水牛SIRT6基因克隆及其在组织中的表达分析

本研究旨在克隆水牛SIRT6基因，构建真核表达载体，并对该基因进行生物信息学及组织表达谱分析。以牛SIRT6基因编码区为种子序列（GenBank登录号：NM_001098084.1），应用Oligo 7.0软件设计引物序列，用RT-PCR方法扩增水牛SIRT6基因完整编码区序列，测序鉴定后进行生物信息学分析，构建逆转录病毒载体pMXs-SIRT6-IRES-GFP，并在HEK-293T细胞和水牛胎儿成纤维细胞上进行重组载体表达鉴定；采集水牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠、脑、皮肤、生殖嵴分别提取RNA，反转录后以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，检测SIRT6基因在各组织中的表达差异。结果表明，水牛SIRT6基因编码区全长1 080 bp，编码359个氨基酸，其中亮氨酸及脯氨酸含量最高（10.3%），酪氨酸含量最低（1.1%）。水牛SIRT6基因核苷酸序列与牛、人和小鼠的同源性分别为98.4%、86.7%和78.5%，物种间同源性较低。系统进化树结果表明，水牛与牛聚为一支，再与人、小鼠聚为一大支，亲缘关系相对较近，与果蝇亲缘关系较远。SIRT6蛋白理论分子质量为39.47 ku，分子式为C₁₇₃₇H₂₇₈₃N₅₀₉O₅₁₆S₁₃，等电点为8.48，不存在跨膜区，为膜内蛋白；含有Sirtuin家族特有的Sir2去乙酰化酶的催化结构。二级结构预测结果显示，水牛SIRT6蛋白包含13个α-螺旋、27个β-折叠、24个T-转角和20个无规则卷曲。逆转录病毒载体介导的SIRT6基因能在HEK-293T细胞和水牛胎儿成纤维细胞中表达。实时荧光定量PCR结果显示，SIRT6基因在水牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠、脑、皮肤、生殖嵴中均有表达，其中在生殖嵴中表达量最高，在皮肤中的表达量次之，而在肝脏中表达量最低。本试验结果将为水牛SIRT6基因的功能研究提供参考。     

水牛Keap1基因的克隆、序列分析及组织表达研究

本研究克隆了水牛Keap1基因的全长编码区,并对其序列进行了生物信息学分析,同时探索了其在水牛各组织中的表达差异。根据GenBank中公布的牛Keap1基因的序列信息,设计特异性引物并扩增出水牛Keap1的目的片段,利用生物信息学分析方法,对测序所得水牛Keap1基因序列、预测蛋白质序列进行了分析,并采用实时荧光定量PCR技术对Keap1基因mRNA在水牛各组织中的表达进行了研究。结果表明,水牛Keap1基因编码区全长1 875 bp,预测编码624个氨基酸;多重分析结果显示,水牛与牛、绵羊、野猪和人Keap1基因的同源性分别为99%、96%、92%和90%;进化树分析表明Keap1在物种间具有较高保守性,不同物种间Keap1序列的差异符合物种间的进化性。对Keap1蛋白质二级结构预测发现,其包含24个α-螺旋、40个β-螺旋、38个T转角和27个无规则卷曲。实时荧光定量PCR结果显示,Keap1基因在水牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、卵巢和肌肉组织中均有表达,但心脏中表达量最高,肝脏、脾脏中表达量较低。本研究成功克隆了水牛Keap1基因,并进行了相关生物信息学分析及其mRNA在水牛各组织的表达情况研究,为阐明Keap1-Nrf2-ARE信号通路,提高水牛胚胎体外培养的抗氧化能力奠定基础。     

牦牛六个多能性相关转录因子OSKMNL的克隆和多顺反子慢病毒载体的构建

旨在克隆牦牛6个多能性相关转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin28(OSKMNL),构建多顺反子慢病毒载体FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry。本研究以1头3～5月龄健康雌性牦牛胎儿的生殖嵴组织为研究材料,利用RT-PCR技术克隆牦牛6个多能性相关转录因子OSKMNL的完整编码区序列,并对其进行生物信息学分析;应用无缝克隆技术构建慢病毒载体FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry;用293T细胞包装慢病毒,将包装好的慢病毒感染293T细胞和牦牛成纤维细胞,通过观察荧光表达和RT-PCR技术检测病毒感染情况(试验分为病毒感染组和空白对照组,每个组设置3个重复)。结果表明,克隆的牦牛OSKMNL基因的编码区大小分别为1 083、963、1 434、1 320、903、618 bp;序列分析发现牦牛OSKMNL氨基酸序列与黄牛的同源性在99%以上,其中Sox2、Klf4、c-Myc与黄牛的同源性为100%;进化树结果显示牦牛与黄牛、瘤牛、水牛的亲缘关系最近,与小鼠的亲缘关系最远;蛋白结...     

