食源性单增李斯特菌inlA/inlB/inlC基因缺失株的构建及其生物学特性分析

为探究内化素inlA/inlB/inlC基因对单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)生物学特性的影响,本研究采用融合PCR方法构建Lm681 inlC基因缺失突变体,并构建pKSV7-△inlC穿梭载体,将其转化Lm681-△inlAB感受态细胞,利用温度(42℃)和氯霉素(10μg/mL)抗性双重压力来实现同源重组,筛选同源重组子进行鉴定并研究其部分生物学特性。结果显示,PCR和测序结果证实成功构建了3基因缺失株(Lm681-△inlABC),且缺失株的生长特性与野生株相比无明显差异,溶血特性与野生株保持一致;小鼠感染试验显示,野生株Lm681、Lm681-△inlAB和Lm681-△inlABC对小鼠的致死率分别为80%(8/10)、60%(6/10)和40%(4/10),对小鼠的LD50分别为4.36×10~4、1.35×10~6和2.95×10~7 CFU,且Lm681-△inlABC在肝脏、脾脏及脑组织中的定植能力极显著低于野生株(P<0.01)。研究结果表明,inlA/inlB/inlC基因对Lm致病性发挥具有一定的作用,为深入研究inlX基因介导Lm入侵宿主细胞过程中的作用机制提供了科学依据。     

单增李斯特菌(LM90)inlA单基因及inlB/inlA双基因缺失株的构建及其生物学特性初步研究

为探究内化素inlA、inlB基因缺失对单核细胞增生性李斯特菌(LM)生物学特性的影响,本研究采用同源重组技术构建了inlA基因缺失株(LM90-inlA)和inlB、inlA双基因缺失株(LM90-ΔinlB/ΔinlA),并对其生物学特性进行了初步研究。结果显示:PCR和测序结果证实成功构建了目的基因(inlA、inlB)缺失株;菌落PCR和测序结果显示2种缺失株在体外连续培养20代过程中均能稳定遗传;生长特性实验表明2种缺失株与亲本株生长差异无统计学意义(t_(LM90/LM90-ΔinlA=0.34),p0.05;t_(LM90/LM90-ΔinlB/ΔinlA)=0.324,p0.05;t_(LM90-ΔinlA/LM90-ΔinlB/ΔinlA)=0.008,p0.05)且inlA缺失后2缺失株对小鼠的LD_(50)分别升高了0.64、1.26个对数数量级。研究结果表明inlA基因和inlB基因对LM90的部分生物学特性具有一定的调控作用,这对于阐明LM毒力因子的致病机理提供了参考依据,也为研究内化素介导LM穿越血脑屏障(BBB)的作用机制奠定了科学基础。     

单增李斯特菌inlK基因缺失株的构建及其生物学特性分析

为了分析内化素InlK对单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)生物学特性及致病性的影响,利用自杀性质粒进行同源重组构建LM标准菌株10403s的inlK基因缺失株,然后比较分析野生株、inlK基因缺失株的生长特性、生物被膜形成能力、细胞侵袭能力、动物致病力等差异。结果显示,inlK基因缺失不影响LM的生长速度,但可导致LM的生物被膜形成能力下降。细胞感染试验表明基因缺失株ΔinlK对RAW264.7细胞的侵袭及胞内存活能力分别下降了18%和31%。动物感染试验显示野生株和基因缺失株ΔinlK对小鼠的致死率分别为80%(4/5)和40%(2/5),且基因缺失株ΔinlK的体内定殖能力显著低于野生株。本研究表明内化素InlK在LM感染过程中发挥着重要作用,为了解LM的致病作用提供参考。     

