黄色瘤胃球菌纤维小体脚手架蛋白ScaC基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

为获得纤维小体（cellulosome）的基本元件,本试验以滩羊瘤胃液微生物混合DNA为模板,根据黄色瘤胃球菌纤维小体的脚手架蛋白ScaC基因序列（GenBank登录号：JN109634.1）设计特异性引物,扩增纤维小体脚手架蛋白基因,并对其进行克隆、测序及核苷酸和氨基酸序列分析;同时构建脚手架蛋白基因原核表达载体,分析其在大肠杆菌中的表达情况。结果显示,试验利用1对引物同时成功克隆获得2个脚手架蛋白编码基因,其中一个基因全长867 bp,编码288个氨基酸,命名为ScaC2基因;另一个基因全长870 bp,编码289个氨基酸,命名为ScaC7基因。核苷酸序列分析表明,脚手架蛋白基因ScaC2与ScaC7的核苷酸序列相似性为74.1%,ScaC2基因与黄色瘤胃球菌AGY80P318及ScaC7基因与黄色瘤胃球菌DA640P037 ScaC基因核苷酸序列相似性均为99%;氨基酸保守序列分析显示,ScaC2和ScaC7氨基酸序列均具有典型的脚手架蛋白结构域,含有1个Ⅰ型黏附域和1个Ⅰ型锚定域。蛋白表达分析显示,ScaC2和ScaC7基因均能在大肠杆菌中实现可溶性表达,表达产物大小约为33 ku。本试验克隆获得的纤维小体的脚手架蛋白基因ScaC2和ScaC7可为后续人工纤维小体的构建提供基本材料。     

瘦蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用 RT- PCR方法从猪脂肪组织扩增出瘦蛋白基因 ,将其插入 p MD1 8- T克隆载体 ,经序列分析证明 ,所获得的目的基因为 4 4 1 bp,与预期大小一致。提取质粒后用 Eco R 和 Xho 双酶切 ,克隆入 p ET- 2 8a表达载体 ,将阳性重组质粒转化表达受体菌 E.coli BL 2 1 ( DE3) ,经 IPTG诱导 ,SDS- PAGE检测 ,证明在 E.coli BL 2 1中正确表达了重组猪瘦蛋白     

三江白猪OB基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

三江白猪是我国以长白猪和东北民猪为亲本,进行正反杂交,再用长白猪回交,经6个世代定向选育培育而成的瘦肉型新品种,胴体瘦肉率可达57.8%。试验的目的是克隆三江白猪的OB基因,并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,研究其表达情况。现报道如下。1材料与方法1.1主要试剂总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒,购自Pro-mega公司;pMD18-T、pET-28a、T4 DNA连接酶、LA Taq DNA聚合酶(5 U/μL)、Ex TaqTM DNA聚合酶(5 U/μL)、各种限制性内切酶(EcoRⅠ、Xho I),均为TaKaRa公司产品;引物由上海鼎安生物科技有限公司合成。1.2总RNA提取按R…     

猪源抗体基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

为制备原核表达猪源重组抗体,本研究利用FITC标记的山羊抗猪Ig G标记猪外周血淋巴细胞,通过流式细胞术筛选出Ig G+B细胞。以提取的Ig G+B细胞总RNA反转录制备的c DNA为模板,通过PCR扩增猪抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),将扩增的可变区与本实验室前期克隆的猪源抗体恒定区编码序列通过Linker序列[(Gly)4Ser]3连接,构建全长的猪源抗体编码基因(H-linker-L)。将该基因克隆于原核表达载体p ET-28a中进行原核表达及纯化。Western blot鉴定结果表明,该重组蛋白能够被兔抗猪Ig G-HRP所识别,表明构建的重组抗体为猪源抗体。本研究为特异性猪源抗体的制备以及猪病的防制奠定了基础。     

奶牛诱导型热休克蛋白70基因片段的克隆及其在大肠杆菌中的表达

热休克蛋白(Heat shock proteins,Hsp)是细胞受应激后产生的一类蛋白质,其中最重要的、高度保守的一类热休克蛋白是Hsp70[1].Hsp70-1A和Hsp70-1B几乎被相同的基因编码,被统称为Hsp70(Hsp72或iHsp70).Hsp70在未应激正常细胞或组织内以较低的不可检测到的低水平表达,当机体发生生理变化或遭受应激后会被诱导而迅速表达,因此被称为诱导型Hsp70.     