沼泽型水牛FST基因克隆分析与组织表达模式

旨在克隆水牛卵泡抑素(follistatin, FST)基因,并对该基因进行生物信息学分析,检测其在水牛不同组织中的表达情况,为进一步探讨FST在水牛胚胎发育过程中的功能奠定基础。从水牛卵巢组织中提取RNA,反转录成cDNA后,利用RT-PCR技术克隆获得水牛FST基因CDS区的全长序列,并进行生物信息学分析。结果显示,水牛FST基因编码区全长1 035 bp,编码344个氨基酸。水牛FST基因与黄牛、鸡、绵羊、人、黑猩猩、褐家鼠、野猪和山羊的同源性分别为99.1%,81.4%,98.4%,91.9%,91.4%,89.3%,93.4%和81.4%,且在不同物种间高度保守,符合生物的进化规律。FST蛋白包含40个α-螺旋、63个延伸链及241个无规则卷曲,分别占11.6%(40个),18.3%(63个)和70.0%(241个),为经典分泌蛋白。qRT-PCR结果显示,FST在水牛胃、肌肉、卵巢、睾丸、心脏、肝脏、肺脏和脾脏组织中均有表达,其中在肺脏和卵巢中表达最高,睾丸中表达最低。本研究克隆得到了沼泽型水牛FST基因,并对不同组织内FST进行了基础的生物信息学分析,为阐明FST在水牛胚...     

沼泽型水牛KDM4A(JMJD2A)基因克隆分析与表达模式

旨在克隆并分析水牛赖氨酸特异性去甲基化酶4A (lysine-specific demethylase 4A,KDM4A)基因,并检测其在水牛不同组织中的表达情况,探讨KDM4A在水牛胚胎发育过程中的功能。提取卵巢组织的RNA,获得水牛KDM4A基因CDS区的全长序列。结果显示,水牛KDM4A基因编码区全长3 151 bp,编码1 067个氨基酸。水牛KDM4A基因与黄牛、绵羊、骆驼和家犬的同源性分别为99%,97%,92%,91%;且在不同物种间高度保守,符合生物的进化规律。KDM4A蛋白包含369个α-螺旋,85个β-转角,409个无规卷曲和204个延伸链,为亲水不稳定的酸性蛋白。qRT-PCR结果显示,KDM4A在水牛肌肉、肺脏、卵巢、大脑、皮肤、心脏、脾脏、肾脏和肝脏组织中均有表达,其中肌肉、肺脏、卵巢中表达量较高,肝脏和肾脏中表达量较低。本研究克隆得到了沼泽型水牛KDM4A基因,并对不同组织内KDM4A进行了基础的生物信息学分析,为阐明KDM4A在水牛胚胎发育过程中的功能,提高水牛胚胎发育水平提供理论基础。     

山羊先天免疫基因BCL10克隆、组织表达及真核载体构建分析

本研究旨在探索作为先天免疫相关分子的BCL10蛋白对山羊的免疫调控。实验采用RT-PCR、3'RACE和5'RACE克隆方法,以NCBI中山羊BCL10预测基因序列为模板,克隆初生羔羊脾脏组织BCL10基因cDNA序列,并进行生物信息学分析;采用qRT-PCR技术检测羔羊BCL10基因各免疫相关组织转录表达谱;鉴定p EGFP-N1-BCL10重组质粒在细胞的真核表达效果。结果表明:克隆得到BCL10基因cDNA全长1 023 bp,其中CDS为693 bp,编码230个氨基酸;生物信息学分析结果发现山羊BCL10蛋白是一种N端存在CARD结构域、非分泌、非膜结合的胞内蛋白,氨基酸序列与水牛、绵羊的亲缘关系最为接近;颌下腺中BCL10基因表达量显著高于肺脏、肝脏、脾脏、肾脏及血液(P0.05),胸腺中BCL10基因表达量显著高于血液(P0.05),血液表达最少;成功构建了BCL10基因完整CDS序列的p EGFP-N1-BCL10重组载体,并在HEK293T真核细胞正常表达。本研究首次克隆出羊BCL10基因cDNA全长序列,检测了基因表达分布情况,构建了重组载体,为进一步探索山羊BCL10基因功能及蛋白免疫机制提供理论基础。     

