无乳链球菌dnaJ基因缺失株的构建及其致病性研究

为研究dnaJ基因序列与细菌致病力的关系,本研究构建了dnaJ基因缺失株和互补株,并对其致病性进行验证。参照GenBank中无乳链球菌GD201008-001（登录号：NC_018646）目的基因序列分别设计引物,PCR克隆dnaJ基因上、下游同源臂基因序列,通过融合PCR将两个片段连接到一起,构建dnaJ基因上、下游同源臂融合片段,PCR克隆含有启动子序列的dnaJ基因。将dnaJ基因上、下游同源臂融合片段和含有启动子序列的dnaJ基因分别连接链球菌-大肠杆菌穿梭质粒pSET4s和pSET2,电转化GD201008-001感受态细胞,构建dnaJ基因缺失株ΔdnaJ和互补株CΔdnaJ。通过分析ΔdnaJ和CΔdnaJ的遗传稳定性与形态学变化对dnaJ上、下游基因转录的影响,以及生长速率和斑马鱼攻毒试验评价dnaJ基因对无乳链球菌毒力的影响。经PCR鉴定和测序证明,ΔdnaJ和CΔdnaJ构建成功;与野生株GD201008-001相比,ΔdnaJ和CΔdnaJ在细菌染色形态上均无明显差异,但ΔdnaJ在液体培养基中的生长速度明显减缓;dnaJ基因的缺失未对相邻基因的转录造成影响;ΔdnaJ对斑马鱼的毒力明显下降,对斑马鱼的LD₅₀为5.68×10⁴ CFU,约是野生株的241倍。dnaJ基因对无乳链球菌的毒力有显著影响,本试验结果为进一步探究无乳链球菌dnaJ基因的功能提供了参考依据。     

乳房链球菌透明质酸合成酶基因缺失株的构建

为构建乳房链球菌(Streptococcus uberis)透明质酸合成酶(has A)基因缺失株,采用PCR方法分别扩增氯霉素抗性基因及乳房链球菌has A基因上游、下游片段并克隆到温敏自杀载体p SET4s中,构建重组载体p EST4s:has A。然后,用电转化方法将p EST4s:has A导入乳房链球菌0140J感受态细胞中,通过同源重组获得has A基因敲除突变株。PCR和酶切结果均表明has A基因已被氯霉素抗性基因替换。本研究成功构建了乳房链球菌has A基因缺失株,为进一步探讨has A基因功能及乳房链球菌的致病机理奠定基础。     

禽致病性大肠杆菌tonB基因缺失株的构建及其生物学特性研究

为了研究摄铁蛋白TonB对于禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)铁摄取能力及致病性的影响,试验采用同源重组技术构建了APEC tonB基因缺失及回复株,通过测定在正常和贫铁环境下的生长曲线、铁摄取能力等研究tonB对APEC生物学特性的影响,并通过鸡攻毒模型评价了其与APEC毒力之间的关联性。结果显示：APEC TZ18ΔtonB缺失株在正常环境中的生长速度与野生株相比没有差异,但其在贫铁环境中的生长速度显著下降(P<0.05);TZ18ΔtonB缺失株菌体内摄入的铁含量明显低于野生株;TZ18ΔtonB缺失株感染1日龄雏鸡的半数致死量(104.236)高于野生株(10^3.328),显示其毒力下降了8.1倍(P<0.05);此外,TZ18ΔtonB缺失株在21日龄SPF鸡体内心血、肝脏和肺脏中的载菌量显著低于野生株感染水平(P<0.01),而tonB基因回复株的感染水平接近野生株。结果表明：tonB参与APEC铁摄取进程并影响其毒力。     

狐肺炎大肠杆菌ybjX基因缺失株构建及其对小鼠致病性检测

为研究外膜蛋白YbjX对大肠杆菌致病作用的影响,本研究利用λ-Red同源重组系统构建了狐肺炎大肠杆菌(HBCLE-12)ybjX基因缺失突变株(HBCLEΔybjX),并对其生物学特性进行分析,探索YbjX蛋白在大肠杆菌致病过程中的作用。结果表明,缺失株HBCLEΔybjX与野生型菌株和回补菌株相比,其生长速度、生化特性无明显差异,但其运动能力和血清内存活能力显著下降,对多种抗生素的敏感性明显增强。动物试验表明,ybjX基因缺失突变株对小鼠的致病力显著下降。本研究为进一步阐释大肠杆菌致病机制和疫苗设计奠定基础。     

