猪丁型冠状病毒CH/GX/1468B/2017的分离鉴定及全基因组序列分析

本研究于广西某猪场采集疑似感染猪丁型冠状病毒（porcine deltacoronavirus,PDCoV）的腹泻仔猪小肠及其内容物进行病毒分离,并通过细胞病变（CPE）、RT-PCR、间接免疫荧光（IFA）和全基因序列测定分析对分离的病毒进行鉴定。结果显示,试验成功分离到1株PDCoV,命名为CH/GX/1468B/2017（简称PDCoV 1468B）。该毒株可稳定有效地在LLC-PK细胞生长增殖,并引起典型CPE;该毒株已在LLC-PK细胞连续传代15代,病毒滴度随着传代次数的增加逐渐提高并稳定在10^8.10TCID₅₀/mL以上。该毒株全基因组序列长25 399 nt;与23个GenBank中登录的参考毒株的全基因组序列比对显示,核苷酸同源性为97.2%~99.4%,其中PDCoV 1468B分离毒株与Vietnam/Binh21/2015株同源性最高,为99.4%。全基因组系统进化分析显示,PDCoV 1468B分离毒株属于Ⅱ群,与东南亚国家PDCoV毒株亲缘关系密切,处于同一进化分支。综上所述,本研究成功分离出PDCoV 1468B株并进行了全基因序列分析,为进一步开展PDCoV致病性等生物学特性研究及疫苗研制奠定了基础,同时可为PDCoV的遗传进化提供数据支持。     

猪流行性腹泻病毒CH/GX/2015/750A株的分离鉴定及全基因组序列分析

本研究旨在获得可在细胞培养中稳定、有效生长增殖的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)分离毒株,并对其全基因组序列进行测定分析。应用Vero细胞从广西腹泻仔猪肠道内容物中进行病毒分离,通过细胞病变和RT-PCR对细胞培养物进行鉴定,应用下一代测序技术对分离毒株全基因组序列进行测定。结果显示,成功分离到1株PEDV,命名为CH/GX/2015/750A。该毒株可稳定有效地在Vero细胞生长增殖,并引起典型的细胞病变;已在Vero细胞连续传代25代,病毒滴度随着传代次数的增加逐渐提高并稳定在107.50TCID50/mL。该毒株全基因组序列长28 038bp;与22个参考毒株的全基因序列比对显示,核苷酸同源性为96.8%~99.8%,其中与YC2014株同源性最高,为99.8%。全基因组和S基因系统进化分析显示,PEDV CH/GX/2015/750A分离毒株属于Ⅱa亚群,与YC2014、PEDV-WS等变异毒株亲缘关系密切。结果表明,本研究分离获得的CH/GX/2015/750A毒株是PEDV地方流行变异毒株。     

猪流行性腹泻病毒CH/GX/2015/750A株的分离鉴定及全基因组序列分析

本研究旨在获得可在细胞培养中稳定、有效生长增殖的猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）分离毒株,并对其全基因组序列进行测定分析。应用Vero细胞从广西腹泻仔猪肠道内容物中进行病毒分离,通过细胞病变和RT-PCR对细胞培养物进行鉴定,应用下一代测序技术对分离毒株全基因组序列进行测定。结果显示,成功分离到1株PEDV,命名为CH/GX/2015/750A。该毒株可稳定有效地在Vero细胞生长增殖,并引起典型的细胞病变;已在Vero细胞连续传代25代,病毒滴度随着传代次数的增加逐渐提高并稳定在10^7.50TCID₅₀/mL。该毒株全基因组序列长28 038 bp;与22个参考毒株的全基因序列比对显示,核苷酸同源性为96.8%~99.8%,其中与YC2014株同源性最高,为99.8%。全基因组和S基因系统进化分析显示,PEDV CH/GX/2015/750A分离毒株属于Ⅱa亚群,与YC2014、PEDV-WS等变异毒株亲缘关系密切。结果表明,本研究分离获得的CH/GX/2015/750A毒株是PEDV地方流行变异毒株。     

猪丁型冠状病毒的分离鉴定

2016年从某商品化猪场采集到6份疑为病毒性腹泻的腹泻仔猪小肠样本,利用RT-PCR对样品进行检测,检出1份猪丁型冠状病毒(Porcine Deltaconoravirus,PDCoV)阳性样品,使用ST细胞进行病毒分离和传代.通过细胞病变(CPE)、RT-PCR及S基因序列测定分析对分离的病毒进行鉴定,试验结果表明,...     