黄色瘤胃球菌木聚糖酶基因xynB的异源表达与酶学性质研究

该试验以黄色瘤胃球菌基因组为模板,通过PCR扩增获得目的基因xynB,将xynB与表达载体PET28a连接,获得重组载体PET28a-xynB。用IPTG对含有重组载体的大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,镍离子层析柱纯化后检测其酶学性质。生物信息学分析表明,XynB理论大小为47 kDa,预测等电点为4.49,不含信号肽,含有1个糖苷水解酶11家族结构域和1个碳水化合物结合结构域。酶学性质研究结果表明,该酶的最适pH值为5.0,最适反应温度为40℃,金属离子Mg²⁺、Na⁺、K⁺和Ba²⁺对木聚糖酶XynB有较好的激活效果。综上可知,黄色瘤胃球菌木聚糖酶XynB属于GH11家族,最适pH值为5.0,最适温度为40℃,酶比活力为62.94 U/mg。     

禽致病性大肠杆菌pilA基因的克隆及其在乳酸菌中的表达

根据GenBank中禽致病性大肠杆菌pilA基因序列设计合成1对引物,以本实验室分离的禽致病性大肠杆菌基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增得到pilA基因片段,经测序鉴定准确后将其克隆到乳酸乳球菌表达载体pMG36e中,构建重组质粒并将其电转入乳酸乳球菌MG1363,得到重组乳酸乳球菌。SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白约为19 ku,与预期相符。Western blot进一步证实了该蛋白的免疫反应性。     

牛分枝杆菌MPB70基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

本研究以牛分枝杆菌Vallee111染色体DNA为模板,以MPB70成熟蛋白基因特异性引物进行PCR扩增,获得约500bp的DNA片段.通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pGEM-T Vector中,成功地构建出克隆载体pGEM-T-70.以BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切pGEM-T-70和pET28a( ),并将纯化的MPB70基因亚克隆至pET28a( )中,构建出原核表达载体pET28a-70.将pET28a-70转化至感受态E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约25Ku外源蛋白带.Western blot分析发现,该蛋白具有牛分枝杆菌抗原性,从而为进一步研究MPB70的亚单位疫苗及DNA疫苗奠定基础.     

鸡新城疫融合蛋白基因在大肠杆菌中的表达

根据NDVNL株的F基因序列，自行设计带有XbaⅠ和XhoⅠ酶切位点的一对引物,应用聚合酶链式反应(PCR)扩增含NDVF基因的PFL质粒,扩增结果与设计相符，大小为630bp。该片段覆盖F基因的2/3的抗原决定簇。对该片段两端酶切后，克隆到融合表达载体pThioHisB中，并转化到大肠杆菌Top10内，利用AMP抗性筛选阳性重组子，并用PCR及双酶切鉴定克隆成功，用IPTG化学诱导表达了F基因。经SDS－PAGE电泳分析，结果在分子量约为35KD处可见到表达的蛋白条带。这与根据核苷酸大小计算的蛋白及融合蛋白之和的大小相符。说明外源片段插入正确表达成功。用HRP标记的兔抗鸡抗体与该条带进行Western－Blot检测，该条带呈阳性反应。进一步证实表达正确。通过蛋白灰度扫描显示表达的融合蛋白占菌体总蛋白的20％。     

禽肠炎沙门菌外膜蛋白OMPX基因的克隆及其在乳酸乳球菌中的表达

以禽肠炎沙门菌基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增得到外膜蛋白OMPX基因片段,并将其克隆到乳酸乳球菌表达载体pMG36e中,构建重组质粒pMG36e-OMPX。将重组质粒电转入乳酸乳球菌MG1614,得到重组基因工程乳酸乳球菌,在GM17培养基中培养12h后,经SDS-PAGE分析显示表达的蛋白约为16 000,与预期相符,经Western-blot检测表明,表达的蛋白具有良好的反应特异性。     

猪白细胞介素18成熟蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

通过RT—PCR方法从用PHA和LPS刺激的猪脾脏细胞中扩增出猪白细胞介素18(pIL-18)成熟蛋白基因的cDNA，克隆到T载体pUCm-T后，序列测定表明，pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474bp，编码157个氨基酸。将该基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a构建重组质粒pETIL18m，转化大肠杆菌BL21(DE3)，并用IPTG诱导。重组菌菌体裂解物SDS—PAGE可检测到相对分子质量为19000的重组蛋白，免疫印迹法证实该重组蛋白可以与人IL-18单抗发生特异性免疫反应。     

杜氏利什曼原虫NH36基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

应用RT—PCR技术扩增并克隆杜氏利什曼原虫（Leishmania donovani）NH36编码基因，经鉴定及序列分析，构建其原核重组表达载体，经IPTG诱导表达，SDS-PAGE和Western-blotting鉴定其表达产物。结果显示，获得的NH36开放阅读框为945bp，编码314个氨基酸残基，与GenBank上发表的国际标准株NH36编码基因序列以及氨基酸序列同源性分别为88．57％（837／945）和89．17％（280／314）。表达蛋白为36ku，经1mol／L IPTG诱导6h后的表达量最高；薄层扫描显示表达的蛋白占菌体蛋白总量的57％；该蛋白可被抗杜氏利什曼原虫的多克隆抗体血清识别。     

