。     

叶用莴苣LsHsp70基因的克隆及表达分析

 以叶用莴苣（Lactuca sativa L.）叶片为试材,采用RT-PCR结合RACE技术,克隆LsHsp70基因序列,并利用实时荧光定量PCR技术检测耐热品种‘Z36’和热敏品种‘S106’在不同高温胁迫下LsHsp70基因的表达情况。结果表明,LsHsp70基因的开放阅读框为2 094 bp,编码697个氨基酸,推测蛋白质分子量为74.1 kD,具有HSP70家族3个标签序列IDLGTTNS、VFDLGGGTFDVSVL和VILVGGSTRIPAV,与拟南芥Hsp70同源性高达92%。高温胁迫能够诱导LsHsp70表达;LsHsp70对37℃高温胁迫的响应比对42℃高温胁迫的响应更为显著和迅速;在相同胁迫温度下,耐热品种‘Z36’比热敏品种‘S106’对高温的应激反应迟缓,持续时间更长,说明该基因的表达与叶用莴苣耐热性有一定的关联。     

葡萄赤霉素受体基因VvGID1A 的分离、亚细胞定位及表达分析

 以‘藤稔’葡萄（Vitis vinifera × V. labrusca‘Fujiminori’）的花序、茎尖、叶片以及果实为 试材,应用RT-PCR 结合RACE 技术克隆得到GID1A 同源基因全长cDNA 序列,命名为VvGID1A（基因 登录号：JQ669511）,全长1 681 bp,含有1 个1 035 bp 的开放阅读框,编码344 个氨基酸,该氨基酸序 列还包含两个激素敏感酯酶家族保守的结构域HGG 和GXSXG。系统进化分析表明,VvGID1A 与蒺藜苜 蓿、棉花和拟南芥之间的一致性分别为70.25%、70.08%和68.21%。荧光定量RT-PCR 结果表明,VvGID1A 在葡萄花序、老叶和卷须中表达水平高于茎尖和幼叶,而在GA 处理果实中的表达水平低于未处理的对照 样品。瞬时表达载体的构建及洋葱表皮细胞转化后,洋葱表皮细胞的瞬时表达结果显示,该基因的表达 产物定位在细胞核上。     

柑橘转录因子基因CitMYB22的分离、表达及亚细胞定位分析

以‘资阳’香橙(Citrus junos‘Ziyang’)为材料,利用RT-PCR技术,分离到1个MYB基因,CitMYB22。比对分析发现,CitMYB22含有两个内含子,开放阅读框(ORF)为696 bp,可编码231个氨基酸残基的多肽。氨基酸聚类和结构分析表明,CitMYB22属于MYB类转录因子家族中的R2R3-MYB亚家族。进化树分析表明,CitMYB22与拟南芥参与逆境响应的R2R3-MYB亚家族成员At MYB15的同源性最高。克隆CitMYB22的ATG上游2 500 bp内启动子顺式元件,预测其含有多个与植物逆境和激素应答相关的顺式作用元件,如HSE、SARE和MBS等。亚细胞定位结果显示CitMYB22蛋白定位在细胞核中。实时定量结果表明,CitMYB22在叶、花中的表达量明显高于根和幼果,且在外源脱落酸、水杨酸、甲基茉莉酸、1–氨基环丙烷基羧酸以及高盐、脱水和4℃低温等非生物逆境胁迫下,均被诱导上调表达,推测CitMYB22可能与‘资阳’香橙的抗逆性相关。     