猪德尔塔冠状病毒CH7328株的致病性及全基因组序列分析

为了解猪德尔塔冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV） CH7328株的致病性,并分析其基因变异和遗传演变规律,试验通过病毒培养、间接免疫荧光试验（IFA）、病毒生长曲线及仔猪致病性试验鉴定病毒的生长特性和致病性,并分析该毒株的全基因组序列。结果显示,感染PDCoV CH7328株的ST细胞出现肿大变圆、细胞呈碎玻璃状且拉丝、细胞集聚成簇和脱落等病变。IFA结果显示,PDCoV CH7328株主要分布在细胞质中。生长曲线结果显示,PDCoV CH7328株在6 h就已开始增殖,在36 h时达到峰值,对应的TCID₅₀为10^-8.0/mL,随后逐渐下降。仔猪致病性结果显示,攻毒组仔猪出现腹泻、脱水和厌食等临床症状,仔猪小肠明显变薄、透明而充盈,小肠绒毛严重脱落、萎缩或减少、肠绒毛细胞坏死等。粪便病原检测结果显示,在攻毒第2天便能检测到病毒,之后排毒持续增加,而正常对照仔猪无任何临床现象。全基因组测序及序列分析显示,PDCoV CH7328株的基因组全长为25 420 bp,与国内GD株的相似性最高,达到99.9%;遗传演化结果显示,PDCoV CH7328株与国内HKU15-155、CHN-HN-2014和GD株处在同一进化分支,亲缘关系最近。本研究结果为中国PDCoV疫苗候选株的筛选及猪场疫病防控提供了参考数据和理论依据。     

猪丁型冠状病毒的分离鉴定与基因分析

对山东省某养殖场的腹泻病料进行检测,确认为猪丁型冠状病毒(PDCoV)阳性。使用ST细胞分离到一株PDCoV,命名为SD株。全基因序列测定以及与GenBank中其他68株PDCoV全基因序列比对分析以及遗传进化分析结果表明:PDCoV SD株的全基因组(不包括3'poly(A)尾)序列长度为25414个核苷酸(nt),与参考株HKU15-155、CH/Sichuan/S27/2012和CH-HB-2014的核苷酸同源性分别为98.97%、99.06%和99.13%;此外,在nsp2区的1739~1744位(对应于HKU15-44序列)中的6 nt(TTTGAA)缺失和nsp3区的2810~2818位的9 nt(TCGGCAATG)缺失为特征性基因突变;69株PDCoV呈现出明显的地域特征,其中美国与韩国的PDCoV毒株为一个大分支,越南与泰国PDCoV毒株为另一个小分支,中国的23株PDCoV则呈现出4个小分支,充分展现了该病毒的基因多样性。试验可为中国PDCoV的流行病学和诊断研究以及进一步的疫苗开发提供参考。     

猪轮状病毒的分离鉴定和全基因组序列分析

为了解广东省规模化猪场中猪轮状病毒(PoRV)流行毒株的基因特征,本试验在广东省某猪场采集腹泻仔猪肠道组织样品,经实时荧光定量PCR(qPCR)进行病毒初步鉴定;分离获得病毒后,通过间接免疫荧光、电镜观察进一步鉴定,并对分离毒株进行全基因组高通量测序和遗传进化分析。结果显示,qPCR初步鉴定该腹泻仔猪病料为PoRV感染,从阳性病料中分离获得1株能引起典型细胞病变的毒株,在电镜下可观察到似车轮状的病毒颗粒,在倒置荧光显微镜下观察有绿色荧光,将该PoRV分离毒株命名为GD2022,其完整基因型为G9-P[23]-I5-R1-C1-M1-A8-N1-T1-E1-H1;基因遗传进化分析结果显示,GD2022为人轮状病毒、猪轮状病毒和狗轮状病毒基因组重组后的毒株。本试验结果丰富了PoRV基因组学和分子流行病学相关的研究资料,为轮状病毒防控提供了数据支持。     

