抑制消减杂交技术筛选鹅产蛋期差异表达基因

[目的]鉴定筛选鹅产蛋与就巢差异表达基因。[方法]应用抑制消减杂交技术构建鹅产蛋与就巢鹅卵巢组织双向cDNA文库,获得差异表达基因。[结果]从双向文库随机挑选单菌落进行PCR验证,结果表明文库质量良好。选取654个阳性克隆进行测序分析,获得641条表达序列标签（ESTs）。对ESTs进行去除载体序列、质量检测、聚类及拼接,经Blast比对,有166条ESTs找到与之匹配的同源序列,其中92个是功能基因。[结论]比较就巢与产蛋SSH文库,发现产蛋特异性基因文库中参与物质能量代谢、细胞防御的基因较多,而在就巢SSH库中参与细胞凋亡、信号转导及细胞结构的基因出现频率较高。该结果对进一步研究鹅卵泡发育及繁殖力分子标记筛选打下了基础。     

水稻抗稻瘟病SSH-cDNA抗性文库中差异表达基因的鉴定及分析

[目的]鉴定、分析水稻抗稻瘟病SSH-cDNA文库中的差异表达基因。[方法]以接种稻瘟菌小种E1的水稻品种吉粳88和四丰43为材料,构建SSH-cDNA文库,随机挑选138个阳性克隆测序并进行Blast比对分析。[结果]聚类后得到78条非冗余ESTs,其中18条（23.1%）未找到同源性匹配,12条（15.4%）与未知功能蛋白同源性较高;其余48条与已知功能蛋白同源性较高。[结论]该研究可为控制和防治稻瘟病提供新的理论和途径。     

稻瘟菌P-ATPase基因MoCTA3的克隆及表达分析

为分析P-ATPase基因与稻瘟菌致病性的相关性,从稻瘟菌中克隆了一个P-ATPase基因MoCTA3,然后对其进行了序列分析和氨基酸序列比对,并利用qRT-PCR检测了该基因在稻瘟菌侵染水稻叶片不同时期以及菌丝阶段的表达情况。结果表明该基因全长3 747 bp,含有6个外显子和5个内含子,编码1 096个氨基酸,含有7个跨膜结构域,第24～98位有一个保守的钙离子转运结构域;其编码氨基酸与朱红丛赤壳、尖孢镰刀菌、蝗绿僵菌、炭疽菌等真菌的P-ATPase氨基酸相似性分别为77%、78%、83%和79%;基因表达结果显示该基因在菌丝阶段的表达量明显高于孢子阶段和侵染阶段,且在孢子侵染水稻过程中随侵染时间延长表达量逐渐升高,72 h时达到高峰,随后降低,说明MoCTA3可能参与了稻瘟菌的侵染过程,在稻瘟菌的致病性方面具有重要作用。     

防治稻瘟菌药剂的筛选

对于稻瘟病的防治,在生产上仍然是以化学防治为主,本文通过室内毒力测定方法,筛选对稻瘟病防效较好的药剂。本试验选用六种防治稻瘟菌病害的主要化学药剂:多菌灵、三环唑、苯醚甲环唑、咪鲜胺、嘧菌酯、稻瘟灵做为研究对象。对两株稻瘟菌进行毒力测定。研究的实验结果表明:嘧菌酯对稻瘟菌的抑菌效果最好,其平均EC50值为0.0520μg/ml,稻瘟灵、咪鲜胺、多菌灵、苯醚甲环唑、三环唑的抑菌效果依次降低。嘧菌酯对于水稻的稻瘟病来说防治效果好于其他的五种药剂,可以在生产上广泛推广。     

软腐病菌诱导的大白菜抑制差减杂交文库构建及分析

利用抑制差减杂交技术构建了软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)侵染诱导的结球白菜叶片cDNA文库。文库质量检测表明,差减杂交效率较高,质量较好。随机挑取单克隆进行单向测序,获得1 107条长度大于100 bp、质量较好的ESTs序列。利用DNAstar5.0对上述ESTs进行聚类,共获取753个非冗余EST,包括有564个为单拷贝序列(Singletons)和189个重叠群(Contigs)。所获得的编码功能已知的EST有508个,将这些EST进行功能分类,可以看出所代表的基因参与植物体内的各种代谢反应,其中参与初级代谢和能量代谢的最多(33.3%),其次是参与抗病/防卫反应(12.6%)、再次为参与信号传导(11.4%)和蛋白质合成与加工(9.4%),参与细胞的结构与生长发育、物质运输、转录调控等过程的基因相对较少。RT-PCR分析结果表明,MAPK、SA、ROS等信号通路参与软腐病菌诱导的大白菜抗病防卫反应。     

