大麦组织培养研究进展（续）

当外植体在培养基上进行离体培养时．最常见的反应是形成愈伤组织，有关愈伤组的形态已有一些报道，其中Orton在1979年所作的研究最为详细，他把所观察到的愈伤组织分成A、B、E三种类型：A类愈伤组织为一些较大颗粒，质地很硬，黄色的愈伤组织与来自来成熟胚(Dale和Deambrogio 1979)和顶端分组织(Cheg和Smichl975)的愈伤组织相似，     

小麦WRKY转录因子的鉴定及其在胚性愈伤组织形成中的表达分析

为研究WRKY转录因子在小麦胚性愈伤组织形成中的功能,以小麦基因组信息和愈伤组织形成发育过程中的转录组数据为基础,利用生物信息学方法,在全基因组范围内进行小麦WRKY转录因子的鉴定,并对小麦胚性愈伤组织形成过程中TaWRKY基因的表达模式进行分析。结果表明,在全基因组范围内共鉴定到270个小麦WRKY转录因子（TaWRKY01~TaWRKY270）,根据WRKY保守结构域数量和锌指结构域类型可分为I、II、III三组,分别包含41、145和84个。在愈伤组织转录组文库中,鉴定到39个TaWRKY基因,其中27个与在全基因范围内鉴定到的TaWRKY基因相同,12个在小麦愈伤组织中特异表达。差异表达分析表明,11个TaWRKY基因差异表达,大部分在胚性愈伤组织培养3～15 d时下调表达,且在胚性愈伤组织中比同时期非胚性愈伤组织中表达量高,推测部分TaWRKY基因可能参与小麦胚性愈伤组织的形成。     

玉米自交系郑58和丹340幼胚再生体系的建立

研究选取9个优良玉米品种的自交系,以幼胚为外植体,以N6、MS培养基为基本培养基,诱导愈伤组织,探讨基因型、培养基类型、外植体大小、激素浓度等因素对愈伤组织诱导率的影响,分析不同基因型愈伤组织生长状态的差异,对诱导成功的愈伤组织进行分化和再生。研究结果表明,基因型对愈伤组织诱导率起决定作用,且基因型和培养基之间存在相互作用;外植体大小在1.5～2.0 mm时的幼胚较适合诱导胚性愈伤组织;2,4-D对玉米幼胚愈伤组织的诱导形成起关键作用,浓度在2.0～2.5 mg/L时大多能诱导出胚性愈伤组织。     

小麦愈伤组织再生相关基因TaTCP-1A的克隆及功能鉴定

为深入探讨小麦再生分子机制、给建立高效的小麦遗传转化受体系统奠定基础,通过电子拼接、RT-PCR及RACE等方法在小麦品种郑麦7698中分离到一个与小麦愈伤组织再生相关的候选基因TaTCP-1A。序列分析表明,该基因的cDNA序列全长为2 163bp,其中包含了一个1 623bp的开放阅读框,编码540个氨基酸。qRT-PCR结果表明,该基因具有组织表达特异性,在愈伤组织中表达量最高;在愈伤组织形成阶段,随诱导时间的延长,其表达量逐渐上升,当诱导11d时表达量达到峰值,随后呈下降趋势;此外,TaTCP-1A基因在胚性愈伤组织中的表达量高于非胚性愈伤组织。基因沉默结果表明,转TaTCP-1A RNAi小麦植株的再生率比对照降低了85.09%,这一结果初步证明该基因对小麦愈伤组织再生有一定的促进作用。     

农杆菌介导优良玉米自交系Ⅱ型胚性愈伤组织遗传转化体系的建立

以玉米自交系8902、340、4112未成熟幼胚为材料,诱导、继代筛选出良好的Ⅱ型胚性愈伤组织,用农杆菌(EHA105和LBA4404)介导法转化其愈伤组织.利用本室构建的植物双元表达载体中携带的GUS报告基因对农杆菌转化系统的条件进行了研究,如农杆菌的侵染浓度、菌种类型、侵染时间、A8(乙酰丁香酮)浓度及基因型等,建立了农杆菌介导优良玉米自交系Ⅱ型胚性愈伤组织高效遗传转化体系。     