鹅星状病毒的分离鉴定及全基因组序列分析

2017年10月—2019年5月,本实验室从广东、四川、河北、山东、安徽、辽宁等广大养鹅地区采集了67份典型雏鹅痛风样品进行了实验室检测以及病原的分离鉴定,检测结果表明：所有样品中均检测到了鹅星状病毒,并且约有94.03%的样品为两个不同种的鹅星状病毒混合感染。病原分离结果表明：鹅星状病毒FLX株的变异株病毒（命名为SCCD）可以在鹅胚上稳定增殖,并且能稳定致死10日龄鹅胚,致病力较鹅星状病毒FLX增强;新型鹅星状病毒株（命名为SDPD）不能在鹅胚和SPF鸡胚上稳定增殖。病毒的基因组测序结果表明：鹅星状病毒FLX株与鹅星状病毒FLX的变异株病毒SCCD株、新型鹅星状病毒SDPD株全基因组核苷酸相似性分别为89.7%、58.1%,ORF1b基因氨基酸相似性分别为98.4%、61.0%,ORF2基因氨基酸相似性分别为81.0%、42.5%。将新分离的鹅星状病毒株接种1日龄健康雏鹅,结果表明,鹅星状病毒SCCD株和鹅星状病毒SDPD株虽然能使雏鹅发生死亡,引起肝炎、肾肿胀和增重减少等变化,但雏鹅均无典型痛风（脏器尿酸盐沉积）表现,而两种鹅星状病毒株混合攻毒能使44%的雏鹅发生典型痛风,并与临床发病症状一致。因此,临床上引起雏鹅痛风的病原可能是两种鹅星状病毒,即新型鹅星状病毒和鹅星状病毒FLX的变异株病毒。     

猪圆环病毒2型的分离鉴定及全基因组克隆和序列分析

通过PCR方法对采自四川省某规模化猪场一批疑似断奶仔猪多系统衰弱综合征病例的肺脏、淋巴结进行PCV-2的抗原检测,并将检测结果为阳性的对应组织研磨、过滤除菌后接种无PCV-1污染的PK-15细胞,盲传15代后,IFA方法检测出有明显的特异性荧光,将该毒株命名为PCV-2-SC株,并对PCV-2-SC病毒基因组全长进行扩增及克隆、测序与比对分析。测序结果显示该病毒基因组全长1 767bp,分离株与国内外参考毒株核苷酸序列相似性在95.2%～99.5%之间,进化树分析表明,PCV-2分离毒株在进化上存在地域相关性。PCV-2四川株的分离鉴定为其诊断试剂的研制及检测方法的建立奠定了基础。     

猪圆环病毒2型Guizhou-LZTQ/2017株全基因组序列分析

为了解贵州省某新建猪场由猪圆环病毒2型(PCV2)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的保育猪咳喘、腹泻死亡的病原中PCV2的基因型和变异情况,采用基因克隆技术,对其全基因进行克隆分析。结果显示,PCV2/Guizhou-LZTQ/2017株全长为1768bp,属PCV2a型,与国内外毒株碱基之间存在多处差异;其ORF2基因编码的Cap蛋白氨基酸与常用疫苗毒株之间同源性在92.2%~93.7%之间,与省内已经报道的PCV2毒株ORF2之间的氨基酸同源性在90.2%~92.7%之间,与4株疫苗株指数差异性较大;全基因遗传进化分析,其与Guangdong株和GZ-CS12012株属同一细分支,亲缘关系最近。研究结果可为后续PCV2分子生物学研究、流行病学调查及疫苗的选用提供基础数据。     

鸭坦布苏病毒分离鉴定及全基因组序列分析

本文采集2015年浙江省2个鸭养殖场中疑似鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)感染的雌麻鸭卵巢病料,经组织研磨处理,DF-1细胞纯化,成功分离了2株鸭坦布苏病毒(DTMUV),分别命名为ZJ201501和ZJ201504。利用9对两两相互重叠的PCR引物,对这2株病毒的全基因进行分段PCR扩增,经序列测定和拼接,得到病毒的全基因组序列。核苷酸序列和E蛋白氨基酸序列比对分析发现:ZJ201501和ZJ201504的核苷酸同源性高达99.9%,全长氨基酸仅有2个位点差异;与选取的19株DTMUV参考序列相比,在核苷酸水平和E蛋白氨基酸水平上,其同源性分别大于97.1%和98.4%,而ZJ201501和ZJ201504与早期分离的DTMUV FX2010遗传距离最远,这表明DTMUV在鸭群中发生了一定的变异。本研究为进一步了解DTMUV的遗传进化提供了理论依据。     