利用抑制消减杂交技术筛选猪蛔虫性别差异表达基因

 为了筛选线虫的性别特异性基因，为线虫乃至寄生虫的性别控制提供新的工具，本研究选择猪蛔虫（Ascaris suum）为模型，分别提取雌性和雄性成虫的mRNA后，采用Clontech公司的PCR-selectTM试剂盒进行反转录合成cDNA并进行抑制消减杂交（SSH），构建猪蛔虫雌、雄虫性别差异表达的消减cDNA文库，并采用地高辛（DIG）标记的cDNA探针进行Southern 杂交检验所构建文库的消减效率。结果表明，雌、雄虫性别差异表达的消减cDNA文库均具有很强的性别特异性。随机从各库中各抽取25个克隆进行测序及在线BLAST分析，发现在25个雄虫ESTs中有20个已知ESTs，5个新的ESTs；25个雌虫ESTs中有11个已知ESTs，还有8个可能为新基因。猪蛔虫性别差异表达的消减cDNA文库的成功构建，为进一步研究性别特异基因的功能奠定了基础。     

叶锈菌诱导的小麦叶片抑制差减杂交文库构建及其分析

 【目的】研究叶锈菌诱导小麦叶片的基因表达情况,从分子水平阐明小麦的抗病机制。【方法】以小麦抗叶锈病近等基因系TcLr41为材料,利用抑制差减杂交技术,构建叶锈菌诱导的小麦叶片cDNA文库,随机挑取文库中的阳性克隆测序,并对测序结果进行功能注释和分类。【结果】成功构建了叶锈菌诱导的小麦叶片抑制差减杂交文库,共获得3 456个阳性克隆。挑取165个阳性克隆进行测序,获得160条高质量EST。对EST序列进行聚类后,共获得107条非重复序列（Unigene）,与GenBank进行BLASTx和BLASTn同源比对,其中70条非重复序列与已知基因同源性很高,占全部非重复序列的65.4%。已知功能的EST涉及植物的能量代谢、信号转导、转录调控及抗病防卫等多方面。【结论】通过对功能已知的基因分析,推测促分裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase）、GTP结合蛋白（GTP-binding protein）、钙网蛋白（calreticulin）、过氧化氢酶（catalase）、谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione-S-transferase）、多聚泛素基因（polyubiquitin）、锌指蛋白（zinc-finger protein）、肉桂醇脱氢酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase）、转脂蛋白（lipid transfer protein）、类甜蛋白（thaumatin-like）、几丁质酶（chitinase）等可能参与了小麦与叶锈菌的非亲和互作过程。     

稻瘟菌拮抗细菌的筛选与鉴定

从不同水稻根际土壤样品中分离纯化了486株细菌。采用平板测定法和微培养离体测定试验获得12株对稻瘟菌有不同程度抑制作用的拮抗细菌。结果表明:B4,B8,B18,B31,B34,B73和B74等菌株对稻瘟菌菌丝生长抑制率均在80%以上,其培养液100%抑制稻瘟菌孢子萌发;同时对水稻纹枯病菌、油菜菌核病菌、小麦赤霉病菌、草莓炭疽病菌和黄瓜枯萎病菌等多种病原真菌有较好抑制作用,经鉴定该组拮抗细菌为枯草芽孢杆菌。B1,B43和B44菌株对稻瘟菌菌丝生长和孢子萌发有较好抑制作用,对水稻纹枯病菌具有一定的抑制作用,经鉴定为短小芽孢杆菌。B48和B59为链霉菌,对稻瘟菌的抑菌带明显,但对稻瘟菌孢子萌发和附着胞的形成抑制作用不明显。     

稻瘟菌致病相关基因的研究策略

结合稻瘟菌致病相关基因和无毒基因的研究进展．以及图位克隆法在稻痘菌研究中的运用．对稻瘟菌致病相关基因的研究策略作了简要评述。     

稻瘟菌若干T-DNA插入突变体初步分析

为揭示稻瘟菌致病分子机制,创建了该菌T-DNA插入突变体库．部分突变体经表型分析,获得3个生长发育及致病性同时发生变异,5个生长发育正常但致病性变异及2个生长发育变异但致病性正常的突变体；以TAIL-PCR方法获得了这些突变体T-DNA插入位点及其边界序列,并用生物信息方法对被T-DNA标签的基因进行了分析,为进一步研究这些基因的功能提供了重要信息．     

应用抑制性差减杂交技术构建副猪嗜血杆菌基因组差减文库

为构建副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)有毒力菌株SW124(血清4型)和无毒力菌株H465(血清11型)间的差异表达基因文库,采用抑制性差减杂交技术(Suppression subtractive hybridization,SSH)分析SW124和H465菌株细菌基因组的表达差异,并进行两轮差减杂交和两次PCR扩增,将第2次PCR产物与pMD19-T载体相连,转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞并进行文库扩增和蓝白斑筛选,RT-PCR鉴定差异表达文库。结果共获得327个阳性克隆,筛选100个克隆制备质粒进行PCR检测,均扩增出100～2 000 bp大小的片段。差异DNA差减文库的构建为进一步筛选、克隆HPS特异的未知新基因、建立分子鉴别新体系奠定了基础。     