水牛水通道蛋白9基因克隆及其表达分析

本研究旨在对水牛水通道蛋白9 (aquaporins 9,AQP9) 基因进行克隆,并对其在水牛不同组织中的表达规律及其在水牛卵巢和睾丸组织中的表达差异进行探索。根据GenBank上黄牛AQP9基因序列(登录号:NM_001205833.1)设计特异性引物,以水牛睾丸组织cDNA为模板,应用RT-PCR方法扩增AQP9基因编码区片段;运用生物信息学方法分析其核苷酸序列的保守性和氨基酸的理化性质;应用实时荧光定量PCR技术分析AQP9基因在水牛组织中的表达情况;免疫组织化学方法分析AQP9蛋白在不同发育阶段水牛卵泡及睾丸组织中的表达差异。结果表明,克隆获得了888 bp的水牛AQP9基因编码区序列,其编码295个氨基酸。多重序列比较显示,水牛AQP9核苷酸序列与牛、猪、绵羊和人相应序列相似性分别为99%、90%、97%、88%;氨基酸序列的同源性分别为99%、86%、97%、83%,系统进化树分析结果推测,AQP9基因在物种进化过程中具有高度保守性。实时荧光定量PCR结果显示,AQP9基因在水牛肝脏、肺脏、大脑、皮肤、睾丸和卵巢组织中有不同程度的表达,在肝脏组织中表达最高,皮肤和睾丸次之,肺脏和卵巢表达较低。免疫组化结果显示,在卵巢组织中,AQP9蛋白表达随卵泡发育时期的不同而变化,并随着卵泡发育其表达逐渐增强;在睾丸组织中,AQP9蛋白在各级精母细胞和间质细胞中均有表达。结果提示,成功克隆得到水牛AQP9基因序列;AQP9在水牛卵巢和睾丸中的表达及其功能可能与水牛卵泡发育和精子发生有重要的关联。     

水牛MYF5基因克隆分析及真核表达载体构建

本研究旨在对广西沼泽型水牛MYF5基因进行克隆和分析,并构建其真核表达载体。应用RT-PCR方法从水牛肌肉组织中扩增MYF5基因,测序鉴定后对其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析,同时构建该基因真核表达载体,并在细胞水平验证所构建载体的正确性。结果表明:水牛MYF5基因编码区序列长度为768 bp,编码255个氨基酸,其核苷酸序列与牛、山羊、猪、人、猩猩和狼相应序列的相似性分别为99%、98%、94%、91%、90%和89%;水牛MYF5基因在不同物种及进化过程中具有高度保守性;MYF5蛋白为膜外蛋白,具有MYOD家族标志性MYOD结构域;构建水牛MYF5基因真核表达载体pMXs-MYF5,转染HEK293T、水牛颗粒细胞后产生绿色荧光信号,表明细胞表达MYF5基因。     

文山牛SIRT2基因的克隆、表达及亚细胞定位

试验旨在克隆文山牛SIRT2基因,检测SIRT2基因在文山牛不同组织中的表达谱并进行序列分析,鉴定其在293A细胞系中的亚细胞定位。参照GenBank中牛SIRT2基因序列(登录号:NM_001113531.1),在其保守区设计1对特异性引物,以cDNA为模板克隆文山牛SIRT2基因,进行同源性和系统进化分析;以GAPDH基因为内参分析SIRT2基因在文山牛心脏、肝脏、肾脏、肺脏、胃、结肠、肌肉、脂肪8个组织中的表达水平;构建pDsRed-SIRT2真核表达载体并转染到293A细胞系中表达,观察融合蛋白的亚细胞定位。结果表明,文山牛SIRT2基因开放阅读框全长1 173bp,编码390个氨基酸,分子质量为43.3ku,理论等电点为4.985;SIRT2编码蛋白整体表现为亲水性,带有负电荷。文山牛与水牛、白豚、蹄蝠等哺乳动物具有较高的同源性,在系统发育树中距离最近,但与树袋熊距离稍远,推测有袋目哺乳动物在进化过程中过早地与其他哺乳动物产生了遗传差异,在哺乳动物遗传相关的研究中需特殊考虑有袋目哺乳动物。实时荧光定量PCR结果显示,SIRT2基因在文山牛8个组织中均有表达,在肌肉和肝脏中的表达水平较高,与其他组织存在显著差异(P0.05)。pDsRed-SIRT2融合蛋白主要定位于293A细胞的细胞质中,可能参与部分细胞器的运作及细胞内物质的运输,调节细胞稳态并在细胞繁殖过程中提供必要的能量物质。本试验结果为进一步探究牛SIRT2基因功能提供了一定的理论依据。     

