基于重组外膜蛋白P2的副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA方法的建立

旨在建立一种基于重组副猪嗜血杆菌(HPS)外膜蛋白(Omp) P2的检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法.将重组表达的Omp P2纯化后作为ELISA包被抗原,建立了一种基于重组P2蛋白的间接ELISA方法,并对此方法的反应条件进行了优化.确定ELISA的最佳条件为:抗原包被浓度为1.5 μg/mL,被检血清1∶8...     

副猪嗜血杆菌间接血凝诊断液的制备

【目的】建立一种便于检测副猪嗜血杆菌抗体的方法。【方法】将分离纯化的副猪嗜血杆菌5型超声裂解后,致敏双醛处理的健康绵羊红细胞,制成副猪嗜血杆菌5型间接血凝诊断液,检测该诊断液的活力及特异性。【结果】该诊断液特异性强,仅与副猪嗜血杆菌5型阳性血清发生凝集反应。活力也比较高,达到1:512以上,可以用其进行副猪嗜血杆菌疫苗免疫后抗体检测。【结论】该间接血凝诊断液成功制备为广大兽医化验人员提供一种简单、快速、经济的检测副猪嗜血杆菌抗体的方法,为副猪嗜血杆菌病的诊断和防治提供一种有效的手段     

猪链球菌纳米PCR检测方法的建立和应用

为了建立一种高效、灵敏的猪链球菌(SS)检测方法,针对SS的谷氨酸脱氢酶基因(gdh)合成特异性引物,通过优化退火温度与引物浓度,经特异性、敏感性、重复性以及临床样品检测,建立了SS的纳米PCR检测方法.特异性试验结果显示,该方法仅能从SS的基因组序列中扩增得到687 bp的特异性序列,与猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆...     

单抗夹心LAB-ELISA检测猪伪狂犬病病毒的研究

在伪狂犬病病毒种特异性单克隆抗体的基础上建立了检测该病毒抗原的单抗夹心LAB－ELISA方法。结果表明，该方法不与其他常见病原体产生交叉反应，抗原的最低检出含量为8．9μg/mL。检测时最佳采样部位是猪脑及扁桃体。对人工感染兔、自然感染猪以及临床可疑病猪的检出率分别为75％，75％及72．7％，因此本方法是一种具有良好特异性及较好敏感性的诊断方法。     

猪流行性腹泻病毒N重组表达蛋白间接ELISA检测方法建立

为了检测猪血清中猪流行性腹泻病毒抗体水平,用纯化的猪流行性腹泻病毒N基因重组表达蛋白作为包被抗原,建立了检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA方法。ELISA的最佳工作条件是:抗原包被浓度为0.5μg/m L,包被时间4℃过夜,5%脱脂乳的PBS封闭37℃2 h及4℃过夜。血清稀释度为1∶100;37℃作用45 min,辣根过氧化物酶标记兔抗猪Ig G稀释度为1∶10 000,37℃温育60 min,底物显色37℃15 min。抗体临界值为OD450nm≥0.30判为阳性,OD450nm≤0.27判为阴性,介于二者之间判为可疑。经重复性试验和交叉试验,结果表明,该方法特异性强、灵敏度高、重复性好。用已建立的ELISA方法检测临床血清样本184份,总阳性率为68.5%。     

猪生长激素ELISA检测体系的建立

本文分别以自制猪生长激素单克隆抗体及兔抗猪生长激素IgG就影响检测elisa(酶联免疫吸附法)体系因素进行探讨,建立了检测猪生长激素的elisa方法。猪生长激素单克隆抗体的最适操作参考值为：单抗最佳包被浓度为3μg/mL,包被条件为4℃过夜,5%羊血清封闭1h,兔抗猪生长激素IgG 最佳工作浓度为2μg/mL。     

