猪SMYD3基因的克隆、序列分析及其对猪成纤维细胞增殖的影响

试验旨在克隆猪SMYD3(SET and MYND domain-containing protein 3)基因并对其进行序列分析,研究其对猪成纤维细胞增殖的影响。首先克隆猪SMYD3基因,根据其他物种SMYD3基因siRNA和shRNA序列,经同源性比对分析,获得两条猪SMYD3基因shRNA序列,分别构建pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA1/shRNA2表达载体,转染HEK293T细胞,利用实时荧光定量PCR分析干扰效率,筛选出抑制效率较好的shRNA,并构建pLVX-IRES-ZsGreen1-SMYD3及pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA真核表达载体,同时分析SMYD3基因对猪成纤维细胞的增殖作用,检测细胞Nanog、DNMT1及DNMT3a基因表达情况。结果显示,试验克隆得到1 404 bp的猪SMYD3基因编码区序列,生物信息学分析发现,德保猪SMYD3基因与野猪、山羊和野耗牛相应氨基酸序列的同源性分别为99.5%、93.8%和92.9%。shRNA1/shRNA2均能显著抑制SMYD3基因表达(P<0.05),抑制效果分别是34%和54%,选择pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA2进行后续研究。通过脂质体转染法将构建的pLVX-IRES-ZsGreen1-SMYD3及pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA真核表达载体导入HEK293T细胞,均可观察到清晰的绿色荧光。慢病毒感染细胞及实时荧光定量PCR结果显示,与空白对照组及阴性对照组相比,过表达SMYD3基因促进猪成纤维细胞增殖,Nanog和DNMT1基因表达显著升高(P<0.05);抑制SMYD3基因表达,细胞增殖受到抑制,Nanog、DNMT1、DNMT3a基因表达显著降低((P<0.05),说明SMYD3基因的表达与猪成纤维细胞的增殖显著相关。     

杜大长猪IGF-I基因的克隆及其序列分析

采用ＴＲＩzol法从杜大长杂交猪的肝脏中提出总ＲＮＡ,将其纯化后作为ＰＣＲ扩增模板 ,以设计的Ｐ１（５′－ＣＴＡＣＡＴＴＣＴＧＴＡＧＴＴＣＴＴＧＴＴＴＣＣ－３′）为引物合成ＩＧＦ－Ｉ基因cＤＮＡ的第１链,再以Ｐ１和Ｐ２（５′－ＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴＴＧＣＴＣＴＣＣＴＴ－３′）为引物扩增到大小约为３６０bp的产和,并将其达隆至pＧＥＭ－Ｔ载体上。经筛选、酶切、我分析,表明该片段为ＩＧＦ－Ｉ基因的cＤＮＡ     

猪白介素-18基因的克隆及其序列分析

通过对猪PBMC刺激诱导，提取总RNA，然后采用RT-PCR技术克隆了猪白介素-18(plL-18)基因。序列分析结果表明，克隆的plL-18基因序列与GenBank上登录的plL-18基因序列完全一致，与其他各物种的IL-18基因间具有较大的种属差异性。该基因在国内的成功克隆为IL-18的进一步研究和开发奠定了基础。     

猪Lbx2基因的克隆、序列分析及表达

试验利用PCR扩增猪Lbx2基因组序列,通过克隆测序寻找基因中的突变位点,采用半定量RT-PCR分析猪不同组织中Lbx2基因的表达情况。结果显示,Lbx2基因在肝脏、肾脏和脾脏中微弱表达,在肌肉组织中不表达;通过比较不同物种氨基酸序列,结果发现猪Lbx2与牛、猩猩、犬进化关系较近;此外,在猪Lbx2基因组中发现5处突变位点,其中1个缺失突变(缺失11 bp)位于基因启动子区,另外4个单核苷酸突变分别位于第1外显子和内含子中。该试验结果为下一步Lbx2基因的功能研究奠定了基础。     