食源性单增李斯特菌LPXTG蛋白基因的检测

单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)作为四大重要食源性病原菌之一,对人类及多种畜禽健康威胁极大。LM细胞胞壁表面分布多种毒力蛋白,在感染机体过程中发挥重要作用,其中有一类至关重要的表面蛋白其C末端含有保守基序LPXTG,分选酶A能够识别基序LPXTG,共价结合到肽聚糖上,呈现在细胞表面发挥毒力作用。本试验以不同食品中分离得到的24株单增李斯特菌为试验对象,设计合成了41对预测含LPXTG基序表面蛋白的引物,利用PCR技术进行扩增,凝胶电泳成像系统检测扩增产物片段大小,计算24株食品源单增李斯特菌LPXTG基序表面蛋白的携带。结果表明,不同LM分离株LPXTG蛋白基因的携带率不同:其中仅有12.5%(3/24)的分离株携带率在85%以上;不同LPXTG蛋白基因的检出率不同,在41个检测对象中,有8个基因的检出率100%,有3个基因的检出率不足20%,Lmo1115基因在所有分离株中均未检测到。本研究对了解食品源LM分离株的LPXTG蛋白基因的分布以及探明食品源LM的致病性具有重要意义。     

流产布鲁菌ppdk基因缺失株的构建及其生物学特性分析

布鲁菌病是由布鲁菌感染引起的呈全球性分布的人畜共患细菌性传染病。布鲁菌是一种兼性胞内菌,感染宿主依赖多种基因的表达和调控。近年来,胞内菌的碳代谢与致病力的关系成为研究的热点。前期研究发现碳代谢相关的丙酮酸磷酸双激酶(ppdk)基因与布鲁菌毒力相关。本研究利用同源重组方法构建流产布鲁菌ppdk基因缺失株,通过环境压力因子耐受性实验、胞内存活实验和动物致病性实验等探讨ppdk基因对布鲁菌毒力的影响。结果显示,ppdk基因缺失能减弱布鲁菌对多粘菌素B和大牛血清的抵抗性,减弱细菌胞内存活的能力和对小鼠的致病力,表明ppdk基因与流产布鲁菌的毒力密切相关。     

单核细胞增生李斯特菌NTSNΔ0287缺失株的构建及其生物学特性

内化素蛋白家族是一类重要的表面蛋白,其与单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)对宿主的黏附侵袭作用密切相关。Lm NTSN_0287基因编码含有信号肽序列和LRR重复结构域的内化素家族蛋白,其作用机制有待于阐明。通过荧光定量PCR的方法,发现该基因在Lm侵袭Caco-2细胞时上调表达,达到体外表达量的1 300倍。为明确该基因的生物学特性,研究利用同源重组技术构建了LmNTSNΔ0287缺失株。与野生株相比,NTSNΔ0287缺失株对Caco-2细胞的黏附与侵袭能力均显著降低,对HeLa细胞的黏附能力下降,侵袭能力增加。经口服和尾静脉途径接种BALB/c小鼠,NTSNΔ0287缺失株在脾脏和肝脏中的载菌量均降低,但其LD_(50)与野生株相比无明显差异。因BALB/c小鼠缺乏人所特有的细胞表面内化素受体E-cad,并不是最佳实验动物模型,下一步将选用同时具有内化素受体E-cad和Met的沙鼠做进一步研究。     

单增李斯特菌hly基因缺失株的构建及重要特性分析

为构建单增李斯特菌(LM)hly基因缺失株,并分析其生物学特性和免疫保护效果,本研究利用同源重组技术获得基因缺失株LM△hly112-153,研究该缺失株对巨噬细胞的侵袭力、溶血能力并测定其LD50,同时评价该缺失株对小鼠的免疫保护效果。结果显示经PCR扩增及序列分析表明获得基因缺失株LM△hly112-153,该缺失株对巨噬细胞的侵袭能力显著下降(p<0.01);其溶血活性比野生株降低2个滴度;并且该缺失株对BALB/c小鼠的LD50为4.253×108 cfu,高于野生株3个数量级;免疫保护试验显示,经缺失株免疫的小鼠对野生株攻毒有75%的免疫保护率。本研究构建了基因缺失株LM△hly112-153,该缺失株对小鼠具有较好的免疫保护效果,以上研究为减毒李斯特菌疫苗载体的研发奠定重要基础。     