狐肺炎大肠杆菌yihe基因缺失株的构建及致病性

为研究YihE蛋白在狐肺炎大肠杆菌致病过程中的作用,利用λ-Red同源重组方法构建狐源大肠杆菌yihe基因缺失株,并从生长特性、生化特性、抗吞噬能力、菌株毒力等几方面对突变菌株进行评价。结果表明:与狐肺炎大肠杆菌野生型菌株相比,yihe基因缺失株生长特性和生化特性无明显差异,但其抗吞噬细胞吞噬能力以及胞内存活能力有明显下降,细菌半数致死量有显著提高。本试验成功构建狐肺炎大肠杆菌yihe基因缺失株,为研究YihE蛋白的作用机制奠定基础。     

1株致病性兔无乳链球菌的分离、鉴定与系统发育分析

从患病家兔肝、肺、脑和心血中分离到1株链状革兰阳性球菌P110323,以1×106 CFU/mL菌液灌胃感染健康家兔后,表现出站立不稳、四肢划动、惊厥和呼吸障碍等症状,感染96 h后,死亡率为60％.解剖见肺淤血、出血;肝、脾和肾肿大,坏死;大脑肿胀,脑膜充血,脑回肿胀扁平,脑沟变浅.分离菌在BHI平板上形成湿润、边缘整齐的灰白色菌落;在5％的脱纤维羊血平板上形成透明的β溶血环;V-P试验、水解精氨酸与马脲酸等为阳性;水解七叶苷和利用甘露醇、山梨醇和乳糖产酸为阴性.16S rDNA系统发育分析显示分离菌与Streptococcus difficilis和Streptococcus agalactiae聚在一簇.gyrB基因系统发育分析表明分离菌属于无乳链球菌(S.agalactiae),结合细菌形态特点和生理生化特性鉴定该病原菌为无乳链球菌(S.agalactiae),多重PCR方法确定该菌荚膜多糖类型为Ia型.     

林麝肺源致病性大肠杆菌O78株crl毒力基因缺失株的构建及其生物学特性研究

大肠杆菌Crl和Rpo S蛋白的相互作用能够直接促进curli菌毛操纵子的表达,curli菌毛对宿主细胞的黏附性及侵袭性密切相关。为研究林麝肺源致病性大肠杆菌(LPEC)O78株crl毒力基因缺失对其生物学特性和毒力特性的影响,本研究采用λ-Red同源重组的方法构建了林麝LPEC O78 crl毒力基因缺失株LPEC O78-crl-,并通过生化特性、生长速率、红细胞凝集性、毒力特性对缺失株进行鉴定。结果表明,与野生株LPEC O78相比较,LPEC O78-crl-对林麝LPEC O78的生化特性和生长速率影响差异不显著;LPEC O78-crl-的红细胞凝集效价为2~(-4),比LPEC O78降低了2倍,其LD50为3.2×10~9 cfu/m L,与野生株LPEC O78相比下降约7倍。本研究构建了林麝LPEC O78-crl-,为进一步研究林麝LPEC的致病机理奠定基础。     

禽致病性大肠杆菌唾液酸酶siaK1基因缺失株的构建及其生物学特性分析

禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)是危害养禽业发展的重要病原之一。本试验利用Red同源重组技术构建APEC IMT5155唾液酸酶基因sia K1缺失株和互补株,系统比较其生物学特性的差异。生长曲线测定表明,缺失株比野生株和互补株生长速度加快,而野生株和互补株的生长速度无明显差异;生物被膜形成能力测定表明,sia K1缺失导致细菌生物被膜形成能力显著减弱,而互补株可恢复至野生株水平,说明sia K1基因缺失可影响禽致病性大肠杆菌的生长速度及生物被膜的形成。本研究为进一步探讨sia K1基因功能奠定了基础。     

MDV Meq基因簇miRNAs基因缺失株的致病性

为了探讨Meq基因簇microRNAs(Meq-clustered miRNAs)对马立克氏病病毒(Mareks disease virus,MDV)致病性的影响,本研究将MDV Meq-clustered miRNAs基因缺失株GX0101ΔMeq-miRNAs感染1日龄SPF鸡,并于感染后90d内进行毒株致死率、致肿瘤率、鸡体质量、免疫器官指数和鸡血液中病毒含量等方面的检测。结果显示:1日龄SPF鸡在接种GX0101ΔMeq-miRNAs后90d内累计死亡率和眼观肿瘤发生率分别为4%和8%,与亲本株GX0101BAC相比分别下降了23.5倍和2.5倍;与鸡胚成纤维细胞(chicken fibroblast cells,CEF)阴性对照相比,GX0101△Meq-miRNAs感染鸡在整个试验期间体质量差异均不显著(P0.05);在感染后14~21d,GX0101△Meq-miRNAs组的法氏囊指数和胸腺指数均显著降低(P0.05);与亲本株相比,GX0101△Meq-miRNAs在血液中的含量及导致的显微肿瘤发生率均下降。结果表明:MDV Meq-clustered miRNAs基因的缺失降低了MDV的致病性,Meq-clustered miRNAs具有调控MDV致病性的功能。     

