棉花SSR-PCR反应体系的优化

为探索适宜棉花的SSR-PCR反应体系,采用L9(34)正交实验设计,研究了棉花SSR-PCR反应体系的主要成分对扩增结果的影响.试验结果表明,棉花SSR-PCR最适反应体系为:在20 μL反应体系中,TaqDNA聚合酶用量为1 U、dNTP浓度0.2 mmol/L、引物浓度0.6 μmol/L、Mg2 浓度1.0 mmol/L和模板DNA50 ng;引物退火温度为55℃～58℃.利用六种棉花材料和10条不同引物验证此反应体系,8%聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示,扩增结果在100～300 bp,反应体系的稳定性和可重复性较好.     

食用向日葵SSR-PCR反应体系的优化

为建立食用向日葵分子标记反应体系,以食用向日葵四叶期叶片为DNA模板提取材料,采用单因素试验和正交试验设计,对SSR-PCR反应体系中的6因素(10×PCR Buffer、Mg2+、d NTPs、引物、Taq DNA聚合酶和DNA模板)在5水平上进行正交优化试验,并比较了不同浓度Mg2+、Taq DNA聚合酶、模板DNA对扩增效果的影响,结果表明,各因素水平变化对反应体系的影响为Mg2+Taq DNA聚合酶(引物)DNA模板10×PCR Bufferd NTPs。最终建立食用向日葵SSR-PCR最佳反应体系为:在总体系为20μL的SSR-PCR反应体系中包括10×PCR Buffer 0.2mmol/L、Mg2+2.0 mmol/L、d NTPs 1.8 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.2 U、DNA 50 ng、引物1.5 mmol/L。     

马铃薯SSR-PCR反应体系的建立和优化

应用L16(45)正交设计对影响马铃薯SSR-PCR的主要参数进行优化,建立适于马铃薯SSR-PCR反应的最佳体系。结果表明:各因素不同水平浓度对PCR反应结果均有显著影响。马铃薯SSR-PCR优化反应体系为:10×PCR Buffer 1.0μl、模板DNA约30 ng、dNTP 200 mol/L、SSR引物66 ng、Taq DNA聚合酶0.25 U、Mg2+2.25 mmol/L,加ddH2O至终体积10.0μl。PCR扩增程序如下:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,53℃复性1 min,72℃延伸1.5 min,共35个循环;72℃延伸10 min,然后4℃保存。     

月季SSR-PCR反应体系的建立和优化

采用L16(54)正交设计和二因素完全随机试验,分析了月季SSR-PCR反应体系的主要成分Taq DNA聚合酶、样本浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度以及引物浓度对扩增结果的影响,建立了适合月季的SSR反应体系.研究结果表明:在20μL反应体系中,Taq DNA聚合酶宜加入1.5U,样本最适宜浓度为30～40 ng,Mg2+的最适浓度为1～1.5 mmol/L,dNTP最适浓度为0.2 mmol/L,单引物的最适浓度均为1μmol/L.用建成的反应体系对19对引物筛选,对12个月季品种扩增,3%的琼脂糖凝胶电泳检测,品种间DNA谱带多态性丰富,证明该体系稳定可靠.     

苹果SSR-PCR反应体系的建立与优化

为建立苹果属植物SSR-PCR反应优化体系,采用L16(45)正交实验和退火温度梯度实验,分析反应体系中使用的模板、引物、Mg2+、dNTPs以及Top Taq酶浓度对扩增产物的影响,并对这5个因素进行4个水平不同浓度梯度的筛选和优化.结果表明,引物浓度对SSR-PCR反应体系的影响最大,通过综合分析最终确定SSR-P...     

绣球SSR-PCR反应体系的建立与优化

为了建立适合绣球的SSR-PCR反应体系,采用正交设计L25(56)对影响SSR-PCR反应体系的5个主要因素(Mg2+、d NTPs、引物、DNA模板和Taq聚合酶)在5个水平上进行优化,筛选出每个因素的最佳水平,建立适合绣球的SSR-PCR反应体系。结果表明,20μL的SSR-PCR反应体系中,DNA模板用量为60 ng,Mg2+浓度为1.5 mmol/L,d NTPs浓度为0.3 mmol/L,引物浓度为0.4μmol/L,Taq聚合酶用量为0.8 U。扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,最佳温度退火40 s,72℃1 min,33个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。选用10个绣球品种对建立的SSR-PCR反应体系进行验证,结果表明该体系具有较好的稳定性和通用性。建立和优化的绣球SSR-PCR反应体系,为应用SSR分子标记技术开展绣球属植物遗传育种研究提供了理论依据和技术参考。     