猪DDX1基因的克隆、序列分析及表达

根据已知人、小鼠、牛、鸡、犬和恒河猴等物种的DEAD-box解旋酶1(DEAD-box helicase 1,DDX1)基因mRNA序列设计引物,从猪肾传代细胞系(PK-15)中克隆DDX1基因编码区(CDs)序列,对该基因进行生物信息学分析、组织表达谱分析。进一步将猪DDX1基因CDs序列克隆至真核表达载体pCMV-Tag2B,构建的重组真核表达质粒转染PK-15细胞后运用Western blot和间接免疫荧光试验检测DDX1基因的真核表达。结果显示:成功克隆了猪DDX1基因的cDNA序列(GenBank登录号为KU522467),其开放读码框全长为2 223bp,编码740个氨基酸;与牛、鸡、黑猩猩、犬、人、小鼠、大鼠和恒河猴的氨基酸序列同源性分别为98.8%、93.5%、97.6%、98.8%、97.7%、97.0%、97.6%和97.8%。表达谱分析表明,猪DDX1mRNA在不同组织中的表达水平存在差异,表现为脂肪、肝脏和脾脏中高表达,而在胃、心脏和肌肉中表达较低。成功构建了猪DDX1基因真核表达质粒,经证实目的基因可以在真核细胞中特异性表达,且表达的DDX1蛋白主要定位于细胞质中,少量定位于细胞核中。结果表明:本试验克隆了猪DDX1基因的序列,分析了其在不同组织的表达规律,并构建了DDX1基因重组表达质粒,为该基因下一步的功能学研究奠定了基础。     

猪Toll样受体9基因的克隆、序列分析及其结构预测

本研究应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增技术,从猪脾脏淋巴细胞中,克隆了猪Toll样受体9基因(pTLR9).基因序列分析表明,克隆的pTLR9基因ORF为3 093 bp,编码1 030个氨基酸,含18.5%的亮氨酸,含有24个氨基酸的信号肤序列,属于Ⅰ型跨膜受体,具有富含亮氨酸的重复序列(LRR)和Toll/IL-1R同源区结构域;与GenBank上登载的pTLR9参考序列(AY859728)的同源性为99.3%,与牛、马、羊和人的同源性较高,与家鼠、褐鼠的次之,TLR9的演化关系与亲缘关系密切.     

猪ERK6基因3′UTR的克隆及序列分析

为了给猪ERK6基因的功能研究提供信息资料,试验以已报道的猪ERK6基因CDS序列为模板设计引物,利用RACE技术扩增了猪ERK6基因3′UTR序列,并采用DNAMAN、DNASTAR及CLUSTALW2软件分析序列特征。结果表明:分离的产物共827bp,包含部分编码区281bp、3′UTR序列439bp、poly(A)60、接头引物47bp,将前三部分序列共780bp上传至GenBank,登录号为NM_001025224;此序列poly(A)60位点上游14个核苷酸处有CPSF结合位点,与人、鼠3′UTR序列的相似性为41%、48%。说明分离获得的片段为猪ERK6基因的3′UTR序列。     

猪PLEl基因启动子克隆及序列分析

通过巢式PCR方法获得猪PI。E1基因5’端上游启动子序列,通过T／A克隆法对PI。E1基因的启动子进行克隆,并对PCR鉴定为阳性的克隆子进行测序,参考人、啮齿类的羧酸酯酶家族的启动子结构,并利用启动子在线分析软件对其进行生物信息学分析。结果成功克隆得到PI。E1基因5’端上游1153bp的调控片段,分析表明该调控区没有CpG岛,也不存在典型的TATA盒结构;有2个转录起始位点分别位于翻译起始密码子ATG上游-39bp和-37bp处,潜在的转录因子结合位点有C／EBP、Spl、USF、CdxA、GATA-X、GATA-1、GATA-2、GATA-3、MZFl、AML-la、SRY、Nkx-2、LyLl、deltaE等。另外还发现了7种基序分别为EGF-1、INTEGRINBETA、CTCKl、ANA—PHYIJATOXIN-1、THIOLASE-3、TUBUI,IN、VWFC-1。研究结果可为进-步揭示PLEl基因转录调控机制提供理论参考。     