沼泽型水牛ALK3基因克隆分析与表达模式研究

试验旨在对沼泽型水牛ALK3基因进行克隆、生物信息学分析,并对其在水牛组织中的表达规律进行系统研究.根据GenBank中已公布的牛ALK3基因序列设计特异性引物,应用RT-PCR方法扩增、克隆获得目的基因片段;应用生物信息学方法分析和预测了水牛ALK3的遗传进化及蛋白质的理化性质、二级和三级结构;并应用QRT-PCR技术对ALK3基因在水牛组织中的表达进行了差异分析.结果表明,水牛ALK3基因编码区全长1 599 bp,共编码532个氨基酸.多重序列比较分析显示,水牛ALK3核苷酸序列与牛、绵羊、猪、马、人和小鼠相应序列的同源性分别为98%、96%、95%、93%、94%和91%.系统进化树分析显示,ALK3基因在不同物种以及进化的过程中具有高度保守性.对ALK3蛋白质的分析表明该蛋白呈弱碱性,有信号肽,细胞亚定位于胞膜上,存在丝氨酸/苏氨酸激酶和GS等结构.定量分析结果显示,ALK3在水牛生殖脊、心脏、肝脏、颗粒细胞、肺脏、卵丘细胞、肾脏、下丘脑、垂体、大脑等15种组织或细胞中有不同程度的表达,其中卵巢中表达量最高,垂体、肺脏和睾丸次之,卵丘细胞表达量最低.本研究成功克隆了沼泽型水牛ALK3基因,并研究了其在不同水牛组织细胞中的表达规律,为阐明其在水牛繁殖过程中的功能及转基因载体构建中的应用研究奠定了理论基础.     

山羊GATA3基因克隆及其真核表达载体构建

本研究旨在克隆山羊GATA3(GATA binding protein 3)基因,构建其真核表达载体,并对该基因进行生物信息学分析。以山羊GATA3基因编码区为种子序列(GenBank登录号:XM_018056969.1),通过SnapGene 4.1.9软件设计引物序列,应用RT-PCR方法扩增山羊GATA3基因完整编码区序列,测序鉴定后基于其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析,并构建pLVX-GATA3-IRES-ZsGreen1慢病毒重组质粒。利用脂质体转染方法将慢病毒重组质粒pLVX-GATA3-IRES-ZsGreen1与病毒包膜质粒pCMV-VSVG、包装质粒pNRF共转染HEK-293T细胞,进行慢病毒包装后收集病毒上清液,成功感染山羊耳尖成纤维细胞。结果显示,山羊GATA3基因编码区序列全长1335 bp,编码444个氨基酸,分子质量为47.94 ku,分子式为C2093H3234N626O625S24,等电点为9.47,其中丝氨酸含量最高(13.3%),色氨酸含量最低(1.1%)。山羊GATA3基因核苷酸序列与牛、猪、驴、马、小鼠及人的相似性分别为97.7%、94.2%、92.2%、92.4%、88.0%和90.1%,不同物种间相似性较高,进化过程中具有高度保守性。系统进化树分析表明,山羊与牛、猪、驴、马及人聚为一支,亲缘关系较近,与非洲蟾蜍、斑马鱼亲缘关系较远。跨膜结构域及亲/疏水性预测结果显示,山羊GATA3蛋白不存在跨膜结构域,为亲水性蛋白。信号肽预测结果表明,该蛋白定位于细胞质中。通过构建山羊GATA3基因慢病毒真核表达载体pLVX-GATA3-IRES-ZsGreen1,细胞水平上转染HEK-293T和山羊耳尖成纤维细胞,过表达GATA3基因,产生绿色荧光信号。本研究结果为山羊GATA3基因功能的研究提供了参考依据,为后续探究GATA3基因在山羊泌乳中的作用奠定了基础。     