猪圆环病毒2型间接ELISA方法的建立

为了猪圆环病毒2型（PCV2）抗体,本研究建立了快速、敏感的ELISA诊断方法。本研究应用原核表达的PCV2-Cap蛋白作为包被抗原,通过抗原最适包被浓度和兔抗猪IgG最佳稀释浓度的确定,待检血清稀释度的选择,阴阳性临界值的确定,然后进行特异性测定、重复性测定和符合率比较等,建立检测PCV2抗体的间接ELISA方法。结果显示,建立的间接ELISA方法只能检测出PCV2阳性血清;3次重复性试验的差异不显著;与韩国JBT公司的PCV2试剂盒的符合率达到了92.5%;对采集福建省内多个猪场204份血清样品进行检测,其阳性率达到了76.5%。实验表明,建立的检测PCV2抗体的间接ELISA方法具有特异性强、重复性和稳定性好的特点,可用于PCV2抗体的血清学诊断和流行病学调查。     

分泌抗猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

采用单克隆抗体制备技术,建立了分泌抗猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株,液氮保存4年后复苏,细胞在HAT选择培养基中生长旺盛,分泌抗体稳定,分别命名为YNF1,YNF2,YNF3,YNF4,杂交瘤细胞染色体数介于96~115条。细胞培养上清和腹水的单抗间接ELISA效价分别为1∶80~1∶160和1∶5 000~1∶10 000。在间接ELISA和夹心ELISA检测中单抗与猪瘟病毒呈特异性反应,与正常的猪、兔肾组织提取液及其血清Ig无交叉。抗体蛋白属IgG类,亚类及轻链分别为IgG1/λ,IgG2a/κ,IgG2a/λ,IgG1/λ。结果表明,4株杂交瘤是分泌抗猪瘟病毒单克隆抗体的细胞株,可长期传代无限分泌单抗,是进一步研究猪瘟病毒和开发敏感、特异、快速诊断猪瘟试剂盒和试纸探针的免疫学特异性试剂来源。     

新城疫病毒HN蛋白单克隆抗体的制备及其抗原捕捉ELISA方法的建立

为建立一种快速的新城疫病毒病原检测方法。本研究以原核表达的重组HN蛋白免疫7周龄BALB/c雌鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经间接ELISA方法筛选,成功获得了1株能稳定分泌抗新城疫病毒HN蛋白的McAb杂交瘤细胞,命名为4E8,4E8亚类鉴定为重链属于IgG2a,轻链属于κ链。以多克隆抗体作为包被抗体、单克隆抗体4E8作为检测抗体,通过双抗夹心ELISA各个反应条件的优化,建立检测新城疫病毒抗原捕捉ELISA方法。该方法对EDSV、ITLV、IBV、IBDV不发生交叉反应,其敏感性比HA试验要高4倍以上,与RT-PCR相比较,符合率、敏感性和特异性分别为95.6%、93.3%、96.1%。本研究建立的NDV AC-ELISA有良好的重复性、敏感性和特异性,可应用于新城疫病毒感染的早期诊断。     

青海省部分地区副猪嗜血杆菌流行病学研究

为了明确青海省4个地区12个猪场副猪嗜血杆菌病的流行情况,应用间接血凝对不同猪场639份血清进行了检测;对疑似副猪嗜血杆菌病的15份病料进行了病原分离鉴定,应用琼脂扩散试验对分离菌进行了分型.结果4个地区副猪嗜血杆菌最高阳性率为58.73%,最低阳性率为0,平均阳性率为25.19%;从疑似副猪嗜血杆菌病患病猪的肺脏和腹膜中分离到2株革兰氏阴性细小杆菌,经生化试验和PER鉴定,确定分离菌为副猪嗜血杆菌,分型结果为副猪嗜血杆菌血清5型(QH0804)和7型(QH0811).结果表明,副猪嗜血杆菌病在4个地区一些猪场有不同程度的流行和发生.这一结果为该地区有效控制该病防制提供了依据.     