竹鼠源细小病毒分离鉴定及全基因组序列分析

【目的】了解并掌握广西地区竹鼠细小病毒(Bamboo rat parvovirus, BRPV)的生物学特性及遗传变异情况,为BRPV的防控提供理论依据和技术支撑。【方法】用养殖场患病死亡的竹鼠病料制备组织上清液,采用Vero细胞同步接毒法进行病毒分离,通过细胞病变观察、PCR、透射电镜观察及血凝试验等方法鉴定,设计合成特异性扩增引物对BRPV全基因组序列进行测序分析。【结果】分离获得的病毒可在Vero细胞上稳定生长增殖,感染细胞变长、变梭或成拉丝状;病毒纯化后经电镜观察可见呈立体对称、无囊膜、直径20～25 nm的病毒粒子;经PCR鉴定、凝集试验及全基因组测序表明,分离株为BRPV。本研究共获得3株BRPV(GenBank登录号：MF497824、MF497825、MF497826),毒株基因组全长约4 758 bp,全基因组序列比对发现,其与蝙蝠源细小病毒关系较近。BRPV基因编码氨基酸遗传特征与其宿主特异性有很强的相关性,NS1基因编码氨基酸变异与蝙蝠及大鼠源细小病毒更接近,与其处于同一分支,核苷酸相似性为96.9%～97.6%,氨基酸相似性为97.5%～98.4%。其中第257...     

地方品种鸡ALV-J的分离鉴定及全基因组序列分析

为研究扬州地方品种苏禽绿壳蛋鸡中禽白血病病毒(ALV)的来源及其变异趋势,本研究从扬州某规模化种鸡场病鸡中分离到多株病毒,并测定了1株ALV-J(JS18YZ09)的全基因组序列,对该全基因组序列进行比对分析,结果显示,分离株全基因组序列与2009年江苏地区蛋鸡分离株JS09GY3同源性最高,为93.7%,但其5'LTR和3'UTR区变异较大。其env基因则与2013年广东肉鸡分离株GD13GZ同源性最高。JS18YZ09株5'LTR序列含有多至6个潜在转录因子结合位点C/EBPalp,同时U3区有11 bp的缺失,在其3'UTR的rTM区存在175 bp的缺失。综合5'LTR,env和3'UTR区序列特征,推测引起本次地方品种苏禽绿壳蛋种鸡禽白血病的ALV-J很可能来源于江苏地区蛋鸡分离株JS09GY3,但其可能已经与广东地区株GD13GZ株发生了重组,且有新的变异趋势。本实验对苏禽绿壳蛋鸡ALV分子流行病学的分析研究丰富了ALV的生物信息数据库。     

传染性支气管炎CK/CH/HD/190716株的分离鉴定与全基因组分析

对河北某免疫鸡场采集疑似感染传染性支气管炎病毒(IBV)鸡的肺脏进行病毒分离,并通过鸡胚接种和全基因序列测定分析,对分离病毒进行鉴定和遗传变异分析。分离到1株IBV,命名为CK/CH/HD/190716,该病毒接种鸡胚后可产生IBV特征性的侏儒胚。该病毒基因组总长为27 680 bp,其中Ploy A尾含有16个A。将分离株基因序列与不同基因型的IBV毒株进行同源比对,构建遗传进化树进行基因分型,证实该毒株属于QX型。选取我国分离的14株QX型IBV与之比较同源性,发现该型病毒全基因组的同源性在93%～97%,但是5a基因的同源性最低,只有80%,表明IBV各基因之间的进化具有显著差异。随后通过多个重组软件分析证实,该毒株的1a基因部分区域由QX型野毒KX425847和KU317090重组产生。本试验揭示了我国流行的QX型IBV存在基因多样性,需要对该型病毒的遗传演化进行密切监测。     