食源性单增李斯特菌检测技术研究进展

单增李斯特菌是一种常见的食源性致病菌,会导致严重的人兽共患病。目前单增李斯特菌的检测方法主要包括传统方法、酶联免疫法、免疫胶体金技术、PCR检测技术、等温扩增技术、全自动微生物检测系统、生物芯片技术等。本文对各方法的原理、优缺点、应用情况及发展前景进行了概述。     

单增李斯特菌双元调控系统hssS/hssR缺失株的构建及其生物学特性

单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一种重要的食源性人畜共患病原菌,可抵抗外界多种不利因素的影响,如酸、碱、渗透压和氧化应激.双元调控系统(two-component system,TCS)是细菌适应环境的重要调控系统,为了探明双元调控系统HssS/HssR对单增李斯特菌抗应激能力及毒力...     

食源性单增李斯特菌LIPI-4基因的检测及序列分析

单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)作为四大重要食源性病原菌之一,对公共安全及畜牧业发展威胁极大。其毒力岛4(LIPI-4)是新发现的一个潜在毒力因子,与LM的神经感染和母胎感染密切相关。以54株食源性LM的DNA为模板,针对LIPI-4的6段基因设计特异性引物,利用PCR的方法检测LIPI-4的携带情况并对携带株的LIPI-4基因进行生物信息学分析。结果表明,54株LM中有5株携带LIPI-4基因,携带率为9.26%;5株食源性LM LIPI-4基因的同源性均为100%,与CC1代表株LM09-00558 LIPI-4基因的同源性99%以上;对LIPI-4中EIIC结构域分析表明5株食源性LM LIPI-4均为PTS~(Lac)家族。食源性LM携带LIPI-4基因且属于PTS~(Lac)家族,研究LIPI-4基因对进一步了解LM的致病性具有重要意义。     

丙型副伤寒沙门菌lpfC基因缺失株的构建及其生物学特性分析

为了分析lpfC基因对丙型副伤寒沙门菌生物学特性及致病性的影响,本研究采用Red同源重组系统构建丙型副伤寒沙门菌lpfC基因缺失株,并利用低拷贝质粒pSTV28构建其互补株。然后比较分析野生株、缺失株与互补株之间生长特性、生化特性、黏附侵袭能力、动物致病力等生物学特性差异。结果显示,lpfC基因的缺失不影响丙型副伤寒沙门菌的生长特性和生化特性,但缺失lpfC基因可导致丙型副伤寒沙门菌黏附侵袭细胞的能力及对小鼠致病力显著降低。本研究为进一步了解丙型副伤寒沙门菌lpfC基因的功能奠定了基础。     

貉肠炎沙门菌htra基因缺失株的构建及其生物学特性

利用Red同源重组方法对HtrA蛋白编码基因htra进行敲除,并从生长特性、生化特性、耐pH应激与氧化应激、抗血清杀伤和菌株毒力等几方面对突变菌株进行评价。结果显示,与野生型菌株相比,htra基因缺失株生长特性和生化特性无明显差异,但其对酸性和碱性环境的敏感性增加,对血清的耐受力下降;动物试验结果显示,htra基因缺失后肠炎沙门菌对小鼠半数致死量有显著提高。本试验成功构建了貉肠炎沙门菌htra基因缺失株,为研究HtrA蛋白的作用机制奠定了基础。     

单增李斯特菌溶血素S llsB基因缺失株的构建及部分生物学特性研究

为分析单增李斯特菌溶血素S(listeriolysin S,LLS)llsB基因缺失对单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)生物学特性的影响,本研究利用同源重组构建了llsB基因缺失株LM90-ΔllsB,并以8周龄、体重40g±5g的健康昆明系雄性小鼠为试验动物对其生长特性、半数致死量(LD50)、脏器载菌量等生物学特性进行了初步研究。结果显示,本研究成功构建了llsB基因缺失株;缺失株在体外连续培养20代过程中能稳定遗传。通过生长曲线测定发现,llsB基因缺失株生长活性略高于亲本株;小鼠感染试验结果显示,亲本株和缺失株的LD50分别为106.17和106.50 CFU;与亲本株相比,缺失株在小鼠肝脏和脾脏中的载菌量均极显著减少(P0.01),说明缺失株对小鼠的感染能力明显减弱。在小鼠脑中未检出单增李斯特菌。综上所述,llsB基因对LM90的部分生物学特性可能有直接或间接的调控作用,本试验结果为进一步研究LLS的致病机理及防控李斯特菌病提供一定的理论依据。     