小麦成熟胚诱导胚性愈伤组织的影响因素

为加快小麦成熟胚在转基因研究中的利用,以陕麦159成熟胚为外植体,通过胚性愈伤组织诱导,建立了一套有效的小麦愈伤组织诱导体系。研究表明,不同消毒处理、2,4-D浓度和接种方法对胚性愈伤出愈率的影响有极显著差异,不同浸种时间和培养基类型对胚性愈伤组织出愈率的影响无显著差异。采用次氯酸钠初次消毒20min,升汞二次消毒5min,消毒彻底,对种子损害较小;浸种时间18～20h易于成熟胚的剥取,且诱导的愈伤组织质量较好;MS培养基较1/2MS培养基诱导愈伤组织效果好,MS培养基2,4-D浓度为4mg.L-1时（30g蔗糖＋7g琼脂）胚性愈伤组织率最高,愈伤组织质量较好;完整胚诱导胚性愈伤组织率最高达84.17%,碎胚诱导胚性愈伤组织率最高达94.17%。     

培养基类型、碳源对朱砂根愈伤组织生长的影响

培养基、碳源是影响愈伤组织生长的重要因素,通过不同培养基类型、不同碳源以及蔗糖浓度对朱砂根愈伤组织生长的影响的试验,结果表明:最佳培养基类型为MS,最佳碳源为25 g.L-1蔗糖。     

光质对甘蔗愈伤组织分化出苗的影响

诱导甘蔗幼叶组织产生愈伤组织,经过继代培养使愈伤组织增殖,把不同继代次数的愈伤组织平均分成3组,分别采用红光、蓝光、白光照射处理进行试验,统计分析不同光质照射对愈伤组织培养诱导分化的影响。结果表明:红光对甘蔗愈伤组织的诱导分化出苗有明显的促进作用,白光次之,而蓝光最差。愈伤组织的继代次数越少,光质的影响越显著。光质对白化苗产生的影响没有显著差异,红光能明显降低或延缓愈伤组织诱导分化培养时的褐化,愈伤组织的继代次数越多,诱导分化培养时的褐化越严重。     

3个粳稻品种成熟胚分化和再生适宜激素配比研究

为研究不同激素配比对常用转基因受体秀水134、日本晴和中花11等3个粳稻品种愈伤组织分化和再生的影响,优化并建立这3个水稻品种高效的再生体系,以其愈伤组织作为外植体,选用6-BA、NAA、KT、TDZ等4种激素设计A1、A2、A3、A4、A5等5种不同的配比组合进行分化和成苗。结果表明,不同基因型水稻分化时所需最适激素组合不同,A4、A5和A1分别是秀水134、日本晴和中花11愈伤组织分化时的最适激素组合,3者愈伤组织分化率分别是99%、95%和97%;秀水134、日本晴和中花11分别在A4、A3和A1激素组合获得最佳的成苗率,成苗率分别是91%、94%和92%。研究优化了3个水稻品种的分化和再生效率。     

水稻愈伤组织中脱落酸特异诱导蛋白的纯化及分析

用硫酸铵分级沉淀、离子交换（DEAE Sepharose和TSK gel）的方法,结合SDS PAGE和2D电泳（two dimension electrophoresis）技术,从水稻愈伤组织中分离并精制了两个分子量相同（24.5 kD）, 等电点分别为61和6.9的脱落酸（ABA）特异诱导蛋白。Western blot印迹分析发现,这两个蛋白在不同组织中的表达差异明显。A1（pI 6.1）蛋白在ABA处理的水稻愈伤组织和种子胚中表达,但在未经ABA处理的材料(包括幼芽、愈伤组织)和白色干燥性愈伤组织中没有检测到表达;A2（pI 6.9）蛋白在经ABA处理材料、种胚和白色干燥性愈伤组织中检测到表达,在未经ABA处理的材料中没有检测到表达。推测这两个蛋白可能在胚（或不定胚）的形成过程中起重要作用。     

