鸡传染性喉气管炎病毒可视化LAMP快速诊断方法的建立和应用

试验旨在建立简易、快速、高效的鸡传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus,ILTV)检测和诊断方法。根据GenBank上公布的ILTV TK基因序列,设计检测ILTV的特异性环介导的等温扩增(loop media-ted isothermal amplification,LAMP)技术反应引物,通过对LAMP反应体系和反应条件的优化,以及特异性、敏感性和临床样品的检测,建立了ILTV LAMP检测方法。结果显示,以内引物ILT9-FIP和ILT9-BIP、外引物ILT9-F3和ILT9-B3、环引物ILT9-LB和ILT9-LF为LAMP反应引物,反应温度为66℃时,所建立的LAMP检测方法反应效率最高;所建立的LAMP检测方法能够特异性地检测ILTV(匈牙利株和王岗株),不与新城疫病毒(NDV,B株)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV,H52株和H120株)、大肠杆菌、鸡副嗜血杆菌、巴氏杆菌等发生交叉反应,且能够检测到的病毒最低浓度达到0.06pg/μL,其灵敏度是普通PCR方法的100倍;采用建立LAMP方法对50个临床样本进行检测,阳性率为14%,且与PCR检测结果的符合率达96%。本研究建立了特异性强、灵敏度高、操作简单的LAMP检测方法,适用于临床上ILTV的快速检测和诊断。     

鸡传染性喉气管炎病毒PCR诊断方法的建立与应用

根据GenBank登录的传染性喉气管炎病毒(ILTV)的TK基因序列设计并合成1对特异性引物,以ILTV疫苗株DNA为模板,建立了检测ILTV TK基因的PCR方法。应用该方法能从临床分离毒株和疫苗株中扩增到长为427 bp的目的片段;但不能从新城疫病毒(NDV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、禽呼肠孤病毒(ARV)、减蛋综合征病毒(EDSV)、H9亚型禽流感病毒(H9-AIV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌等病原中扩增出阳性条带;敏感性试验表明其DNA最小检出量为4.9 ng;应用该方法和病毒分离法对2份临床病例和人工感染鸡的检测,两者符合率为100%。上述结果表明该PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可用于传染性喉气管炎病毒鉴定和临床诊断。     

2种鸡免疫抑制性疾病LAMP检测方法的建立

本文借助环介导等温扩增技术(LAMP),建立了两种常见鸡免疫抑制病的(鸡传染性贫血病、J亚群白血病)的快速检测方法。采用简易法提取DNA模板,设计特异性LAMP引物,成功扩增出梯形条带,并且对反应体系进行优化,以及特异性试验和灵敏度试验。结果表明LAMP的灵敏度可达10个拷贝,比PCR灵敏度高10倍;且具有特异性,对其他相关鸡病病原检测结果均为阴性。用建立的LAMP方法对临床样品进行检测,同时与PCR方法比较,结果表明LAMP结果基本与PCR相符,但检测的阳性率要比PCR高。操作简便,无需昂贵设备,适用于临床快速诊断。     

副鸡禽杆菌LAMP检测方法的建立

应用环介导等温扩增(LAMP)技术建立了快速特异的检测副鸡禽杆菌的方法。利用在线引物设计软件Primer Explorer Version 4.0,针对副鸡禽杆菌16SRNA基因序列设计两组LAMP引物,并对副鸡禽杆菌特异性DNA的扩增条件进行优化,评价所建立LAMP的特异性和灵敏性。结果显示,优化后的反应条件为65℃恒温反应60min,内引物1.60pmol/μL、外引物0.20pmol/μL。该LAMP对13株副鸡禽杆菌均发生了扩增反应,而对大肠埃希菌、禽多杀性巴氏杆菌、空肠弯曲杆菌等14株其他病原微生物没有扩增反应;该LAMP最低检出量为0.17pg/反应,敏感性远高于常规PCR的56pg/反应。结果表明,所建立的副鸡禽杆菌LAMP具有快速、高效、方便操作等特点,适用于基层兽医部门进行副鸡禽杆菌的快速检测。     

鸡传染性喉气管炎病毒PCR诊断方法的建立与研究

根据GenBank注册发表的传染性喉气管炎病毒（ILTV）的TK基因序列,设计并筛选出1对引物扩增ILTV TK基因片段长为400 bp。以ILTV疫苗株的DNA为模板,进行特异性和灵敏性试验,结果该对引物检测ILTV DNA的最小检测量为1.15 ng,与NDV、H5和H9亚型AIV、IBV灭活抗原、大肠杆菌、沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌等抗原无交叉反应。用所建立的方法对发病禽场进行临床检测,结果与病毒分离和动物回归试验结果相一致。结果表明本研究建立了传染性喉气管炎PCR检测方法,并可应用于临床检测和诊断。     