苹果NAD–苹果酸酶基因的克隆及在不同组织和果实发育阶段的表达分析

 NAD-malic enzyme（NAD-ME）是植物调控苹果酸代谢中的关键酶。以富士苹果（Malus × domestica Borkh.）叶片为试材,通过同源比对和RT-PCR 技术,克隆获得2 个NAD–苹果酸酶基因 （MdNAD-ME1 和MdNAD-ME2）。其ORF 分别为1 785 bp 和1 818 bp,推测其分别编码595 和605 个氨 基酸的多肽。氨基酸序列和结构分析显示,含有5 个保守的氨基酸区域（Ⅰ~Ⅴ）,包含2 个功能结构域： malic 和NAD_bind_1_malic_enz。进化树分析结果显示,MdNAD-ME1 属于α 组双子叶亚组,MdNAD-ME2 属于β 组双子叶亚组。荧光实时定量结果显示,MdNAD-ME 在被检测的组织中呈组成型表达,且在多种 组织中MdNAD-ME1 表达量高于MdNAD-ME2。在富士苹果果实不同发育阶段,MdNAD-ME1 与MdNAD-ME2 具有不同的表达模式。以上结果表明,克隆得到的MdNAD-ME1 和MdNAD-ME2 属于植物NAD-ME,在 苹果的生长和发育过程中MdNAD-ME1 和MdNAD-ME2 可能起到不同作用。     

银杏查尔酮合成酶基因启动子（GbCHSP）调控元件及功能分析

通过染色体步移方法从银杏（Ginkgo biloba L.）基因组中克隆到查尔酮合成酶基因（CHS）翻译起始位点上游1 711 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,该启动子片段中存在多个顺式作用元件,包括紫外/蓝光响应单元、植物激素响应单元、真菌诱导元件、MYB结合位点、TATA-box和CAAT-box等。亚克隆了CHS转录起始位点上游1 402 bp序列,将其与GUS基因构建融合表达载体pBI121 + CHSP,以pBI121-35S作为负对照,通过农杆菌（LBA4404）介导法分别转入烟草。结果表明,银杏CHS启动子序列能驱动GUS基因在烟草中的表达,表达具有组织特异性。GbCHSP的功能研究将有助于揭示银杏叶黄酮的积累与GbCHS基因表达的分子机理。     

苹果属观赏海棠McUFGT的克隆及其在不同叶色品种间的表达差异分析

为探讨UFGT基因在观赏海棠叶片呈色过程中的作用,以观赏海棠常紫红色类品种‘王族’叶片总RNA为模板,通过RACE扩增,获得一个长度为2 186 bp的cDNA序列,其编码区共1 425 bp,编码475个氨基酸,命名为McUFGT。利用高效液相色谱法和实时荧光定量PCR技术,对3个不同叶色的观赏海棠品种‘王族’（叶片常紫红色类）、‘绚丽’（新叶红色类）和‘火焰’（叶片常绿色类）叶片中的花色素苷含量、McUFGT相对表达量进行测定分析。结果表明,在3个品种中矢车菊色素苷是主要的花色素苷物质,并且随着叶片的生长发育,不同叶色品种间矢车菊色素苷差异显著,其中以叶片常紫红色品种‘王族’矢车菊色素苷积累最多。同时矢车菊色素苷含量的变化与McUFGT相对表达量变化趋势基本一致,说明McUFGT在苹果属观赏海棠叶片花色素苷合成及色泽形成过程中具有重要的作用。     

逆境诱导转录因子AtDREB2A 转化百合的研究

 以东方百合‘西伯利亚’为试验材料,探讨影响农杆菌转化效率的因素,优化了以无菌小 鳞片为外植体的遗传转化体系,通过农杆菌介导法将逆境诱导转录因子AtDREB2A 基因转入百合基因组 中。结果表明：外植体预培养3 d,侵染菌液浓度OD600 = 0.8,侵染时间20 min,25 ℃下共培养3 d,获 得的卡那霉素阳性植株率最高。对获得的59 株抗性单株进行PCR 检测,有28 个单株的DNA 经扩增后 产生了与阳性对照相同的特异扩增带。进一步对转基因阳性植株进行Southern 杂交鉴定,结果表明外源 基因已经整合到转化植株的基因组中。生理指标测定表明转基因植株的对高温的适应性有一定程度的提 高。