籼稻体细胞胚性与非胚性愈伤组织的若干生化指标及其再生能力的差异

水稻成熟胚离体培养诱导产生的愈伤组织有不同类型,从形态上分有乳白色、质地较硬、结构致密、不透明的愈伤组织,瘤状、易碎的乳黄色愈伤组织和质地较软、水渍状、半透明的白色愈伤组织等3种;从细胞形态和分化能力来看,则有胚性愈伤组织(EC)和非胚性愈伤组织(NC)之分。EC一般呈乳黄色,表面可见许多瘤状突起,且容易分开,细胞较小且规则一致,细胞质浓,液泡小,细胞分化能力强,NC则常为白色,表面光滑,其构成细胞大小不一致,细胞质稀,液泡较大,细胞分力能力差。本     

花生野生种花药试管内培养产生幼株

A·ligosa和另一个野生种亚种的花药于单核花粉粒时期,培养于M·S培养基 2mgNAA 0.5mgBA/1中,获得了愈伤组织。将愈伤组织转移到M·S培     

Effects of Different Explants and Basic Mediun on Callus Induction and Differentiation of Agave sisalana

研究4种基本培养基和3种剑麻外植体对愈伤组织诱导及分化的影响.结果表明,SH基本培养基对剑麻愈伤组织的诱导和分化效果最好,出愈率为100％,愈伤量大,分化率为21.1％;用于剑麻愈伤组织诱导的最佳外植体是剑麻叶片,其出愈率最高,愈伤量最大.在整个诱导和分化过程中,剑麻对N的需求不大,而低铵盐含量对愈伤组织的诱导和分化有利;在含有较高浓度的盐酸硫胺素(VB1)的培养基中,愈伤组织的诱导率、愈伤量和分化率都有显著提高;Cu、Mo、Co等微量元素和有机成分肌醇,对剑麻愈伤组织的诱导并非必需,但对愈伤组织的分化可能是极有利的.     

利用 HPLC 分析菠萝愈伤组织 DNA 甲基化水平

建立菠萝 DNA 甲基化水平的 HPLC 测定方法，分析菠萝愈伤组织 DNA 甲基化水平变化，为进一步研究菠萝 体细胞无性系变异机理奠定基础。通过对流动相和水解温度等条件的优化，建立菠萝 DNA 甲基化水平的检测方法。结 果表明，分离 C 和 5m-C 的最佳流动相为甲醇∶磷酸二氢钾∶三乙胺为 10∶90∶0.2（V/V），pH 3.0，DNA 的最佳水解 温度为 90 ℃。利用此体系分析菠萝愈伤组织和胚性愈伤组织的 DNA 甲基化变化，结果表明，菠萝愈伤组织在分化过 程中 DNA 总甲基化水平呈动态变化，变化范围为 5.14%~96.86%。此外，胚性愈伤组织甲基化水平低于非胚性愈伤组 织。推测 DNA 甲基化影响菠萝愈伤组织的分化及胚性愈伤组织的形成。     

冬小麦花药愈伤组织诱导率的遗传变异

选择愈伤组织诱导率高并来自不同系谱的冬小麦品种Centurk78、Norstar和Norwin作亲本进行两两杂交,然后评估其F_2群体的愈伤组织诱导率和愈伤组织活力。在3个组合中,只有Norwin×Norstar的愈伤组织诱导率表现出了显著的杂种优势,所有组合的愈伤组织活力均具有显著的杂种优势。Centurk78×Narstar和Norwing×Norstar愈伤组织诱导率的广义遗传力估计值分别为0.25和0.37,表明愈伤组织诱导率可以通过选择来加以改良。愈伤组织活力的遗传力估计值较低,为0.11—0.24。     