西农萨能奶山羊SERPINA1基因克隆、生物信息学及组织表达分析

本研究旨在克隆西农萨能奶山羊SERPINA1基因的CDS区,采用生物软件和在线预测工具进行生物信息学分析,通过实时荧光定量PCR技术检测SERPINA1基因在西农萨能奶山羊各组织间mRNA的表达水平。根据GenBank中山羊SERPINA1基因CDS区序列(登录号:XM_018066209.1),利用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物,RT-PCR扩增目的基因,构建原核表达载体测序后对序列进行生物信息学分析;采集西农萨能奶山羊心脏、肝脏、脾脏、肺脏、乳腺、肾脏、肌肉、瘤胃和小肠组织,提取组织RNA,反转录为cDNA模板,设计特异性定量引物,进行实时荧光定量PCR,检测SERPINA1基因在不同组织中的表达差异。结果显示,西农萨能奶山羊SERPINA1基因CDS区全长1 326 bp,编码441个氨基酸;同源性比对分析显示,西农萨能奶山羊与山羊、绵羊、牛和小鼠SERPINA1基因核苷酸序列同源性分别为100%、98.6%、95.7%和71.6%,与山羊亲缘关系最近,其次是绵羊。SERPINA1蛋白分子质量为48.71 ku,等电点为5.71,为跨膜亲水蛋白;SERPINA1氨基酸序列分别有62个磷酸化位点,3个跨膜区结构。组织表达分析显示,SERPINA1基因在西农萨能奶山羊肝脏组织中显著高表达(P0.05),其次是乳腺组织,在肺脏组织中表达量最低。研究结果为进一步探究SERPINA1基因在奶山羊乳蛋白合成代谢中的作用提供理论依据。     

水牛骨形态发生蛋白1基因的克隆及其在不同组织中的表达研究

本研究克隆了水牛骨形态发生蛋白1(bone morphogenetic protein-1,BMP1)基因序列,并运用生物信息学方法对其核苷酸序列的保守性和氨基酸的理化性质、蛋白质结构进行了系统分析,此外还运用实时荧光定量PCR技术对BMP1基因在水牛不同组织中的表达差异进行了检测。结果表明,应用RT-PCR技术克隆得到水牛BMP1基因的cDNA序列长度为3 195 bp,其中包含完整的2 967 bp的开放读码框(ORF),编码988个氨基酸。经序列相似性分析显示,水牛BMP1基因与牛、猪、马、人和小鼠相应氨基酸序列相似性分别为99%、96%、96%、96%和95%,具有很强的保守性。结合系统进化树分析结果推测,BMP1基因在不同物种及进化的过程中具有高度的保守性。对水牛BMP1蛋白的结构域预测结果发现,其存在1个信号肽区、1个前肽区、1个金属蛋白酶区、5个CUB区和2个EGF-like功能区。定量表达分析结果显示,BMP1基因在水牛心脏组织中相对表达量最高,睾丸、卵巢和生殖嵴等性腺器官表达量次之,骨头等其他组织表达量较低,肝脏表达量最低。     

文山牛SIRT2基因的克隆、表达及亚细胞定位

试验旨在克隆文山牛SIRT2基因，检测SIRT2基因在文山牛不同组织中的表达谱并进行序列分析，鉴定其在293A细胞系中的亚细胞定位。参照GenBank中牛SIRT2基因序列（登录号：NM_001113531.1），在其保守区设计1对特异性引物，以cDNA为模板克隆文山牛SIRT2基因，进行同源性和系统进化分析；以GAPDH基因为内参分析SIRT2基因在文山牛心脏、肝脏、肾脏、肺脏、胃、结肠、肌肉、脂肪8个组织中的表达水平；构建pDsRed-SIRT2真核表达载体并转染到293A细胞系中表达，观察融合蛋白的亚细胞定位。结果表明，文山牛SIRT2基因开放阅读框全长1 173 bp，编码390个氨基酸，分子质量为43.3 ku，理论等电点为4.985；SIRT2编码蛋白整体表现为亲水性，带有负电荷。文山牛与水牛、白豚、蹄蝠等哺乳动物具有较高的同源性，在系统发育树中距离最近，但与树袋熊距离稍远，推测有袋目哺乳动物在进化过程中过早地与其他哺乳动物产生了遗传差异，在哺乳动物遗传相关的研究中需特殊考虑有袋目哺乳动物。实时荧光定量PCR结果显示，SIRT2基因在文山牛8个组织中均有表达，在肌肉和肝脏中的表达水平较高，与其他组织存在显著差异（P<0.05）。pDsRed-SIRT2融合蛋白主要定位于293A细胞的细胞质中，可能参与部分细胞器的运作及细胞内物质的运输，调节细胞稳态并在细胞繁殖过程中提供必要的能量物质。本试验结果为进一步探究牛SIRT2基因功能提供了一定的理论依据。     