猪Toll样受体3、7和8基因的克隆与序列分析

为了对猪Toll样受体(TLR)3、7和8基因进行克隆与序列分析,本实验从猪肺泡巨噬细胞(PAM)中,利用RT-PCR方法分片段扩增猪TLR3、7、8基因,并克隆于pMD18-T载体中。根据测序结果分析,猪TLR3、7和8基因的ORF分别为2718bp、3153bp和3087bp,并分别编码906、1051和1029个氨基酸。同源性分析结果显示,它们与GenBank中登录的猪TLR的相应序列同源性达99%以上;与牛、马、羊和人的同源性较高,与鼠的同源性次之,与鸡的同源性最低,其蛋白分子结构预测表明猪TLR3、7、8均为跨膜蛋白。     

猪MAP3K5基因CDS序列克隆及生物信息学分析

试验克隆了猪MAP3K5基因cDNA序列,分析了猪MAP3K5基因与MAP3K家族及其他物种MAP3K5基因的序列同源性,并研究了其保守结合域。通过RACE-PCR扩增获得猪MAP3K5基因5 452 bp的序列,并分析其可能的开放阅读框及预测蛋白序列,获得了MAP3K5基因31个外显子结构。通过比对发现,猪MAP3K5基因与MAP3K家族其他成员的mRNA及蛋白质序列的同源性较低,均在50%以下,其中猪MAP3K5与MAP3K6基因序列的同源性相对较高;猪MAP3K5基因与其他物种的MAP3K5基因的mRNA及蛋白质序列的同源性较高,均在78%以上,其中猪MAP3K5基因与牛、绵羊、犬和人的MAP3K5基因序列的同源性较高。对与猪MAP3K5序列同源性更高的蛋白质进行保守结构域分析,发现MAP3K6与MAP3K5的保守域和结合位点类似,其他MAP3K家族成员与MAP3K5的结构域差别较大;而其他物种的MAP3K5与猪MAP3K5相比保守结构域和结合位点相似。结果初步表明了猪MAP3K5序列和结构域特点,可为后续MAP3K5基因的功能研究奠定基础。     

荷包猪SLA-DRa基因的克隆及序列分析

为研究中国特色品系荷包猪SLA-DRa基因(又称SLA-DRa-HB),本试验设计引物,RT-PCR扩增3个个体荷包猪SLA-DRa全基因编码区,并克隆至pMD18-T载体,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,经酶切鉴定后筛选阳性克隆测序,比较分析与其他SLA-DRa等位基因的差异,并绘制分子进化树。结果显示,RT-PCR成功扩增出目的基因条带,大小约800bp。经克隆测序后分析,SLA-DRa-HB基因全长为779bp,编码区为1—759,共编码252个氨基酸。序列对比分析结果显示,SLA-DRa-HB的特征性变异集中在135、159、202位点。而穿膜区和胞浆功能区(203—252)变异位点为206、248。分子进化树分析显示,SLA-DRa-HB自成一系,且与其他等位基因的进化关系较近。本研究成功克隆荷包猪SLA-DRa基因,为进一步研究其功能奠定基础。     

陆川猪瘦素基因的克隆及序列分析

为了研究广西陆川猪瘦素(Leptin)基因编码区序列(CDS)的组成,并为下一步开展Leptin基因表达与陆川猪优质肉质形成的相关性研究提供科学理论依据,试验以11月龄陆川猪背最长肌总RNA为模板,根据Gen Bank中已公布的猪Leptin基因序列(登录号为GQ268936)设计1对PCR引物,利用RT-PCR方法扩增Leptin基因c DNA序列,扩增得到的目的片段经过纯化、连接p MD 18-T载体,然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并测定序列,应用PMP生物分析软件进行蛋白质二级结构预测分析。结果表明:成功克隆获得陆川猪Leptin基因编码区长504 bp,与Gen Bank公布的巴马小型猪的基因同源性为99.2%,与藏猪的基因同源性为99.0%;陆川猪Leptin基因CDS与其他猪种相比,存在第73位点的T→C,碱基C为陆川猪所特有,导致色氨酸突变为精氨酸。由Leptin基因系统进化树构建结果可知,广西陆川猪与藏猪的遗传距离最近,其次是弓头鲸,最远是小鼠;陆川猪Leptin蛋白质二级结构包含有4个α-螺旋和2个β-折叠。说明Leptin基因可作为研究陆川猪脂肪沉积的主要候选基因之一。     