肠炎沙门菌ArgG基因缺失株的构建及生物学特性分析

为研究ArgG基因对肠炎沙门菌的致病作用和生物学特性的影响，本试验利用λ-Red重组法构建肠炎沙门菌ArgG基因缺失株，并从生化特性、生长特性、生物被膜形成能力、运动能力、体外应激、巨噬细胞存活能力等方面进行研究。结果显示，与野生型菌株相比，ArgG基因缺失株生化特性、运动能力无明显变化，在LB培养基中生长速度变化不明显，但在M9培养基中缺失株不生长；ArgG基因缺失株生物被膜形成能力下降约60%,抗酸、碱应激能力分别下降约12%和10%左右，巨噬细胞内的存活能力和其对小鼠的毒力降低。本研究成功构建了肠炎沙门菌ArgG基因缺失株，并证明ArgG基因与营养代谢、抗应激能力和毒力密切相关，为肠炎沙门菌的基因缺失苗的研究提供理论依据。     

食源性单增李斯特菌lismff_0038基因克隆及序列分析

单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)作为四大重要食源性病原菌之一,对公共安全及畜牧业发展威胁极大。其lismff_0038是新发现的一个潜在毒力因子,与LM的神经感染和母胎感染密切相关。对食源性单核细胞增多性李斯特菌LM5567的lismff_0038基因进行克隆和生物信息学分析,为功能验证提供基础。根据GenBank中收录的lismff_0038基因序列设计特异性引物,利用PCR方法对食源性单核细胞增多性李斯特菌LM5567的lismff_0038基因进行扩增,将扩增产物克隆到pMD19-T载体,进行PCR、双酶切鉴定及序列测定,并对基因核苷酸序列和蛋白序列进行分析。结果显示,食源性单核细胞增多性李斯特菌LM5567的lismff_0038基因序列全长为988 bp。LM5567的lismff_0038核苷酸序列与02-6680株(4b,奶酪,加拿大)、10-0811株(1/2b,螃蟹,加拿大)、10-0809株(4b,粪便,加拿大)、81-0558株(4b,脑脊髓液,加拿大)、02-1103株、02-1792株(4b,奶酪,加拿大)、81-0861株(4b,卷心菜,加拿大)相似性91.1%。其推导的氨基酸序列与上述菌株相似性100%。蛋白质二级结构预测表明,LM5567的lismff_0038蛋白为疏水性蛋白,无信号肽,属于跨膜蛋白。表明,克隆了LM5567的lismff_0038基因,为进一步探究lismff_0038基因的功能奠定了一定基础。     

肠炎沙门菌sufB基因缺失株的构建及其相关生物学特性研究

为了解铁硫簇蛋白对肠炎沙门菌致病作用的影响,本研究利用λ-Red同源重组系统构建了肠炎沙门菌(C50336) suf B基因缺失突变株(C50336Δsuf B),并对其生物学特性进行分析,探究Suf B蛋白在肠炎沙门菌致病过程中的作用。结果显示,缺失株C50336Δsuf B与野生型菌株和回复菌株相比,其生长速度、生化特性无明显差异,但其对酸性应激、H2O2处理和高渗环境的适应能力显著下降,在血清中存活率明显降低。动物实验结果显示,suf B基因缺失突变株的毒力和体内存活能力均严重下降。本研究证实suf B基因与肠炎沙门菌毒力密切相关,为进一步阐释肠炎沙门菌感染致病机制奠定基础。     