H1N1猪流感病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立

目的:建立H1N1猪流感病毒环介导等温扩增(LAMP)快速检测方法。方法:从GenBank中获得H1N1猪流感病毒血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)基因序列,应用DNAStar软件MegAlign程序分析其序列,利用Primer ExplorerV4软件在序列保守区域设计LAMP引物,即外引物和内引物,同时以H1N1猪流感病毒的cDNA作为阳性模板,对试验中的几个反应条件进行优化。结果:LAMP检测方法对H1N1猪流感病毒的灵敏度达到4～6个拷贝,其引物对于H9亚型禽流感病毒、猪瘟病毒和猪圆环病毒均无非特异性扩增,表现出良好的特异性。结论:建立的H1N1猪流感病毒环介导等温扩增快速检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,为快速检测猪流感病毒提供了新方法和新思路。     

鸡传染性喉气管炎病毒PCR检测方式的建立和应用

根据GenBank传染性喉气管炎病毒(ILTV)基因序列,设计合成了1对特异性引物。以ILTV DNA为模板,建立了检测ILTV的PCR检测方法。通过优化PCR反应条件,成功扩增出一条约690 bp的目的基因片段。而鸡传染性法氏囊病病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感病毒基因组均未扩增为出相应的片段。敏感性试验检测出其DNA最小检出量为10-2μg。重复性试验中对3份检测为传染性喉气管炎病毒阳性病料进行检测,发现3次重复检测的结果完全一致。临床应用中运用上述优化的PCR反应条件进行PCR检测临床送检的16份疑似鸡传染性喉气管炎病毒感染病料,结果显示检出阳性样品6份,将阳性样品的PCR扩增产物克隆后序列分析显示均为鸡传染性喉气管炎病毒。结果表明,建立的PCR方法具有良好的特异性,敏感性和稳定性,可应用于传染性喉气管炎病毒鉴定和临床诊断。     

环介导等温扩增技术快速检测猪流行性腹泻病毒

为建立一种快速、灵敏的检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,本研究针对PEDV的NP基因设计LAMP引物,对反应体系优化并进行特异性及敏感性等试验.结果表明,该方法在65℃下恒温扩增60 min,经SYBR Green Ⅰ染色后仅肉眼观察即可判定结果.该方法特异性好,与传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒及大肠杆菌等无交叉反应,对重组质粒最低检测限度为16拷贝/μL,灵敏度高于普通PCR.该LAMP检测方法特异性强,灵敏度高,操作方便,适于临床检测PEDV.     

荧光定量RT-PCR检测鸡传染性支气管炎病毒方法的建立及应用

为了建立一种快速的新城疫病毒(NDV)病原检测方法,试验针对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)基因序列保守区域设计1对特异性引物和1条特异性探针,通过构建重组阳性标准质粒的方法建立了检测IBV核酸的荧光定量PCR方法,优化反应体系和反应条件后进行特异性、敏感性、重复性试验。结果表明:该检测方法特异性强,与其他禽源病毒如NDV、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、禽流感病毒(AIV)、马立克病毒(MDV)均不发生交叉反应;该方法可检测到3.1×101拷贝/μL的病毒核酸,比常规RT-PCR的敏感性高100倍;重复性试验的变异系数小于2%。说明研究建立的Real-time RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于IBV的定量检测。     

宠物食品中肉毒杆菌LAMP检测方法的研究

为研究宠物食品中肉毒杆菌环介导恒温扩增(LAMP)检测方法,本试验根据肉毒杆菌特异性基因片段(Ntn H)设计1组引物,应用LMAP技术,通过扩增肉毒杆菌和14种非肉毒杆菌基因片段,对建立的LAMP反应体系进行最佳温度及反应时间筛选试验、采用浊度法和染色法进行特异性试验以及与PCR对比的敏感性试验。结果表明:建立的LAMP反应体系只扩增肉毒杆菌基因,特异性良好;体系最佳反应温度为64℃,最佳反应时间为60 min;最低检测浓度为0.0001 pg/μL,比PCR高出10倍。本试验所建立的方法特异性好、灵敏度高,反应时间短,适用于宠物食品中肉毒杆菌的检测。     