稻瘟病菌的拮抗细菌筛选

自稻叶及其它禾本科杂草叶片表面分离纯化９８５株细菌分离物,分别培养在ＮＢ液体培养基中,经８０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ后取上清液,加入稻瘟病菌分生孢子悬液中,测定对稻瘟病菌分生孢子发芽,附着胞形成的抑制作用,从而筛选出１３株对稻瘟病菌孢子芽管生长或附着胞形成具有抑制作用的拮抗细菌．采用离体稻叶接种测定,进一步筛选得到３株拮抗细菌,初步鉴定为：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（Ｘｈ２１６）,Ｂａｃｉｌｕｓｓｐ．（Ｘｈ２２２）及Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．（Ｘｈ２４０）．在离体条件下,Ｘｈ２１６,Ｘｈ２２２和Ｘｈ２４０对叶瘟的防治效果分别为７２．３％,７０．５％和６７．４％．     

黑龙江省水稻品种对稻瘟病的抗性分析及评价利用

采用室内苗期抗谱鉴定的方法,选取178个稻瘟病菌株对黑龙江省13个主栽品种的抗稻瘟病进行了鉴定。从品种对整个黑龙江省稻瘟病菌株的抗性来看,龙粳14和龙盾104抗性最好,抗谱分别为93．82％和93．26％。从品种对适宜积温带稻瘟病菌株的抗性来看,绥粳7和龙盾104分别是第2和第3积温带抗瘟性最好的品种,抗谱分别为73．08％和95．40％。此外,还利用生物间遗传学关于联合抗病性分析的方法。分析了品种搭配在生产上的应用前景,联合抗病性系数最高的组合是龙稻7和绥粳7,联合毒性系数最低的组合是绥粳4和垦稻10。     

稻瘟病菌重组研究概要

稻瘟病菌变异机制极其复杂,有性重组和准性重组可能起着重要作用,但在田问植株上还未找到直接证据,并综述了这两种变异机制的研究进展。     

稻瘟病菌二个无毒基因的初步分析

 分析了2个稻瘟病田间采集菌株Y95-223和Y94-64的杂交后代的54个菌株对合系35号、楚粳3号及日本鉴别品种新2号、梅雨明、PiNo.4和K60共11个水稻品种致病性测定结果。结果表明:陆稻菌株Y94-64对合系35号、楚粳3号、PiNo.4分别持有2个无毒基因,对新2号、K60分别持有一个无毒基因;菌株Y95-223对梅雨明持有一个无毒基因,因为Y95-223对梅雨明不致病,Y94-64对它致病,而杂交后代非致病菌株与致病菌株比为1∶1．     

稻瘟病菌REMI突变体的筛选和鉴定

利用构建的含潮霉素(HygB)抗性标记的质粒pUCATPH在稻瘟病菌菌株M 131中建立一个转化体系,通过限制酶介导整合(REM I)插入诱变技术,以HygB抗性作为突变体筛选标记,获得639个转化子。对其中200个转化子进行表型和致病性测定后,通过点杂交鉴定分别获得6个致病性突变菌株和部分表型突变菌株。对2个表型突变菌株和rep-PCR图谱差异性较大的2个致病性突变菌株进行RFLP分析,结果表明:突变体中均已插入质粒,但转化质粒在M 131中整合具有一定的随机性。     

2000和2001年江苏省稻瘟病菌的群体结构

利用Pot2-rep-PCR技术分析了2000及2001年采自江苏省五大稻区稻瘟病菌的DNA指纹。单元型和系谱分析结果表明：稻瘟病菌在DNA水平上具有很高的多态性；不同的年份及地区间稻瘟病菌的群体结构存在明显差异，但也有部分菌株属于相同系谱甚至同一单元型，而JSL17是各稻区均有分布的优势系谱；来自不同地区、相同寄主品种的菌株有相似的遗传背景，说明寄主品种的遗传背景在病菌进化的变异中起着重要的作用。     

水稻品种对稻瘟病的抗性分析和利用评价

采用生物间遗传学关于毒力频率和联合致病性分析的方法,用67个稻瘟病菌菌株对35个水稻品种的抗瘟性进行了鉴定和评价。毒力频率较低(<20%)的有两优培九、金优77、汕优晚3、汕优63、Ⅱ优63、早丝苗、汕优10号、威优晚3、9003、金优402、安两优402、汕优647、嘉育948和优Ⅰ402等。联合抗病性系数在0.70以上(含0.70)的两两组合有101对,其中有17对搭配的联合毒性系数为0,即稻瘟病菌不会同时对搭配的双方致病。联合抗病性系数在0.80以上(含0.80)的组合有12对,这12对组合的联合毒性系数为0~0.03,这些两两搭配的双方均对田间稻瘟病菌群体具有较高的抗病性,被评价为高抗稻瘟病的搭配,可以在生产推广中搭配使用。