赤羽病病毒单克隆抗体的制备及c-ELISA抗体检测方法建立

为建立一种用于快速检测赤羽病病毒抗体的竞争ELISA法。用AKV病毒免疫Balb/C小鼠,将其脾细胞与SP2/0细胞进行免疫融合,以获得抗AKV的单克隆抗体;利用Bac-to-Bac杆状病毒表达的SBV N蛋白作为诊断特异性抗原,山羊抗鼠HRP-IgG为二抗,建立并优化AKV抗体检测的竞争ELISA方法。得到一株持续稳定繁殖的能够分泌单抗AKV核蛋白抗体的杂交瘤细胞株,单抗亚型鉴定为：重链IgG1,轻链kappa,仅能与AKV病毒呈阳性反应,与BTV、FAMD、EHDV病毒等病毒抗原不发生特异性反应;建立的检测AKV抗体ELISA检测方法,诊断抗原最佳包被浓度为0.5μg/mL,1∶1 000抗体稀释比,1∶50血清稀释比,1∶2 000二抗稀释比,封闭条件为5%BSA,37℃封闭2 h,确定了血清抑制率大于等于44%时为阳性,小于44%为阴性;所建立的ELISA方法敏感性和特异性鉴定结果与ID Screen AKV Competition检测试剂盒一致。本试验成功制备出一株分泌针对AKV N蛋白的杂交瘤细胞系,建立的ELISA检测方法能够用于检测动物AKV抗体,为进一步开展AKV抗体...     

副猪嗜血杆菌鉴定分型方法研究现状

随着养殖水平的提高,近年来,副猪嗜血杆菌(HPS)在各猪场引起多发性浆膜炎和关节炎的报道屡见不鲜,已从多个省市地区分离出副猪嗜血杆菌,HPS的血清型复杂,用传统的方法往往不能达到对其快速准确鉴定的目的。大量研究表明不同血清型HPS毒株其毒力和致病力存在差异,因此,找出一种敏感性、特异性与重复性都非常良好的分型方法,对副猪嗜血杆菌病的防控有着重要的意义。     

猪源支气管败血波氏杆菌间接血凝诊断方法的建立

用引起猪传染性萎缩性鼻炎的支气管败血波氏杆菌全菌抗原致敏经戊二醛处理的绵羊红细胞,制备成间接血凝试验抗原,通过IHA来检测由支气管败血杆菌引起的猪传染性萎缩性鼻炎血清抗体。致敏绵羊红细胞的最佳抗原浓度为100μg/mL,血清效价≥1∶8即为阳性,效价≤1∶4者判为阴性,该方法具有很好的敏感性、特异性和可重复性,而且操作简单,适合大范围推广应用。     

副猪嗜血杆菌高免血清的制备与应用

利用华中农业大学蔡旭旺博士分离鉴定的副猪嗜血杆菌作为标准菌株培养灭活后,两次免疫家兔后,耳静脉攻毒,心脏采血,琼扩试验检测抗体效价,抗体在1:8以上颈静脉放血,分离血清,用于琼扩试验检测本室从河南省发病猪场分离鉴定的副猪嗜血杆菌的血清型,所分离的33株菌中有12株4型,9株5型,6株13型,3株14型,2株12型,1株2型,未分出其它血清型。结果表明河南省副猪嗜血杆菌主要以4型、5型和13型为主要流行的血清型。     

ELISA在检测动物组织氯霉素残留中的应用

采用酶联免疫吸附实验 (Enzyme-linked Immunosorbent Assay ELISA)方法,筛查和定量检测氯霉素（Chloramphenicol）。试样经过乙酸乙酯的萃取和正己烷的净化,在温育过程中,将特异性抗体（兔抗CAP）、酶标记CAP（酶结合物）和CAP标准品或样品,加入预先包被了绵羊抗兔IgG抗体的孔内。特异性的抗体便被固定抗体所结合。与此同时,游离的CAP（存在于标准品或样品）和酶结合CAP便互相竟争CAP抗体结合部位（竞争性酶免检测）。然后温育1h洗涤除去非结合（酶标记）试剂。加入底物,结合的酶结合物可将无色的底物转化为有色产物。加入硫酸,终止底物反应。用装有450nm滤光片的酶标仪进行检测,吸光度值与样品中的CAP浓度成反比。试验结果表明,该方法在0.025~2ng/ml范围内相关系数（R2）大于0.995,检测下限0.02 μg/kg,回收率为78.2%。     