鸡白色念珠菌、传染性支气管炎病毒、新城疫病毒三重PCR检测方法的建立与应用

根椐Gen Bank中已发表的白色念珠菌(CA)、传染性支气管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)基因序列设计并合成三种病原的特异性检测引物,通过三重PCR反应条件的优化,建立了检测三种病原的PCR检测方法。该方法对同一样品中的CA、IBV和NDV核酸模板可同时扩增出231 bp、417 bp和747 bp的特异性片段,检测光滑念珠菌(CG)、克柔念珠菌(CK)、热带念珠菌(CT)、H9亚型禽流感病毒(AIV H9)、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、减蛋综合症病毒(EDSV)等7种禽病病原均为阴性,该方法对CA DNA、IBV c DNA、NDV c DNA的检测最低限度分别为25.0,33.5,36.5 pg,临床样品检测结果表明三重PCR检测方法可以用于这三种病原单独和混合感染的检测和鉴别诊断。说明所建立的三重PCR检测方法具有很好的特异性、敏感性、重复性和临床适用性,为三种病原单独或混合感染的检测和鉴别诊断提供了一种操作简单、检测快速的分子生物学诊断方法。     

副鸡嗜血杆菌16 S rDNA PCR检测方法的建立

根据副鸡嗜血杆菌的16 S rDNA基因序列设计一对特异性引物XZIC1和XZIC2,对6株副鸡嗜血杆菌进行PCR扩增。结果显示,该对引物对6株副鸡嗜血杆菌均扩增出与预期大小相一致的282bp片段,而对鸡毒支原体、禽巴氏杆菌、鸡传染性支气管炎病毒、鸡新城疫病毒、大肠埃希菌、鸡白痢沙门菌、禽流感病毒(H9)、鸡喉气管炎病毒及葡萄球菌等9种病原体的扩增结果均为阴性。该PCR敏感性结果表明,本方法可以检测到10pg的副鸡嗜血杆菌DNA模板。采用引物XZIC1和XZIC2,对分别用副鸡嗜血杆菌ctcc253、ctcc255、ctcc257、ctcc269株感染SPF鸡的临床病料DNA进行PCR扩增,均可扩增出单一的282bp的片段。     

应用PCR检测鸡传染性喉气管炎病毒

根据传染性喉气管炎病毒(ILTV)TK基因序列，设计、合成1对引物，应用PCR技术对ILTV以色列疫苗株、河南分离株（ILTV-CG和ILTV-XY）进行PCR扩增，均能扩增出预期大小的目的片段，测序分析和酶切分析证实了PCR产物的特异性，而对其它禽病原体的扩增均为阴性。PCR检测ILTV DNA的最小检测量为21 pg。应用PCR检测人工接种后不同〖JP2〗天数采集的鸡的结膜拭子，接种后第2~5 d均能检测到ILTV。该方法可用于鸡传染性喉气管炎病的诊断和临诊样品检测。     

荧光定量RT-PCR检测鸡新城疫病毒方法的建立及应用

针对新城疫基因序列保守区域设计1对特异性引物和1条特异性的探针,通过构建重组阳性标准质粒的方法,构建重组质粒作为阳性标准品,建立了检测NDV核酸的荧光定量PCR方法,优化反应体系和条件后进行特异性、敏感性、重复性试验。结果显示,该检测方法特异性强,与其它禽源病毒如鸡传染性支气管炎(IBV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、禽流感病毒(AIV)、马立克氏病毒(MDV)均不发生交叉反应;该方法可检测到3.9×101拷贝/!L的病毒核酸,与常规RT-PCR相比,敏感性高100倍;重复性试验的变异系数小于3%。结果表明,本研究所建立的Real-time RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高、可重复性好,可用于新城疫的定量检测。     

鸡传染性喉气管炎病毒LAMP检测方法的建立

为建立一种快速简单检测鸡传染性喉气管炎病毒的方法,根据已发表的鸡传染性喉气管炎病毒的TK基因序列,设计并合成了6对特异扩增鸡传染性喉气管炎病毒TK基因片段的引物,通过条件优化,成功建立了针对鸡传染性喉气管炎病毒的环介导等温扩增(LAMP)检测法,并测定其特异性和敏感性,并对采集的鸡临床样品的DNA分别进行了检测。结果表明,该法只检出鸡传染性喉气管炎病毒。敏感性扩增结果表明,LAMP检测鸡传染性喉气管炎病毒的最低浓度为100 fg的DNA模板。该LAMP方法有简便、快速和特异性高的优点,可用于临床上对鸡传染性喉气管炎病毒的快速检测。     