郁金香SSR-PCR反应体系的建立与优化

为建立郁金香SSR-PCR反应体系,本研究以36个荷兰引进的郁金香栽培品种和5个产于中国新疆的野生种为试验材料,采用单因素试验和L_(16)(4~5)正交设计相结合的方法,对影响郁金香SSR-PCR反应的Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度、模板DNA、Taq酶用量进行优化,建立最佳的SSR-PCR反应体系,并利用3对引物在41份郁金香材料中验证反应体系的稳定性。结果表明:在20μL的PCR反应体系中,10×PCR Buffer (Mg~(2+)free) 2μL、Mg~(2+)2.0 mmol/L、dNTPs 0.75 mmol/L、引物2.0μmol/L、模板DNA 10 ng、Taq酶0.15 U为最优体系;通过正交试验确定5个因子对SSR-PCR体系的影响程度为:模板DNATaq酶引物Mg~(2+)d NTPs。筛选出的3对引物在41份郁金香材料中均可扩增出目的条带,表明该体系的稳定性好。本研究建立SSR-PCR反应体系,为郁金香SSR标记的开发以及遗传多样性分析、品种指纹图谱构建、种质资源鉴定等方面提供了帮助。     

鸭茅SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

应用L16(44)正交设计对影响鸭茅SSR-PCR的主要参数进行优化,建立适于鸭茅的SSR反应体系和扩增程序.在15μL体系中各反应的最适合含量为:50ng模板DNA,240μmol/L dNTP,0.4μmol/L SSR引物,1.0 U Taq DNA聚合酶,1.5μL 10×PCR Buffer,2.5mmol/L MgC12.PCR适宜扩增程序为:94℃预变性4min,94℃变性30 s,52℃复性30 s,72℃延伸1 min,共35个循环,72℃延伸10 min,4℃保存.并对引物最适合退火温度进行优化,最终确定引物退火温度为48～52℃.同时选用100对鸭茅引物对4份材料进行扩增,筛选出条带清晰,多态性好的引物30对.用于鸭茅SSR标记的进一步研究.     

正交设计优化狗牙根SSR-PCR反应体系

以SDS法提取的狗牙根(Cynodon spp.)叶片DNA为模板,应用正交试验设计,从Mg2 、dNTP、引物和DNA聚合酶4种因素三个水平,对SSR扩增效果进行研究,并通过比较不同浓度模板DNA的浓度对PCR扩增的影响,确立适合狗牙根SSR-PCR反应的最佳体系.结果表明:各因素不同水平浓度对PCR反应结果均有显著影响,狗牙根SSR-PCR优化反应体系为:10×buffer、60 ng模板DNA、Mg2 2.5 mmol/L、dNTP 200 μmol/L、primer 0.8 μmol/L和Taq DNA聚合酶0.5U,总体积10 μL.运用该体系对包括三种10份优良坪用型狗牙根进行了检验,证明该体系稳定可靠.这一优化体系的建立为今后利用SSR标记技术进行狗牙根遗传多样性研究、种质资源鉴定以及亲缘关系分析等提供依据.     

元宝枫SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

本研究采用改良的CTAB法提取元宝枫基因组DNA,并使用L16(45)正交试验设计.通过5因素4水平实验,筛选Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物浓度、Mg2+、模板DNA浓度及其用量,建立并优化元宝枫(Acer truncatum)的最佳SSR-PCR反应体系,即总体积20 μL,Taq DNA聚合酶、dNTPs...     

香菇SSR-PCR技术体系的建立及其在遗传多样性分析中的初步应用

摘 要: 利用ISSR-抑制PCR法结合Primer 3软件开发香菇特异性的SSR引物,并采用L16（45）正交试验设计,对影响香菇SSR-PCR的主要因素进行了优化筛选,建立了最佳的SSR-PCR反应体系。在20μl反应体系中,包含1.5mmol/L Mg2+,75ng模板DNA,0.25mmol/L dNTPs,0.50μmol/L引物及1.5U Taq酶。梯度PCR试验筛选得到相应引物的最佳退火温度为62℃。以该体系为基础,应用5对引物扩增8个香菇菌株的基因组DNA,均能获得理想结果,聚类分析结果能较好地反映供试菌株的地理来源关系。以0.5 的相似性为分割点,8个菌株可分成2大类群。类群Ⅰ主要由北方菌株组成,类群Ⅱ由南方菌株组成。     