肠炎沙门菌mreB基因缺失株的构建及其体外生物学特性研究

MreB蛋白广泛存在于原核生物中,主要生物功能是聚合形成类似于肌动蛋白微丝的纤维,参与细胞形状的维持。为研究肠炎沙门菌的mreB基因缺失对环境压力的应激变化,本研究利用Red重组方法构建肠炎沙门菌SM6株的mreB基因缺失株,同时构建其回补菌株,观察缺失株SM6ΔmreB的形态学变化,分析其对温度缺氧应力、渗透应力以及耐酸性的变化。结果显示,缺失株SM6ΔmreB的菌体变为球状,生长受到抑制;SM6ΔmreB对升温缺氧压力的耐受能力显著低于亲本株和回补株(p<0.05);在渗透压条件为100mmol/L和200mmol/LNaCl时缺失株的生存能力明显弱于亲本株和回补株(p<0.05);缺失株在强酸环境中的生存能力显著低于亲本株和回补株(p<0.05),而对中性和弱酸性环境的适应能力与亲本株相似。本研究为进一步探究MreB蛋白在沙门菌的致病机制以及菌蜕形成过程中的作用奠定了基础。     

肠炎沙门菌C50336ZinT基因缺失株构建及其相关生物学特性

为研究锌调控蛋白ZinT在肠炎沙门菌致病中的作用,本试验利用λ-Red同源重组系统构建了肠炎沙门菌(C50336)ZinT基因缺失突变株(C50336ΔZinT),并对其生物学特性进行分析。结果显示,与野生型菌株和回复菌株相比,缺失株C50336ΔZinT在LB培养基中生长速度无明显差异,生化特性亦无明显变化,但其在Minimal培养基中生长明显变慢。此外缺失株C50336ΔZinT对H_2O_2处理和高渗环境的适应能力显著下降,但在巨噬细胞内的存活率无明显降低。动物试验表明,ZinT基因缺失突变株的毒力和野生型菌株相比仅有轻微下降。本试验探讨了ZinT与肠炎沙门菌锌摄取和毒力间的联系,为进一步阐释肠炎沙门菌感染致病机制奠定基础。     

肠炎沙门菌双组份系统qseC基因缺失株的构建及其生物学特性分析

为研究肠炎沙门菌qseC基因功能,构建qseC缺失株C50041ΔqseC以及回复株C50041ΔqseC::qseC,分析qseC基因缺失对肠炎沙门菌生化特性、生长曲线、运动性、黏附侵袭等方面的影响,探究该基因在肠炎沙门菌感染致病中的作用。结果显示:利用框内缺失突变技术成功获得肠炎沙门菌C50041ΔqseC缺失株,以野生株C50041、回复株C50041ΔqseC::qseC为对照,发现C50041ΔqseC缺失株的生化特性、生长曲线与C50041野生株一致,但其运动性(P=0.001 9)以及对巨噬细胞J774A.1的黏附率(P=0.032 5)、侵袭率(P=0.005 3)相比野生株显著下降。研究提示:qseC基因的缺失对肠炎沙门菌的生化特性和生长曲线没有影响,但会显著降低肠炎沙门菌的运动能力及对宿主细胞的黏附和侵袭。研究初步探究了肠炎沙门菌qseC基因的功能,为后续深入研究奠定基础。     

鼠伤寒沙门菌sapC基因缺失株的构建及生物学特性分析

旨在研究鼠伤寒沙门菌ABC转运膜蛋白SapC在沙门菌致病机制中的功能。本研究利用λ-Red重组技术构建了鼠伤寒沙门菌sapC基因缺失突变株SMΔsapC,对其进行生长特性、酸性应激试验、多黏菌素B敏感性试验、生物被膜检测、胞内存活和小鼠体内毒力试验。结果显示,基因缺失株SMΔsapC与亲本菌株和互补菌株相比,其生长速度无明显差异;在酸应激条件下,SMΔsapC存活率显著低于亲本菌株;sapC基因缺失降低了鼠伤寒沙门菌生物被膜的形成能力;同时,SMΔsapC基因缺失株在鼠源巨噬细胞内的增殖能力和小鼠体内的毒力显著低于亲本菌株。研究表明,sapC基因影响鼠伤寒沙门菌的抗酸能力、生物被膜形成能力,从而影响沙门菌在体内外的毒力。本研究为进一步阐释鼠伤寒沙门菌的致病机制奠定了基础。