驽巴贝虫BC-48基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

采用PCR方法扩增驽巴贝虫吉林分离株BC-48基因片段，将扩增产砌与pGEM—TEasy载体连接，重组质粒经PCR、单酶切鉴定后测序；构建BC-48的重组pGEX-4T-2表达载体．经IPTG诱导表达后，进行SDS-PAGE、Western—blotting分析。结果显示，克隆的BC-48基因片段长610bp，含有一个570bp的开放阅读框，编码189个氨基酸，与GenBank中USDA株（U46551）的同源性为96．7％；表达的融合蛋白为45ku，能被驽巴贝虫阳性血清识别；表明该融合蛋白具有较好的反应原性。     

牛结核分枝杆菌MPB70基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以牛分枝杆菌DNA为模板,克隆了牛分枝杆菌MPB70基因,构建了克隆载体pGEM-MPB70和表达载体pET30a-MPB70,经IPTG诱导在大肠杆菌BL-21中表达,用SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并进行蛋白纯化。试验结果表明,牛分枝杆菌MPB70基因体外扩增产物与预期值相符,约582 bp;所构建表达质粒pET30a-MPB70经测序,结果与预期一致;SDS-PAGE分析表明,该融合蛋白以包涵体的形式表达,其分子质量约为29 kD,蛋白表达量约占菌体总蛋白的20%;该蛋白经电洗脱纯化后,纯度达85%以上;免疫印迹分析表明,原核表达的融合蛋白可与兔抗牛分枝杆菌多克隆抗体结合,并且具特异的免疫反应性。     

河南长白猪白细胞介素18基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

为了获取河南长白猪白细胞介素18(IL-18)基因的表达产物,试验从6月龄河南长白猪脾脏分离的淋巴细胞中提取总RNA,然后进行RT-PCR扩增,对扩增产物克隆、测序后获得河南长白猪IL-18基因成熟蛋白序列。利用基因重组技术将河南长白猪IL-18成熟蛋白编码区(500 bp)定向插入原核表达载体pQE30中,构建重组表达质粒pQE-pIL-18,转化大肠杆菌M15,并用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导。结果表明:经序列分析,河南长白猪IL-18基因全长为500 bp;SDS-PAGE分析可检测到分子质量约为45 ku的重组蛋白。     

兔防御素基因NP-1的克隆及其在大肠杆菌中的表达

选用大肠杆菌偏嗜性的密码子对兔防御素基因NP-1进行改造,人工合成编码NP-1成熟肽的基因片段,并将其克隆到T-easy载体上,再经双酶切后重组于原核表达载体pMAL-p2X。经IPTG诱导后,在大肠杆菌TB1中融合表达出兔防御素NP-1成熟肽。     

牛分枝杆菌Ag85B基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以牛分枝杆菌Vallee111染色体DNA为模板．根据已发表的Ag85B成熟蛋白基因的核苷酸序列设计合成特异性引物进行PCR扩增．获得约860bp的DNA片段。通过T-A克隆技术．将PCR产物克隆至pGEM-T载体中．成功地构建出克隆载体pGEM-T-85B。以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pGEM-T-85B和pET28a（＋）．并将纯化的Ag85B基因亚克隆至pET28a（＋）中，构建出原核表达载体pET28a-85B。将pET28a-85B转化至感受态E.coli BL21（DE3）中．经IPTG诱导和SDS-PAGE分析．可见约30000的外源蛋白带。Western blot分析发现，该蛋白具有牛分枝杆菌抗原性．从而为进一步研究Ag85B的亚单位疫苗及DNA疫苗奠定了基础。     

副结核分枝杆菌map0862基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

为探索MAP0862蛋白在分枝杆菌感染鉴别诊断中的作用,研究构建了MAP0862的原核表达map0862-pET32a(+)质粒,并对其进行了诱导表达。以副结核分枝杆菌P10基因组DNA为模板,经PCR方法扩增副结核分枝杆菌map0862基因片段,将其克隆到原核表达载体pET32a(+)中。将重组子转化到大肠杆菌BL21(DE3),在E.coli中诱导表达带组氨酸标签的map0862-pET32a(+)的融合蛋白。结果显示,经IPTG诱导表达出约55 kD的融合蛋白,用副结核阳性血清进行Western blot检测,证明MAP0862重组蛋白具有良好的免疫原性。     

伪狂犬病毒EP0基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达研究

为了研究EP0蛋白在伪狂犬病毒粒子中的定位及其功能,试验利用PCR从伪狂犬病毒基因组中扩增PRV EP0基因的编码区,克隆至pMD18-T载体,构建重组质粒pMD-EP0。经测序鉴定正确后,用EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切pMD-EP0,回收EP0基因与经同样双酶切处理的pET-32a(+)进行连接,构建重组质粒pET-EP0。将pET-EP0转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE和Western blotting检测融合蛋白的表达情况及反应原性。结果表明,成功扩增得到EP0基因编码区序列,大小为1227 bp;重组表达质粒 pET-EP0经诱导后,EP0融合蛋白获得了表达,大小约为75 ku,主要以包涵体形式存在,且能与伪狂犬病毒阳性血清反应。