副猪嗜血杆菌hhdB基因的鉴定和分析

为了明确副猪嗜血杆菌致病菌株的毒力相关因子,从广东省不同地区发病猪场送检病猪中分离到9株细菌(H1~H9),并对其hhdB基因进行了鉴定和分析。结果显示,所分离的9株细菌经形态观察、生化特性鉴定和PCR鉴定为副猪嗜血杆菌阳性,并具有卫星现象和不溶血特征。用hhdB基因引物从分离菌株中扩增到了特异性片段,序列分析表明,所获得的hhdB基因序列与GenBank中副猪嗜血杆菌SH0165的hhdB基因同源性为99%,分离菌株hh-dB基因之间序列同源性为97.5%~99.8%,推导的氨基酸序列与少数放线杆菌、杜克雷嗜血杆菌的溶血素激活蛋白具有一定的相似性。RT-PCR扩增到了hhdB基因的目的条带,表明该基因在分离菌株中得到了相应的表达。这将为副猪嗜血杆菌致病菌株毒力特征基因的鉴定以及副猪嗜血杆菌致病机理的研究奠定基础。     

菌落聚合酶链反应检测支气管败血波氏杆菌

根据支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica) 鞭毛蛋白基因的上游序列设计1对引物Fla1和Fla2,采用菌落PCR方法扩增目的基因片段来检测支气管败血波氏杆菌。利用该方法成功的从8株支气管败血波氏杆菌中扩增出237 bp左右的特异性目的片段。特异性试验表明,该方法对大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪链球菌和副猪嗜血杆菌均无交叉性反应。灵敏性试验表明,将单个菌落稀释105倍利用此菌落PCR仍能扩增到相应的目的片段。结果表明建立的菌落PCR方法对支气管败血波氏杆菌的检测敏感性高、特异性强,可用于Bb感染的诊断和流行病学调查。     

副猪嗜血杆菌中毒素蛋白基因hipA的生物信息学分析

为预测毒素蛋白HipA的二级结构和B细胞抗原表位,首先从GenBank中查找副猪嗜血杆菌毒素蛋白基因hipA的序列,应用生物信息学方法,对副猪嗜血杆菌毒素蛋白HipA的理化性质、二级结构和B细胞抗原表位进行预测。结果显示,HipA蛋白的理论等电点为7.23,前50个氨基酸为信号肽,二级结构的预测结果显示该酶主要以α螺旋、无规则卷曲和延伸链为主,只有少数的β转角;推测该蛋白有17个B细胞优势抗原表位区域。该研究为进一步研究分析副猪嗜血杆菌毒素蛋白HipA的功能奠定理论基础。     

检测传染性支气管炎抗体NP-ELISA方法的建立

【研究目的】建立可在临床上检测鸡传染性支气管炎抗体的检测IBV抗体的间接ELISA方法;【方法】以表达的重组IBV NP 蛋白为包被抗原,将之包被于聚苯乙烯酶标板上,以封闭液进行封闭,然后加待检血清在37℃作用1h,洗涤后加酶标兔抗鸡IgG抗体,在37℃作用1h,加底物显色,终止反应后测定OD值;【结果】抗原包被浓度为1.45mg/ml,待检血清最佳稀释度为1:40,酶标二抗最佳工作浓度为1:1000,确定阳性判定标准为OD450≥0.314。NP-ELISA与AIV H9、H5、H7、IBD、ND、EDS76 的标准阳性血清不发生交叉反应,具有良好的特异性;【结论】NP-ELISA具有特异性强、灵敏度高、重复性好、方便快速的特点,可用于临床IB抗体的检测。     

类圆环病毒因子P1结构蛋白表位肽抗体的制备及应用

旨为制备兔抗类猪圆环病毒因子P1的特异性抗体,对其在病原学方面的应用进行研究.采用人工合成选定的表位肽,将其与载体蛋白KLH偶联后免疫新西兰大白兔制备抗P1多克隆抗体,通过免疫组化对该多抗与P1的反应性进行检测.获得了抗P1多克隆抗体;免疫组化结果显示抗体可与P1病毒蛋白出现特异性反应.偶联后的P1表位肽具有免疫原性,...