无乳链球菌耐药性及耐药基因检测

为了解昆明地区奶牛隐性乳房炎无乳链球菌分离株对常用抗生素的耐药性及耐药基因携带情况,采集昆明某地区隐性乳房炎患牛乳样71份检测。结果显示,分离到的15株无乳链球菌,对青霉素类、红霉素、林可胺类等抗生素存在不同程度的耐药现象,多重耐药现象也比较严重,分离菌共出现10种耐药谱,其中7耐和8耐的占有60%。对青霉素严重耐药,其耐药率达到了100%。其中,PCR扩增β-内酰胺类和大环内酯类耐药基因,结果显示,15株无乳链球菌均含有pbp1a、pbp2b、erm B基因,表明,本地区不能继续使用青霉素等药物来治疗奶牛乳房炎,应选择敏感性的药物,如头孢类抗生素等。同时应合理交叉用药,以防细菌产生耐药性。本试验为昆明地区无乳链球菌引起的隐性奶牛乳房炎的防治提供了一定的依据。     

禽致病性大肠杆菌luxS和rbsC双基因缺失株的构建及其生物特性分析

禽致病性大肠杆菌(APEC)能引起家禽严重的呼吸系统和全身性疾病,由于APEC耐药菌株的不断出现迫使新型抗菌方式的研发迫在眉睫.本研究旨在评价APEC的luxS和rbsC双缺失的突变株作为减毒疫苗候选株的潜力,通过在APEC分离株DE17的单基因缺失株DE17ΔluxS的基础上,利用Red重组系统构建双基因缺失株DE1...     

副鸡禽杆菌毒力质粒缺失株的构建及其致病性的研究

为研究副鸡禽杆菌(APG)质粒与菌株致病力的关系,本研究采用42℃诱导的方法缺失APG分离株APG-Hu中的毒力质粒,经PCR鉴定质粒缺失菌株后将其命名为APG-HuΔ。分别采用分光光度计测定OD600nm值法、微量生化鉴定管法、K-B纸片法和雏鸡感染试验测定APG-HuΔ的生长曲线、生化特性、药物敏感性和对雏鸡的致病性。结果显示,在42℃诱导条件下,能够有效缺失APG-Hu中的毒力质粒p250和p A14,而质粒p YMH5未被缺失;APG-HuΔ生化特性、生长曲线及耐药性与APG-Hu相比均无明显差异。雏鸡感染试验结果显示,多数APG-HuΔ感染鸡无明显临床症状,总体发病情况明显弱于同等剂量APG-Hu感染的鸡,表明APG-HuΔ毒力显著降低。本研究结果表明,APG毒力与质粒p250和p A14相关,而质粒p YMH5可能增加APG耐受多种抗生素的风险。本研究为APG致病机理及耐药机制研究奠定基础,也为挖掘APG质粒的应用潜力提供一定参考。     

奶牛无乳链球菌内蒙古分离株SIP基因的克隆与序列分析

试验根据GenBank 公布的牛源无乳链球菌SIP基因序列设计并合成1对引物,通过PCR 扩增获得SIP基因部分扩增产物.序列分析结果表明:SIP基因扩增产物大小为945 bp,编码315个氨基酸残基.标准菌株(+株)与内蒙古分离株(M株)的基因及氨基酸同源性为100%,这2个菌株与GenBank上公布的B群无乳链球菌菌株(DQ914274)SIP基因及氨基酸同源性达到98.94%及99.68%.     

无乳链球菌研究进展

无乳链球菌(S.agalactiae)是一种引起人畜及水产动物发病和死亡的重要病原菌,本研究对无乳链球菌的分离鉴定、致病性、致病因子、血清型、遗传相关性、耐药性及耐药机制及疫苗研制等方面进行了综述,同时对无乳链球菌未来研究方向和研究前景进行了展望,以期为今后研制有效的药物及疫苗,更好地防范、治疗无乳链球菌性疾病提供理论基础。     

禽致病性大肠杆菌clpV2基因缺失株的构建及生物学特性分析

旨在研究六型分泌系统2（type VI secretion system 2,T6SS2）clpV2基因对禽致病性大肠杆菌（avian pathogenic Escherichia coli,APEC） TW-XM菌株生物学特性的影响。本研究利用Red同源重组构建clpV2基因缺失株,将clpV2基因克隆到表达载体pBR322中,成功构建回补株。对突变株的部分生物学特性进行分析。结果显示：各突变株均能稳定遗传,且clpV2基因的缺失不影响TW-XM菌株的生长速度以及对多种抗生素的敏感性,但会导致其运动能力和生物被膜形成能力显著下降。综上表明,clpV2基因的缺失会影响TW-XM菌株的部分生物学特性,为进一步研究clpV2基因的功能和APEC的致病机制奠定基础。     