不同基本培养基和外植体对剑麻愈伤组织诱导及分化的影响

研究4种基本培养基和3种剑麻外植体对愈伤组织诱导及分化的影响。结果表明，SH基本培养基对剑麻愈伤组织的诱导和分化效果最好，出愈率为100％，愈伤量大，分化率为21.1％；用于剑麻愈伤组织诱导的最佳外植体是剑麻叶片，其出愈率最高，愈伤量最大。在整个诱导和分化过程中，剑麻对N的需求不大，而低铵盐含量对愈伤组织的诱导和分化有利；在含有较高浓度的盐酸硫胺素（VB1）的培养基中，愈伤组织的诱导率、愈伤量和分化率都有显著提高；Cu、Mo、Co等微量元素和有机成分肌醇，对剑麻愈伤组织的诱导并非必需，但对愈伤组织的分化可能是极有利的。     

内源激素IAA、ABA对大豆萌发子叶胚性愈伤组织诱导及其分化的调控

内源激素ＡＢＡ、ＩＡＡ含量的高低影响到不同大豆品种愈伤组织诱导和分化的难易，内源激素ＩＡＡ含量高，愈伤组织容易诱导；内源激素ＡＢＡ含量高，愈伤组织却容易分化。在分化培养过程中取不同时期的胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织，测定其ＡＢＡ、ＩＡＡ含量，发现胚性愈伤组织的ＡＢＡ和ＩＡＡ高于非胚性愈伤组织，并且均在培养的第６天达到最大值。然而，非胚性愈伤组织的ＡＢＡ／ＩＡＡ的比值较胚性愈伤组织晚２天达到最大值。     

小麦不同外植体的组织培养效果研究

良好的组织培养效果是提高植物基因转化效率的基础。以山东省近年来育成并大面积推广的10个优良品种（系）为材料,对这些品种的花药、幼穗、幼胚和成熟胚的组织培养效果进行研究,旨在筛选每一基因型最适合于组织培养的外植体类型,为应用基因工程技术进行小麦遗传改良提供基础材料。结果表明,禽伤诱导率和再生成苗率与基因型和外植体类型（花药、幼穗、幼胚和成熟胚）密切相关。8802在花药和成熟胚培养中表现突出,花药出愈率达119．5％,愈伤分化成苗率19．9％;烟农19的幼穗愈伤直接分化成苗率最高,这43．5％;8802、烟农19和潍麦8号三个基因型的幼胚培养效果差异不显著,其愈伤分化成苗率分别为26．3％、24．5％和24．8％。蔗糖浓度在3％～9％之间,对成熟胚的愈伤组织诱导率影响很小。高浓度蔗糖降低愈伤生长速度。在一定蔗糖浓度下,愈伤诱导率与2,4-D浓度密切相关,高浓度的2,4-D对愈伤组织再生不利。MS＋4mg／L2,4-D对于成熟胚的脱分化相对较好,MS和MS＋0．4mg／L NAA＋0．6mg／L KT作为成熟胚的愈伤组织再生培养基,对不同基因型具有一定的适用性。     

苎麻花药和未授粉子房离体培养的研究

1989—1991年试验结果表明,决定花粉愈伤组织发生串高低的关键因素是基因型。蔗糖浓度、低温预处理、热击(heat shock)等条件在一定程度上影响花粉愈伤组织发生率。添加有机附加物的培养基有利于愈伤组织生长,在2,4—D配以微量6—BA或KT最适宜于诱导苎麻单倍体愈伤组织。由未传粉子房的培养,不经愈伤组织、曾经直接获得一株白化苗,但至今为止尚未由花粉或未授粉子房来源的单倍体愈伤组织获得绿苗。     

影响大豆愈伤组织的诱导因素研究

比较MS、B5、N6三种基本培养基,发现MS适合作为诱导大豆愈伤组织的基本培养基.添加激素6-BA 0.5mg/L,2,4-D 2.0mg/L时愈伤组织诱导的效果最好,过高或过低的浓度激素均不利于愈伤组织的诱导和生长;不同外植体诱导愈伤组织的能力不一样,下胚轴诱导愈伤组织能力强于子叶;在所选择的六种大豆品种中,中黄13诱导愈伤组织的能力最强;光照条件为12h/d时有利于愈伤组织的诱导;培养基pH5.8～6.0时,愈伤组织的诱导率比较高.