猪IFN-γ基因的克隆与序列分析

猪IFN-γ具有强烈的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用，作为生物药荆和疫苗佐剂具有广阔的应用前景。通过对猪PBMC刺激诱导，提取总RNA，然后采用RT—PCR技术成功克隆了猪IFN-γ基因。序列分析表明，克隆到的基因序列与NCBI GenBank上登载的猪IFN-γ基因序列完全一致。该基因的成功克隆为IFN-γ的进一步研究和开发奠定了基础。     

猪PGAM2基因的克隆、序列特征及表达分析

克隆了猪PGAM2基因的cDNA序列,并利用生物信息学方法进行分析。所得cDNA序列全长913 bp,包含1个完整的开放阅读框,编码253个氨基酸。序列分析表明,该基因预测编码蛋白与已报道的狗（97.6%）、人（96%）、黑猩猩（96%）、大鼠（94.5）和小鼠（94.1%）等物种的PGAM2蛋白高度同源其在N端和C端分别存在1个ATHR和QGKA模体,在14~15AA处存在1个信号肽切割位点,含有1个典型的碳水化合物运输和代谢（GPMA）保守结构域。该基因在猪胚胎骨骼肌发育过程中差异表达,且在通城猪和长白猪中呈现不同表达模式。在通城猪中,PGAM2基因呈波浪式表达,即妊娠65 d时表达水平最高,且各时间点表达水平差异极显著（P〈0.01）。在长白猪中呈上调表达模式,妊娠65和90 d时表达丰富,且极显著高于妊娠33 d（P〈0.01）。品种间比较来看,在妊娠33和65 d时两品种表达水平相当,但妊娠90 d时长白猪中的表达水平极显著高于通城猪（P=0.006）。     

猪IL-2基因的克隆、序列分析及其杆状病毒表达载体的构建

参照GenBank发表的猪IL-2 cDNA基因序列设计1对引物,将猪脾淋巴细胞在伴刀豆球蛋白A(Con A)的刺激下体外培养27 h后,提取激活淋巴细胞总RNA,进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,克隆到pGEM-TEasy载体上并测序.测序结果显示,克隆的猪IL-2 cDNA全长为516 bp,开放阅读框(ORF)包含465 bp,编码154个氨基酸,相对分子质量为17 400,等电点为5.27,此cDNA与已报道的猪IL-2同源性为100%.与猫、牛、鸡、犬、鸭、山羊、马、人、家鼠等的IL-2基因进行比较分析,核苷酸同源性分别为83.7%、82.6%、28.2%、80.6%、29.6%、83.4%、81.3%、82.0%和61.5%.将此IL-2基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDual后获得了重组质粒pFBD-IL2,进而转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,发生转座作用;经抗性及蓝白斑筛选得到了含猪IL-2基因的重组DNA,将其命名为Bacmid-IL2.本试验为进一步在昆虫细胞中表达猪IL-2基因、开发研制新型免疫佐剂奠定了基础.     

香猪SRY基因的克隆及序列分析

试验参照猪SRY基因保守序列设计了1对引物,对香猪基因组DNA进行PCR扩增。将扩增产物通过T—A互补法克隆到质粒pGEM—T载体中,筛选阳性克隆进行DNA测序。测序结果显示,香猪SRY基因开放阅读框全长627bp,编码227个氨基酸。其中核心区域HMG—box长237bp,并且编码79个氨基酸。与白鲸、人、牛、绵羊4种哺乳动物的SRY基因序列相比较,香猪和白鲸的SRY序列具有较高的相似性,相似度达82．1％。序列相似性和邻接法聚类树的结果均显示,在SRY基因中香猪和白鲸有着较近的亲缘关系,表明以白鲸为代表的鲸目和以香猪为代表的偶蹄目有较近的亲缘关系。     