一株猪蓝耳病毒的分离鉴定及其全基因组序列的比较分析

从湖北省某猪场分离了一株猪蓝耳病毒(CH-WH-19),其基因组全长是14993 bp。同源性分析结果显示CH-WH-19与NADC30、JXA1、CH-1a、VR-2332和GM2的相似性分别为91.9%、84.3%、83.9%、83.3%和80.5%,但是与欧洲型的毒株Lelystad virus相似性仅有58.9%。GP5基因和全基因组的进化树分析显示,CH-WH-19与NADC30毒株处于同一分支。Nsp2基因氨基酸比对结果发现,CH-WH-19和NADC30毒株与VR2332毒株相比具有不连续的131个氨基酸缺失的特征。同源性和进化树的结果都显示了CH-WH-19属于新变异的类NADC30毒株。GP5序列比对结果表明,CH-WH-19有一些氨基酸的突变,A137是疫苗株VR2332的标志,但CH-WH-19毒株突变成了S,N34是四个潜在的N-糖基化位点之一,突变成了D。试验表明,本研究分离了一株变异的NADC30毒株,生物学特性分析也表明属于类NADC30毒株。     

猫杯状病毒的分离鉴定及其全基因组的序列分析

本研究采用MDCK细胞从养殖场患病猪的鼻拭子样品中分离获得1株猫的杯状病毒(Feline calicivirus,FCV),命名为GX01-2013。采用RT-PCR方法扩增了该毒株的全基因组,并进行了序列测定和分析。结果表明,该毒株基因组全长7704 bp,与哈尔滨分离株HRB-SS较为相近,其核苷酸同源性为82.3%。根据FCV衣壳蛋白构建的遗传进化树分析,发现该病毒与F9、F4、225和2024疫苗株均不在同一分支,氨基酸同源性为84.2%~87.7%,各毒株间无明显地域差异。此外,VP1蛋白的E区(426~521aa)发现有4个中和性抗原位点发生改变。     

猪圆环病毒2b亚型的分离鉴定及基因组序列分析

为分离鉴定流行于重庆某猪场的猪圆环病毒2型,本研究从断奶仔猪多系统衰竭综合征猪的淋巴结病料中进行病毒学检测,病毒利用PK-15细胞增殖,其基因组序列经克隆、测序、拼接获得,并完成对全序列的生物信息学分析鉴定。结果获得了1株猪圆环病毒2型(命名PCV-2CQ1),该毒株的全序列大小为1 767bp,同源性分析发现该病毒与国内公布的PCV-2毒株同源性超过了90%,尤其与广西分离株同源性达100%;系统进化分析本分离病毒与浙江株(EU257511)、黑龙江株(HM038032)聚类到一起,形成一个进化分支,同属于PCV-2b型;对编码的衣壳蛋白分析发现,PCV-2CQ1Cap氨基酸发生了较大变异,与强毒株同源性较高,考虑到本病毒源自PMWS病猪,推测该毒株属于强毒株。     

鹅细小病毒HN株的分离鉴定及全基因组序列分析

为研究鹅细小病毒(GPV)基因遗传变异特征,采集海南某养鹅场疑似鹅细小病毒感染的病料,将其处理后接种番鸭胚成功分离到一株病毒,经PCR鉴定为鹅细小病毒,命名为HN株,并获得了其全基因组序列,将该序列与GenBank数据库中登录的16条鹅和番鸭细小病毒基因序列进行了比对分析。结果显示,该株病毒基因组全长为5 106bp,由ITR、NS、VP构成,其中ITR为444bp,NS1为1 844bp,VP1为2 199bp;HN株与SHFX1201株的NS1基因和VP1同源性最高,分别达到99.8%和99.7%,与番鸭细小病毒株FM的NS1基因同源性最低,为82.7%;与90-0215株VP1同源性最低,为80.1%。HN株的遗传进化树可以看出,GPV可以分成明显的2个基因亚群,HN株与鹅细小病毒匈牙利株(B)、欧洲疫苗株(VG32/1)和台湾株(82-0321V、82-0321、06-0329)均处在第I亚群,且与安徽分离株Y株以及SHFX1201株同源性最接近,番鸭源匈牙利株FM单独处于第Ⅱ亚群。本研究丰富了GPV的数据资料,为研究GPV分类地位以及遗传进化关系提供了依据,同时也为研究GPV流行趋势和疫苗的开发奠定了基础。     