花生SSR-PCR体系的优化

以花生品种丰花3号为材料,研究了花生SSR技术中PCR反应体系的主要成分对SSR 扩增效果的影响及不同引物的退火温度。结果表明dNTP 对扩增影响较大,每对引物都有其扩增适合的退火温度。确立了适合花生SSR 分子标记研究的优化体系。最终确定总反应体系为20 μl,其中25 mM MgCl2 1.5 μl,2.5 mM dNTP 1.6 μl,5 U/μl Taq 酶 0.17 μl,100 ng/μl模板DNA 0.4 μl,2.5 mM 引物 5 μl。优化后的扩增程序退火温度为54℃。     

白蜡属SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

本研究建立了适合白蜡SSR-PCR反应的最佳体系,并利用该体系从50对白蜡引物中筛选出了3对条带清晰、多态性好的引物,用于白蜡SSR标记的进一步研究。该研究采用L₁₆(4⁵正交设计和单因素试验对影响白蜡SSR-PCR的Taq聚合酶用量、Mg²⁺浓度、DNA模板浓度、dNTP浓度和引物浓度等5个因素在4水平上进行筛选。优化后的白蜡SSR反应体系为：Mg²⁺ (25 mmol/L) 0.8μL、引物(10μmol/L) 0.2μL、DNTP (10 mmol/L) 0.3μL、Taq酶(5 U/μL) 0.05μL、DNA模板(5~10 ng/μL) 2.00μL、10×PCR缓冲液1.0μL,ddH2O 5.45μL,总体积10.0μL。该结果为今后利用SSR-PCR标记技术研究分析白蜡奠定了基础。     

二月兰SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选

为建立适合二月兰的SSR-PCR反应体系,采用正交试验设计方法对影响二月兰SSR反应体系的5个因素(DNA模板、Mg~(2+)、d NTPs、引物和Taq聚合酶)进行优化试验,筛选出每个因素的最佳水平。结果表明,10μL反应体系中,Mg~(2+)浓度2.0 mmol/L,d NTPs浓度0.4 mmol/L,引物浓度0.6μmol/L,DNA模板量20 ng,Taq聚合酶量0.6 U。以3份二月兰基因组DNA为模板,利用优化后的SSR-PCR反应体系进行引物筛选,从50对SSR引物中成功筛选出扩增条带清晰、具有多态性的引物有12对,证明该反应体系具有较好的稳定性和通用性。研究建立和优化的二月兰SSR-PCR反应体系,为进一步利用SSR标记技术开展二月兰分子生物学研究提供了理论依据和技术参考。     

油葵SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选

为了获得适合油葵的SSR-PCR反应体系,通过采用控制变量法对影响SSR反应体系的主要因素进行优化,研究Mg²⁺浓度、dNTPs浓度、Taq酶浓度、引物浓度、退火温度等因素。结果表明各因素的终浓度分别在Mg²⁺浓度2.5 mmol/L、dNTPs浓度0.2 mmol/L、Taq酶量0.5 U、引物浓度0.4 μmol/L及退火温度为53.9℃时最为适合。通过试验优化后的体系筛选引物,最终从50对引物筛得19对多态性好的引物可进行下一步的研究。     

黄瓜cpSSR-PCR反应体系优化及应用

叶绿体微卫星(chloroplast microsatellite,cpSSR)是近几年发展起来的新型高效分子标记,在植物系统发育和基因漂移研究中有广泛应用.在前期开发黄瓜cpSSR引物的研究基础上,本文研究了Taq酶量、MgCl2浓度、dNTPs浓度、模板DNA质量和浓度、循环次数等参数对cpSSR-PCR扩增效果的影响,获得优化的反应体系,即15μL体积包括:1×Taq酶缓冲液,0.5UTaq聚合酶,0.2μmol/L引物,0.2mmol/LdNTPs,15 mmol/LMgCl2,约10 ng模板DNA,循环25次.采用该优化体系,以已开发的黄瓜cpSSR引物,对12份黄瓜材料进行了重复性PCR扩增.结果发现国外种质中存在3种单倍型,而在国内种质中只检测到2种单倍型,说明在本研究所用的材料中,国外种质叶绿体遗传差异明显大于国内栽培种.此结果说明优化的cpSSR反应体系具有稳定性和可靠性.