H5、H9亚型禽流感病毒和新城疫病毒的多重RT-PCR检测

根据Genbank注册发表的H5、H9亚型禽流感病毒(AIV)的HA基因和新城疫病毒(NDV)的HA基因序列,设计多对引物,每种病毒各筛选出一对特异性好、灵敏度高的引物,其中FP1/FP2扩增H5亚型AIVHA基因片断长为545bp;P3/P4扩增H9亚型AIVHA基因片断长为321bp;P11/P22扩增NDVHA基因片断长为672bp。用RT-PCR方法,通过特异性试验、灵敏度试验,H5、H9亚型AIV和NDV引物的灵敏度分别达到了1:104、1:108、1:104稀释度,与传染性支气管炎(IB)、传染性法氏囊病(IBD)、传染性喉气管炎(ILTV)、传染性鼻炎(IC)、霉形体(MS)、H1N1猪流感等抗原无交叉反应。实验结果表明,本研究建立了检测H5、H9亚型AIV和NDV的多重RT-PCR方法,混合引物的最佳退火温度为50℃,鉴定检测仅需4小时。     

一株鸡传染性喉气管炎病毒的分离鉴定及TK基因分析

黑龙江省牡丹江市某养鸡场28周龄蛋鸡发生以呼吸困难、咳血和产蛋下降为主要症状的疾病。本研究利用特异性引物,从发病鸡喉头及其分泌物中扩增出鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)gB基因的567 bp大小片段;将发病鸡喉头及分泌物处理后接种鸡胚,在鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)上形成痘斑。病毒接种鸡胚肾细胞48 h后电镜下可以观察到典型的疱疹病毒粒子形态,并且该分离株能够与ILTV单克隆抗体发生特异性反应。动物回归试验显示,感染的SPF鸡出现典型ILT症状,并能够从发病鸡体内重新分离到ILTV,由此判定该分离株为ILTV,并将其命名为MDJ0442。根据NCBI登录的ILTV序列(HQ630064)设计引物,以MDJ0442基因组为模板,PCR扩增TK的基因片段,进行测序和序列分析。结果表明,与其他ILTV参考病毒株相比,TK基因的核酸同源性为99.62%。本研究可以为ILTV的流行病学调查和分子生物学研究提供参考。     

应用PCR检测鸡传染性喉气管炎病毒

根据传染性喉气管炎病毒(ILTV)TK基因序列，设计、合成1对引物，应用PCR技术对ILTV以色列疫苗株、河南分离株（ILTV-CG和ILTV-XY）进行PCR扩增，均能扩增出预期大小的目的片段，测序分析和酶切分析证实了PCR产物的特异性，而对其它禽病原体的扩增均为阴性。PCR检测ILTV DNA的最小检测量为21 pg。应用PCR检测人工接种后不同〖JP2〗天数采集的鸡的结膜拭子，接种后第2~5 d均能检测到ILTV。该方法可用于鸡传染性喉气管炎病的诊断和临诊样品检测。     

Ⅰ群禽腺病毒套式PCR检测方法的建立及应用

为了建立一种特异、敏感的Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-Ⅰ)检测方法,根据GenBank中FAdV-Ⅰ不同血清型Hexon基因序列,选择保守区域设计内、外2对特异性检测引物,通过反应条件的优化,建立了FAdV-Ⅰ套式PCR检测方法。结果:该方法能够特异性扩增FADV-Ⅰ,而检测减蛋综合征病毒(EDSV)、鸡痘病毒(APV)、马立克病病毒(MDV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸭瘟病毒(DEV)、H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)、新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)均为阴性;检测下限为10~(2.0) TCID_(50),灵敏度是普通PCR方法的100倍;对3个不同浓度FAdV-Ⅰ的批内重复性检测和批间重复性检测的结果完全一致;相对于病毒分离鉴定方法的符合率为90.91%;用该方法检测91份临床病料样品,共检测出阳性样品58份,其中血清4型、8a型、8b型、11型阳性样品分别为38份、8份、7份、5份。结果说明本试验建立的FAdV-Ⅰ套式PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性、准确性,能够用于FAdV-Ⅰ的临床检测。     

牛传染性鼻气管炎病毒LAMP检测方法的建立

为建立一种利用颜色判定的快速、简单、灵敏度高的检测方法,即可视化环介导等温扩增(LAMP)方法,采用针对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)基因保守序列设计的特异引物,优化反应条件,建立了IBRV LAMP检测方法,并进行了特异性和灵敏性试验。结果显示,所建立的LAMP方法具有良好的特异性,其检出灵敏度为10~3 copies/μL,仅需1 h即可肉眼观察检测结果。结果表明,本试验建立的LAMP方法可用于IBRV的进出口检疫。