类乌齐牦牛EGLN1基因克隆、生物信息学分析及差异表达

为了对牦牛egl-9家族缺氧诱导因子1 (EGLN1)基因的CDS区核苷酸序列进行克隆,预测其编码的蛋白结构和功能,并分析其在牦牛和黄牛心脏、肺脏、肝脏及大脑等器官中的表达差异,试验根据GenBank中公布的黄牛EGLN1基因mRNA序列设计特异性引物,运用RT-PCR技术获取牦牛EGLN1基因的cDNA序列,对牦牛EGLN1基因CDS区核苷酸序列与蛋白质结构进行生物信息学分析,并构建系统进化树,利用荧光定量PCR技术检测黄牛和牦牛心脏、肺脏、肝脏、大脑中EGLN1基因的相对表达水平。结果表明:牦牛EGLN1基因CDS区序列长度为1 263 bp,编码420个氨基酸;EGLN1的半衰期为30 h,属于碱性蛋白,表现为亲水性,无信号肽及跨膜结构;磷酸化位点共30个,存在3个低复杂区域和1个P4Hc结构功能域;二级结构以无规则卷曲为主,三级结构由无规则卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角构成。牦牛和其他9种动物EGLN1基因序列构建系统进化树中,牦牛与水牛亲缘关系最近,同源性高达99.3%,与褐家鼠亲缘关系较远。EGLN1基因在黄牛和牦牛肝脏、大脑、心脏、肺脏4个器官中均有表达,表达量依次递减;EGLN1基因在牦牛各器官中的相对表达量均显著高于黄牛(P0.05),其中牦牛肝脏中的相对表达量约为黄牛的5.5倍。说明EGLN1基因可作为牦牛低氧适应性研究的重要基因之一。     

牦牛TBC1D7基因克隆、生物信息学及表达分析

为探究西藏牦牛Tre2-Bub2-CDC16结构域家族成员7(TBC1D7)基因的特征及结构,利用RT-PCR克隆了TBC1D7基因的CDS区序列,并对其进行了生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测了TBC1D7基因在牦牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉及脂肪组织的表达水平。结果表明,牦牛TBC1D7基因的CDS区全长为882 bp,共编码293个氨基酸;系统进化树分析结果表明,西藏牦牛与野牦牛的亲缘关系最近,与兔的最远;生物信息学分析结果表明,牦牛TBC1D7蛋白不存在信号肽和跨膜结构,属于亲水性蛋白,主要存在细胞核中,且该蛋白具有24个潜在的磷酸化位点,蛋白的高级结构由α-螺旋（65.53%）、延伸连（3.75%）、β-转角（3.75%）和无规则卷曲（29.96%）构成。qPCR检测结果显示,TBC1D7基因在西藏牦牛脾脏组织中的表达最高,极显著高于其他组织（P <0.01）。     

水牛FGF10基因的克隆分析及其在不同组织中表达情况的研究

本实验旨在对水牛成纤维细胞生长因子10(FGF10)基因进行克隆、生物信息学分析,同时探讨其在不同组织中的表达模式。以水牛卵巢的总RNA为模板,通过RT-PCR方法克隆得到FGF10基因CDS区全长642 bp,编码213个氨基酸。多重序列分析显示,水牛FGF10基因核苷酸序列与黄牛、羊、猪、人、小鼠同源性分别达到了99%、99%、93%、91%和89%。系统进化树分析表明,水牛和黄牛亲缘性最近,并且在不同物种进化过程中具有高度保守性。QRT-PCR结果表明,FGF10在睾丸中的表达量最高,卵巢和脾脏次之,肝脏和心脏中最低。本研究成功克隆水牛FGF10基因,并检测其在水牛不同组织中的差异表达,为研究FGF10基因在水牛卵泡发育过程中的作用奠定基础。     