芒硝对驴皮成纤维细胞增殖、凋亡的影响

为研究不同浓度的芒硝对体外培养的驴皮成纤维细胞增殖、凋亡的影响,本试验采用组织块法体外培养驴皮成纤维细胞,并用HE、Masson染色鉴定;再添加高（2 000、1 500 μg/mL）、中（1 000、500、250 μg/mL）和低浓度（100、50、10 μg/mL）芒硝体外培养驴皮成纤维细胞,用MTT和Caspase-3法分别检测成纤维细胞增殖率和凋亡率;最后用实时荧光定量PCR、ELISA法检测不同浓度（1 500、250、10 μg/mL）芒硝培养液中影响驴皮成纤维细胞胶原蛋白合成的相关基因表达量及蛋白浓度。结果显示,培养5 d时,驴皮成纤维细胞开始从组织块边缘爬出,25 d后长满培养皿;HE染色呈典型的梭形,驴皮成纤维细胞中胶原纤维经Masson染色呈蓝色。中浓度芒硝培养液组成纤维细胞的增殖率显著高于高、低浓度组（P<0.05）,相应地,中浓度组的凋亡因子Caspase-3活性显著低于其他两组（P<0.05）。相比于24 h,芒硝作用于成纤维细胞48 h能显著提高胶原蛋白合成相关基因的表达量（P<0.05）,250 μg/mL浓度的效果最佳。综合上述结果,组织块培养法易于分离培养驴皮成纤维细胞,250 μg/mL浓度的芒硝在48 h能显著提高驴皮成纤维细胞的增殖率及其胶原蛋白合成相关基因的表达量,此结果可为芒硝促进驴皮成纤维细胞的增殖作用以及驴皮伤口愈合机制的研究提供理论依据。     

芒硝对驴皮成纤维细胞增殖、凋亡的影响

为研究不同浓度的芒硝对体外培养的驴皮成纤维细胞增殖、凋亡的影响,本试验采用组织块法体外培养驴皮成纤维细胞,并用HE、Masson染色鉴定;再添加高(2 000、1 500μg/mL)、中(1 000、500、250μg/mL)和低浓度(100、50、10μg/mL)芒硝体外培养驴皮成纤维细胞,用MTT和Caspase-3法分别检测成纤维细胞增殖率和凋亡率;最后用实时荧光定量PCR、ELISA法检测不同浓度(1 500、250、10μg/mL)芒硝培养液中影响驴皮成纤维细胞胶原蛋白合成的相关基因表达量及蛋白浓度。结果显示,培养5 d时,驴皮成纤维细胞开始从组织块边缘爬出,25 d后长满培养皿;HE染色呈典型的梭形,驴皮成纤维细胞中胶原纤维经Masson染色呈蓝色。中浓度芒硝培养液组成纤维细胞的增殖率显著高于高、低浓度组(P0.05),相应地,中浓度组的凋亡因子Caspase-3活性显著低于其他两组(P0.05)。相比于24 h,芒硝作用于成纤维细胞48 h能显著提高胶原蛋白合成相关基因的表达量(P0.05),250μg/mL浓度的效果最佳。综合上述结果,组织块培养法易于分离培养驴皮成纤维细胞,250μg/mL浓度的芒硝在48 h能显著提高驴皮成纤维细胞的增殖率及其胶原蛋白合成相关基因的表达量,此结果可为芒硝促进驴皮成纤维细胞的增殖作用以及驴皮伤口愈合机制的研究提供理论依据。     

猪Lmbr1基因部分cDNA序列的克隆及序列分析

利用RT—PCR和RACE方法克隆了正常猪和全同胞多趾猪Lmbr1基因部分cDNA序列并进行了序列分析。结果表明,正常猪该序列长1797bp,其中CDS序列1178bp,3’UTR序列619bp。全同胞多趾猪该序列长1069bp,其中CDS序列768bp,3’UTR序列301bp。正常猪与多趾猪Lmbr1基因的CDS序列相似性近77％,而3’UTR序列相似性不足20％。两者的CDS序列在755～768bp间,共发生13个核苷酸突变：G755C、A756T、A757G、T758C、C759A、A760G、C761T、T762G、A763C、G764T、A765G、T767G、T768A。其中,前11个突变属于错义突变,导致相应的氨基酸序列中4个氨基酸发生变化：G突变为A、I突变为A、T突变为V、R突变为L;后2个突变属于无义突变,导致阅读框提前终止。猪Lmbrl基因发生突变能引起SHH的异常表达,这可能是导致猪多趾发生的根本原因。