一株蛋鸡新城疫病毒的分离鉴定及全基因组序列分析

为研究云南新城疫病毒（NDV）分子流行特性和致病性,对云南省1个蛋鸡场的组织样品进行病原分离,通过血凝、血凝抑制试验和RT-PCR检测分离毒株,证明为NDV。通过病毒最小致死量（MLD）、鸡胚半数感染量（EID₅₀）、鸡胚平均死亡时间（MDT）、脑内接种致病指数（ICPI）和静脉接种致病指数（IVPI）测定病毒毒力,结果EID₅₀为10^-4.4,MLD为10^-4,MDT为97.5 h,ICPI为0,IVPI为0,显示分离株为弱毒株。高通量测序及遗传进化分析发现,分离毒株基因组全长为15 198 bp,从3'端到5'端有6个结构基因依次为NP-P-M-F-HN-L,各基因之间有1~48个核苷酸间隔。全基因组、F和HN基因遗传进化分析证明分离毒株属于Class Ⅰ分支,F基因ORF全长为1 662 bp,编码553个氨基酸,F蛋白裂解位点氨基酸序列为112-ERQERL-117,符合NDV弱毒裂解位点特征,HN基因ORF全长为1 851 bp,编码616个氨基酸,在HN基因保守区域234-NRKSCS-239位氨基酸序列没有发生变异。F蛋白有6个糖基化位点比较保守,HN蛋白有6个潜在的糖基化位点,但与LaSota相比存在缺失的和多出的糖基化位点。F蛋白半胱氨酸残基分布在76、199、338、347、362、370、394、399、401、424、514、523位氨基酸,F蛋白中性抗原位点在72、75、79和170位氨基酸发生了变异,HN蛋白受体结合部位和NA活性位点氨基酸为174R、401E、416R、526Y,未发生变异。本研究首次报道了云南省蛋鸡新城疫ClassⅠ毒株的全基因序列特征,为新城疫病毒ClassⅠ毒株研究奠定了基础。     

一株蛋鸡新城疫病毒的分离鉴定及全基因组序列分析

为研究云南新城疫病毒(NDV)分子流行特性和致病性,对云南省1个蛋鸡场的组织样品进行病原分离,通过血凝、血凝抑制试验和RT-PCR检测分离毒株,证明为NDV。通过病毒最小致死量(MLD)、鸡胚半数感染量(EID_(50))、鸡胚平均死亡时间(MDT)、脑内接种致病指数(ICPI)和静脉接种致病指数(IVPI)测定病毒毒力,结果EID_(50)为10~(-4.4),MLD为10~(-4),MDT为97.5 h,ICPI为0,IVPI为0,显示分离株为弱毒株。高通量测序及遗传进化分析发现,分离毒株基因组全长为15 198 bp,从3′端到5′端有6个结构基因依次为NP-P-M-F-HN-L,各基因之间有1～48个核苷酸间隔。全基因组、F和HN基因遗传进化分析证明分离毒株属于ClassⅠ分支,F基因ORF全长为1 662 bp,编码553个氨基酸,F蛋白裂解位点氨基酸序列为112-ERQERL-117,符合NDV弱毒裂解位点特征,HN基因ORF全长为1 851 bp,编码616个氨基酸,在HN基因保守区域234-NRKSCS-239位氨基酸序列没有发生变异。F蛋白有6个糖基化位点比较保守,HN蛋白有6个潜在的糖基化位点,但与LaSota相比存在缺失的和多出的糖基化位点。F蛋白半胱氨酸残基分布在76、199、338、347、362、370、394、399、401、424、514、523位氨基酸,F蛋白中性抗原位点在72、75、79和170位氨基酸发生了变异,HN蛋白受体结合部位和NA活性位点氨基酸为174R、401E、416R、526Y,未发生变异。本研究首次报道了云南省蛋鸡新城疫ClassⅠ毒株的全基因序列特征,为新城疫病毒ClassⅠ毒株研究奠定了基础。