一种犬细小病毒基因工程抗体的制备

本研究旨在利用HEK-293细胞系制备鼠源犬细小病毒(canine parovirus,CPV)基因工程抗体并检测其生物活性。通过抗体亚型检测试剂盒检测CPV单克隆抗体亚型;采用间接ELISA检测CPV单克隆抗体的亲和力和特异性;经RACE-PCR获得CPV单克隆抗体的可变区序列,将可变区序列与鼠源抗体恒定区序列连接;分别构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-L和pcDNA3.1(+)-H,将载体共转染HEK-293细胞,采用血凝抑制与中和试验的方法检测鼠源CPV基因工程抗体生物活性;采用HEK-293F细胞悬浮表达并用间接ELISA方法检测鼠源CPV基因工程抗体的表达量;用Protein A亲和层析柱纯化鼠源CPV基因工程抗体后进行SDS-PAGE鉴定;间接免疫荧光检测纯化后鼠源CPV基因工程抗体的活性。结果显示,CPV单克隆抗体亚型为IgG_(2b),亲和力常数6个Ka平均值为1.02×10~(11) L/mol,只与CPV VLPs发生反应。琼脂糖凝胶电泳结果显示,试验成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-L和pcDNA3.1(+)-H;HEK-293和HEK-293F细胞培养上清液血抑效价分别为1∶2~4和1∶2~6,中和试验结果显示,HEK-293和HEK-293F细胞培养上清液中和效价分别为1∶152和1∶1 290;鼠源CPV基因工程抗体在HEK-293F细胞中的表达量为5.97 mg/L,SDS-PAGE分析在55和25 ku处出现条带,表明鼠源CPV基因工程抗体成功在HEK-293F细胞中表达并纯化。间接免疫荧光检测结果表明,纯化后鼠源CPV基因工程抗体具有良好的生物活性。本研究在HEK-293F细胞中成功表达具有中和活性、纯度较高的鼠源CPV基因工程抗体,为今后CPV基因工程抗体药物的研发奠定基础。     

合作猪SIRT3基因克隆、生物信息学分析及组织表达研究

【目的】克隆合作猪沉默信息调节因子3(silence information regulator 3,SIRT3)基因CDS区序列,并对其进行生物信息学分析,探究SIRT3基因在合作猪不同组织中的表达水平,为研究SIRT3基因功能奠定基础。【方法】试验选择3月龄合作猪公猪3头,采集心脏、睾丸、肺脏等组织,采用PCR扩增、Sanger测序等方法获取SIRT3基因CDS区序列,并通过Mega 7.0软件构建系统进化树;通过生物信息学在线软件分析SIRT3蛋白结构和功能;采用实时荧光定量PCR检测SIRT3基因在合作猪不同组织中的表达量。【结果】合作猪SIRT3基因CDS区长774 bp,共编码257个氨基酸。系统进化树结果显示,合作猪与家猪亲缘关系最近,与斑马鱼亲缘关系最远。SIRT3蛋白的分子质量为28.68 ku,理论等电点为5.81,不稳定系数为37.92,为稳定性亲水蛋白;该蛋白不存在跨膜区域,无信号肽,但存在2个低复杂度结构域,主要分布于内质网中;SIRT3蛋白的二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,三级结构模型预测结果与二级结构基本一致。实时荧光定量PCR结果显示,SIRT3...     

水牛转录因子Sox2和Lin28克隆与表达研究

本研究克隆水牛特异性转录因子Sox2和Lin28,构建表达载体,为进一步研究2个基因在水牛干细胞多能性调控中的作用奠定基础。以胎牛生殖嵴总RNA为模版,采用RT-PCR扩增Sox2和Lin28的编码区序列(CDS),构建逆转录表达载体pMSCV-Sox2和pMSCV-Lin28,转入NIH3T3细胞,鉴定其表达情况。结果表明:水牛Sox2和Lin28的CDS全长分别为966 bp和618 bp,蛋白结构保守;Sox2、Lin28氨基酸序列与牛、猪、人和鼠相应氨基酸序列的相似性分别为96%、95%、94%、94%和98%、97%、89%和91%;pMSCV介导的Sox2和Lin28能在NIH3T3细胞中表达。