禽致病性大肠杆菌Ⅵ型分泌系统2evfC基因缺失株的构建及其生物学特性分析

为了分析VI型分泌系统2(Type VI secretion system2,T6SS2)核心组分Evf C对禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)生物学特性及致病性的影响,本研究采用Red同源重组系统构建APEC evf C基因缺失株,并利用低拷贝质粒p STV28构建互补株。然后比较分析野生株、缺失株与互补株的生长曲线、运动性、生物被膜形成能力、黏附侵袭能力、胞内存活能力、动物致病力等生物学特性差异。结果表明,evf C基因缺失不影响APEC的生长速度、运动性、生物被膜形成能力、黏附侵袭能力。然而,缺失evf C可导致APEC在HD-11胞内存活能力及对雏鸭的致病力降低。本研究为阐述APEC T6SS2的致病作用提供了参考依据。     

肠炎沙门氏菌tu-fA基因缺失株的构建及其生物学特性研究

为构建肠炎沙门氏菌(S.enterica)tu-fA基因缺失株及鉴定其生物学特性,本实验利用Red重组系统,以pKD3中的FRT-氯霉素抗性(cat~r)基因-FRT序列为模板,利用含有tu-fA基因两端序列的引物,经PCR扩增同源重组DNA片段(tu-fA5'-FRT-cat~r-FRT-tu-fA3'),将该DNA片段电转化于含有质粒pKD46的S.enterica SM6株中进行同源重组,通过氯霉素抗性筛选tu-fA基因缺失的SM6株(SM6△tu-f A::cat),再通过导入质粒pCP20于SM6△tu-fA::cat中敲除cat r基因,从而构建了tu-fA基因缺失株SM6△tu-fA。生物学特性鉴定结果表明,基因缺失株具有良好的遗传稳定性;与亲本株相比,细菌形态未发生明显改变,但基因缺失株体外生长速率略低,利用碳源的能力有所增强;缺失株侵袭Caco-2细胞的能力与亲本株相比有所降低,表明tu-f A基因编码的延伸因子(EF-Tu)在调控细菌侵袭细胞的过程中起着一定的作用。本研究通过构建tu-fA基因缺失的S.enterica株,为进一步研究tu-fA基因编码的EF-Tu的功能奠定基础。     

柳州地区罗非鱼无乳链球菌与海豚链球菌分离株药敏性分析

为了解柳州地区罗非鱼链球菌的耐药性情况,本研究对从柳州地区分离得到无乳链球菌和海豚链球菌分离株进行药敏试验。结果显示,无乳链球菌与海豚链球菌之间的药敏结果有较大差异,而同一种细菌的不同菌株对药物的敏感性却较为一致。总体来说,两种菌对青霉素、头孢类药物均具有很高的敏感性,对喹诺酮类药物敏感性不高;无乳链球菌对多粘菌素B、复方新诺明、卡那霉素、磺胺异噁唑4种药物完全耐药,但海豚链球菌却对这些药物呈现不同程度的敏感性。     

猪链球菌2型调控因子Rex缺失株的构建及其致病性鉴定

为鉴定猪链球菌2型强毒株SS2-1调控因子Rex基因的缺失对细菌毒力的影响,本研究利用同源重组方法构建猪链球菌Rex缺失株,命名为SS2-1△Rex,并通过缺失株的生物学特性及其小鼠致病性试验进行鉴定。结果显示亲本株、缺失株及互补株在溶血能力、增殖特性和革兰染色形态无显著差异;在对小鼠致病性试验中,接种SS2-1组小鼠死亡率为87.5%,而SS2-1△Rex组死亡率为12.5%,SS2-1△Rex/p Rex对小鼠的毒力有所恢复,死亡率为50%;Log-Rank(Mantel-Cox)对数秩检验分析结果显示亲本株和缺失株对小鼠致病性存在显著差异。本研究结果表明调节因子Rex是猪链球菌2型的毒力相关因子。本实验为深入研究Rex调控毒力因子的转录和表达及其具体的机制奠定了实验基础。     

禽致病性大肠杆菌clpV基因缺失株的构建及其对Ⅰ型菌毛主要基因表达的影响

为研究禽致病性大肠杆菌(APEC)六型分泌系统(typeⅥsecretion system,T6SS) clpV基因对Ⅰ型菌毛表达的影响,本研究利用Red同源重组系统构建了禽致病性大肠杆菌clpV基因缺失株TW-XM△clpV.将clpV基因克隆到表达载体pBR322中,构建相应回补株TW-XMC△clpV.通过PCR...